不同類型宮頸癌人乳頭瘤病毒高危亞型與相關(guān)蛋白表達(dá)分析

陳 晨 王浩淵

1.廣東省江門市中心醫(yī)院腫瘤科，廣東江門 529030；2.廣東省江門市中心醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，廣東江門 529030

宮頸癌是嚴(yán)重威脅女性身體健康與生命安全的婦科惡性腫瘤之一，近年來發(fā)病率呈現(xiàn)年輕化和上升趨勢[1]。宮頸癌病理分類主要包括鱗癌和腺癌，其中以鱗癌最為常見，約占90%，腺癌約占5%[2]，但由于腺癌臨床預(yù)后明顯低于鱗癌，故進(jìn)一步明確宮頸鱗癌及腺癌的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制對明確宮頸癌發(fā)病機(jī)理、指導(dǎo)臨床干預(yù)均有重要的意義和作用。人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）感染其病毒 DNA 能夠同宮頸上皮細(xì)胞DNA整合，激發(fā)自身的免疫系統(tǒng)，對病毒進(jìn)行清除，但同時也引發(fā)局部的上皮損傷，引起宿主細(xì)胞的增殖異常，引起鱗狀上皮內(nèi)病變，增加宮頸癌的發(fā)生概率[3-4]。HPV不同亞型其致病能力有差異，其中高危型HPV在宮頸癌的形成及發(fā)展發(fā)揮重要作用[5]。但由于目前宮頸癌發(fā)生機(jī)制尚未完全明確，且不同類型宮頸癌與HPV高危亞型的關(guān)系仍處于研究探索階段，進(jìn)一步觀察不同類型宮頸癌中HPV高危亞型的分布特征及其相關(guān)蛋白表達(dá)的差異，對進(jìn)一步明確不同類型宮頸癌發(fā)生機(jī)制及指導(dǎo)基礎(chǔ)實驗的開展具有重要的意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年1月至2020年2月于江門市中心醫(yī)院確診的宮頸癌合并高危型HPV感染患者120例為研究對象。其中年齡26～68歲，平均（50.35±4.46）歲；病理類型：腺癌34例，鱗癌86例；國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（International Federation of Gynecology and Obstetrics，F(xiàn)IGO）分期：Ⅰ～Ⅱ期88例，Ⅲ～Ⅳ期32例；組織學(xué)分級：Ⅰ級14例，Ⅱ級29例，Ⅲ級77例；病程1～4年，平均（1.89±0.58）年。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①初診為宮頸癌且擇期手術(shù)；②均行術(shù)中病理檢查確診；③均行HPV檢測且HPV亞型均為高危型；④無其他婦科傳染性疾??；⑤無其他臟器原發(fā)性腫瘤；⑥所有患者及其家屬均知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：①臨床資料不全者；②入組前行相關(guān)治療者。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 宮頸分泌物HPV病毒檢測 術(shù)中以窺器暴露子宮頸，擦凈子宮頸口分泌物，使用專用刷插入子宮頸口旋轉(zhuǎn)3周，收集宮頸口及頸管脫落上皮細(xì)胞，收集完畢后即刻送檢。第二代雜交捕獲技術(shù)（hybrid capture，HC2）分析HPV亞型，所有操作均由同一檢驗師完成，結(jié)果判定，HPV相對光單位（relative light unit，RLU）>0.8～1.0即判定為陽性，通過HC2高危型HPV檢測技術(shù)篩查HPV高危亞型，包括HPV l6、18、31、33、35、45、51、52、56、58 型和 HPV 61 型等[6]。

1.2.2 癌組織病理類型檢測 所有患者于術(shù)中收集宮頸癌組織和癌旁組織，腫瘤組織離體后半小時內(nèi)于腫瘤組織縱切面的非壞死區(qū)域采集標(biāo)本，癌旁組織于腫瘤組織邊緣5 cm處采集，離體后均經(jīng)焦碳酸二乙酯水清洗，送快速病理與免疫組化檢測。

