基于生物堿和多糖含量探究栽培和野生附子、烏頭的差異

楊 碩，孫美玲，張 荳，宋肖樺，劉 鵬，李 飛，胡慧華*

0 引言

附子為毛莨科植物烏頭AconitumcarmichaeliiDebx.的子根的加工品，辛、甘，有大毒，歸心、腎、脾經(jīng)，具有回陽(yáng)救逆，補(bǔ)火助陽(yáng)，散寒止痛功效[1]。川烏為其干燥母根，辛、苦，熱，有大毒，歸心、肝、腎、脾經(jīng)，具有祛風(fēng)除濕，溫經(jīng)止痛之功[1]。

張仲景最善廣泛使用附子、烏頭，《傷寒雜病論》[2]中含有附子的方有20首，《金匱要略》[3]中含有附子的方有13首，大多用于治療少陰相關(guān)病證，起到鼓舞陽(yáng)氣、補(bǔ)火助陽(yáng)、散寒止痛、通痹利水等作用，如：四逆湯、附子湯、真武湯、麻黃附子湯。經(jīng)查閱《傷寒雜病論》《李濂醫(yī)史》《歷代名醫(yī)蒙求》《南陽(yáng)人物志·古琴記》等相關(guān)文獻(xiàn)可知張仲景為今河南省南陽(yáng)市人，其采藥以及使用的附子應(yīng)該來(lái)自南陽(yáng)附近的山上，前期課題組實(shí)地探訪南陽(yáng)市的張仲景祠，也認(rèn)為其使用的附子可能為南陽(yáng)附近的野生附子[2-6]?，F(xiàn)在使用的附子大多來(lái)源為栽培品種，尤以四川江油產(chǎn)量最大、質(zhì)量最佳，是公認(rèn)的道地栽培區(qū)[7]。

經(jīng)對(duì)《傷寒論》《金匱要略》中附子、烏頭用量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)張仲景使用附子、烏頭是以枚為計(jì)量單位，現(xiàn)在附子、烏頭均使用的是栽培品，完全仿照張仲景方中的附子、烏頭以枚為劑量單位已經(jīng)不適用了，因此，無(wú)法參照《傷寒論》、《金匱要略》中計(jì)量和現(xiàn)在的計(jì)量進(jìn)行對(duì)等換算，對(duì)于如何在臨床上正確掌握附子、烏頭的用量是一個(gè)很重要的問(wèn)題，因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)測(cè)定張仲景使用的南陽(yáng)附子、烏頭和現(xiàn)今使用的江油附子、生川烏生物堿和多糖的含量，為研究張仲景使用的南陽(yáng)附子、烏頭和現(xiàn)今使用的江油栽培附子、生川烏的差異提供依據(jù)，從而進(jìn)一步探究栽培品與野生品的用量，指導(dǎo)臨床用藥。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 SB25-12 DTD型超聲波清洗機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)；Waters2498 Waters高效液相(DAD 檢測(cè)器、自動(dòng)進(jìn)樣器、在線脫氣、四元泵)；BT125D型十萬(wàn)分之一分析天平(Sartorius)；PH902-Ad110型pH計(jì)(泰州市正大科教儀器設(shè)備廠)；18系列紫外分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限公司)。

1.2 試劑 對(duì)照品新烏頭堿(批號(hào)：110798-201106)、烏頭堿(批號(hào)：110720-201111)、次烏頭堿(批號(hào)：110799-201106)、苯甲酰新烏頭原堿(批號(hào)：111795-201002)、苯甲酰烏頭原堿(批號(hào)：111794-201102)、苯甲酰次烏頭原堿標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)：111796-201002)購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；D(+)無(wú)水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品(上海源葉生物科技有限公司，20160913)；氨水(批號(hào)：20160105)、異丙醇(批號(hào)：20150408)、乙酸乙酯(批號(hào)：20150818)、二氯甲烷(批號(hào)：20170320)、乙酸銨(批號(hào)：20150511)、三氯甲烷(批號(hào)：20160511)；蒽酮(批號(hào)：20161208)、濃硫酸(批號(hào)：20171028)、無(wú)水乙醇(批號(hào)：20161028)、丙酮(批號(hào)：20161002)、三氟乙酸(批號(hào)：20160128)購(gòu)于北京化工廠；乙腈(批號(hào)：155758)、四氫呋喃(批號(hào)：163142)購(gòu)于Fisher；冰醋酸(批號(hào)：20141018，天津市光復(fù)儀器廠)。

1.3 藥物 江油生附片(江油中壩附子科技發(fā)展有限公司，批號(hào)分別為20140701、20150701、20160701)；江油生川烏(江油中壩附子科技發(fā)展有限公司，批號(hào)分別為20150912、20160901、20150901)；南陽(yáng)生附子、烏頭(2016年10月采于河南南陽(yáng)，凈制)，經(jīng)中國(guó)食品藥品檢定研究院中藥所張繼主任藥師鑒定為毛茛科植物烏頭AconitumcarmichaeliiDebx.的子根及母根。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用SAS 9.30軟件，數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

2 結(jié)果

2.1 生物堿含量的測(cè)定

2.1.1 色譜條件 采用《中華人民共和國(guó)藥典》法，Eclipse-C18為色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，以乙腈-四氫呋喃(25∶15)為流動(dòng)相A，以0.1 mol/L醋酸銨(每1 000 ml含冰醋酸0.5 ml)為流動(dòng)相B，按表1進(jìn)行梯度洗脫，流速1.0 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)235 nm，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μl[1]。流動(dòng)相梯度洗脫條件見(jiàn)表1。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫條件

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備 取苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、新烏頭堿、次烏頭堿、烏頭堿對(duì)照品各1.89 mg、0.86 mg、0.36 mg、4.52 mg、6.01 mg、1.38 mg，精密稱定，加異丙醇-二氯甲烷(1∶1)混合溶液制混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，即得。分別吸取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液2 ml、1 ml、0.5 ml、0.2 ml、0.1 ml、0.05 ml制成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 采用《中華人民共和國(guó)藥典》法，取南陽(yáng)野生附子、烏頭和江油栽培附子、生川烏每個(gè)樣品各2份，適量，粉碎，過(guò)三號(hào)篩，各取約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入氨試液3 ml，再精密加入異丙醇-乙酸乙酯(1∶1)混合溶液50 ml，稱定重量，超聲處理(功率400 W，頻率40 kHz，水溫在25 ℃以下)30 min，放至室溫，再稱定重量，加異丙醇-乙酸乙酯(1∶1)混合溶液補(bǔ)足減失重量，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液25 ml，40 ℃以下回收溶劑至干，精密加入異丙醇-二氯甲烷(1∶1)3 ml溶解殘?jiān)^(guò)0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液作為供試液[1]。

2.1.4 含量測(cè)定 分別吸取苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、新烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿對(duì)照品溶液10 μl，注入高效液相中，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(見(jiàn)表2)，分別吸取每個(gè)供試品的溶液10 μl連續(xù)進(jìn)樣2次注入高效液相中，計(jì)算含量(表3、表4)。

表2 6種生物堿對(duì)照品溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線

表3 附子、生川烏、烏頭中6種酯型生物堿的含量平均值(n=4,g/g)

表4 附子、生川烏、烏頭中單、雙酯和總酯型生物堿含量的平均值(n=4,g/g)

2.2 多糖含量的測(cè)定

2.2.1 供試品溶液的制備 取南陽(yáng)野生附子、烏頭和江油栽培附子、生川烏各精密稱取1 g。加入10 ml 95%乙醇水回流提取2次，每次2 h，棄去乙醇液，藥渣揮干乙醇，加入40 ml純水于90 ℃恒溫水浴鍋中浸提2次，每次2 h，濾過(guò)，濾液濃縮至一定體積，加95%乙醇水使含醇量為80%，4 ℃冰箱中靜置48 h，沉淀依次用乙醚、丙酮、無(wú)水乙醇洗滌2次，得粗多糖，將粗多糖溶于水，加水定容至250 ml，作為供試品溶液[8]。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密吸取濃度為 0.019 8 mg/ml葡萄糖對(duì)照品溶液 0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 ml，分別置于6支干燥的具塞刻度試管中，各加純水補(bǔ)至2.0 ml，緩緩加入新鮮配制的0.2%硫酸-蒽酮試劑8.0 ml，搖勻，沸水浴10 min，取出，冰水浴冷卻，放置10 min，以相應(yīng)試劑為空白，于592 nm處測(cè)定吸光度，以對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程 y=147.490 1 x-0.037 22，r=0.999 1。結(jié)果表明，葡萄糖在0.001 98～0.019 8 mg/ml內(nèi)，線性關(guān)系良好。

2.2.3 方法學(xué)考察

2.2.3.1 最大吸光度的確定及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 見(jiàn)圖1、圖2。

圖1 最大吸光度的確定

圖2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

2.2.3.2 精密度試驗(yàn) 取1.98 mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法測(cè)定多糖含量，重復(fù)6次。計(jì)算多糖含量分別為0.849 0%、0.855 7%、0.855 8%、0.855 8%、0.849 0%、0.849 0%，結(jié)果顯示，RSD為0.62%，該方法精密度良好。

2.2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取江油生川烏0.48 g，按“2.2.1”項(xiàng)下方法操作制備6份供試品溶液,按“2.2.2”項(xiàng)下方法測(cè)定多糖含量。計(jì)算多糖含量分別為3.513 6%、3.506 8%、3.506 8%、3.513 5%、3.506 8%、3.506 8%，結(jié)果顯示，RSD為0.11%，該方法重復(fù)性良好。

2.2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取南陽(yáng)生附子0.46 g，精密稱定，按“2.2.1”項(xiàng)下方法操作制備供試品溶液，按“2.2.2”項(xiàng)下方法測(cè)定多糖含量，每4 小時(shí)測(cè)定1次，計(jì)算多糖含量分別為3.398 3%、3.384 8%、3.242 4%、3.357 6%、3.439 0%、3.506 8%，結(jié)果顯示，RSD為2.29%，樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.4 附子多糖含量測(cè)定 精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下各供試品溶液1 ml于具塞試管中，按“2.2.2”項(xiàng)下方法顯色并測(cè)定吸光度，計(jì)算多糖含量(見(jiàn)表5)。

表5 附子、生川烏、烏頭的多糖含量(g/g)

3 討論

通過(guò)表4對(duì)比發(fā)現(xiàn)，南陽(yáng)野生附子和烏頭的單酯、雙酯和總酯型生物堿顯著均高于江油栽培附子和生川烏。雙酯型生物堿含量上，江油附子和生川烏相差3倍，南陽(yáng)附子和烏頭相差6倍，這或許是張仲景在臨床上區(qū)分使用附子和烏頭發(fā)揮不同功效的原因。通過(guò)表5對(duì)比發(fā)現(xiàn)，南陽(yáng)野生附子多糖含量與江油栽培附子差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是江油生川烏(栽培烏頭)多糖含量顯著高于南陽(yáng)野生烏頭。附子、生川烏、烏頭的多糖含量高低依次是：江油生川烏>江油生附片>南陽(yáng)生附子>南陽(yáng)烏頭。

生物堿和多糖均為附子的有效成分，具有調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤、保護(hù)心肌缺血、降低膽固醇、強(qiáng)心、抗炎、鎮(zhèn)痛等藥理作用[9-10]，研究顯示，現(xiàn)今使用的江油栽培附子、生川烏和張仲景使用的南陽(yáng)野生附子、烏頭均含有6種單、雙酯型生物堿和多糖，只是在生物堿和多糖的含量上相差很大，說(shuō)明其在療效方面存在強(qiáng)弱之分。

現(xiàn)今臨床均是以栽培品代替野生品來(lái)配付張仲景經(jīng)方顯然是可行的，但在使用中要多總結(jié)栽培品的療效滿意度，確定一個(gè)合適的使用量，而不是完全按照經(jīng)方的劑量使用，這樣既可以保證經(jīng)方的繼續(xù)使用，也可以保證栽培烏頭和附子的事業(yè)持續(xù)發(fā)展。因此，還需要進(jìn)一步加強(qiáng)對(duì)栽培品和野生品的差異性研究，從而指導(dǎo)臨床用藥。