1.2.3 蛋白免疫組化檢測 采用SP法對宮頸癌組織和癌旁組織進(jìn)行免疫組化染色，相關(guān)試劑均購自Abcam公司，相關(guān)操作均由同一組醫(yī)師進(jìn)行，具體步驟參照試劑盒說明。選取宮頸鱗癌與腺癌中占比最高的HPV高危亞型進(jìn)行蛋白染色結(jié)果分析，目標(biāo)蛋白包括 E6、E7、P53 和 Rb 蛋白，E6、E7 蛋白陽性判定以試劑盒內(nèi)相應(yīng)的蛋白陽性模板為準(zhǔn)，P53和Rb蛋白采用二級計分法，染色強(qiáng)度得分為0、1、2、3。陽性細(xì)胞百分比≤10%、11%～50%、51%～75%、≥76%分別對應(yīng)得分 1、2、3、4，半定量標(biāo)準(zhǔn)=細(xì)胞的染色強(qiáng)度×陽性細(xì)胞的百分比，陰性值為0～3，陽性值為>3[7]。

1.3 觀察指標(biāo)

①宮頸癌不同病理類型的臨床特征分布；②宮頸癌不同病理類型下HPV高危亞型表達(dá)情況；③宮頸癌不同病理類型E6、E7、P53和Rb蛋白表達(dá)情況；④HPV高危亞型與E6、E7、P53和Rb蛋白表達(dá)的相關(guān)性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗或Fisher精確檢驗；亞型與蛋白表達(dá)的相關(guān)性采用Spearman相關(guān)性分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 宮頸癌不同病理類型的臨床特征分布

病理學(xué)結(jié)果顯示，120例宮頸癌患者腺癌34例，鱗癌86例，宮頸癌不同病理類型下年齡、卡氏評分、FIGO分期、組織學(xué)分級和病灶大小等臨床特征分布比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）（表 1）。

表1 宮頸癌不同病理類型的臨床特征分布（例）

2.2 宮頸癌不同病理類型患者HPV高危表型分布

宮頸腺癌以HPV 18亞型為主，占64.71%，其中單一感染27例，多重感染7例，多重感染率為20.59%；宮頸鱗癌以HPV 16亞型為主，占62.79%，其中單一感染81例，多重感染5例，多重感染率為5.81%。宮頸腺癌的HPV 18亞型占比高于鱗癌，HPV 16亞型占比低于鱗癌，且宮頸腺癌的多重感染率高于鱗癌，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（表2）。宮頸鱗癌及腺癌患者中均無HPV 31型、HPV 35型、HPV 51型。

表2 宮頸癌不同病理類型患者HPV高危表型分布[n（%）]

2.3 宮頸癌不同病理類型E6、E7、P53和Rb蛋白陽性表達(dá)率的比較

蛋白免疫組化檢測結(jié)果顯示，宮頸腺癌和鱗癌E6蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；而宮頸腺癌E7蛋白表達(dá)高于宮頸鱗癌，P53和Rb蛋白表達(dá)低于宮頸鱗癌，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（表 3）。

表3 宮頸癌不同病理類型E6、E7、P53和Rb蛋白陽性表達(dá)率的比較[n（%）]

2.4 宮頸癌患者 HPV 16、HPV 18 亞型與 E6、E7、P53和Rb蛋白表達(dá)的相關(guān)性分析

結(jié)果顯示，宮頸癌患者HPV 16亞型、HPV 18亞型與E6、E7、P53和Rb蛋白陽性表達(dá)均呈正相關(guān)（P＜0.05）（表 4）。

表4 宮頸癌患者HPV 16、HPV 18亞型與E6、E7、P53和Rb蛋白表達(dá)的相關(guān)性分析

3 討論

現(xiàn)已證實，HPV感染是宮頸上皮內(nèi)瘤變、宮頸癌發(fā)生的關(guān)鍵因素，高危型HPV持續(xù)感染在宮頸癌及癌前病變發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色[8]。宮頸癌患者HPV感染率較高，已被臨床廣泛重視，且隨著檢測技術(shù)的提高，HPV分型的篩查和診斷廣泛應(yīng)用于臨床，為宮頸癌發(fā)生和進(jìn)展機(jī)制的分析以及臨床治療提供了基礎(chǔ)理論和指導(dǎo)。

現(xiàn)國內(nèi)外學(xué)者均證實，宮頸癌的發(fā)生與高危HPV感染密切相關(guān)，且尤以HPV 16型和HPV 18型感染為主[9-10]。研究顯示[11]，HPV 16型和HPV 18型占比約為78%，HPV 16型高于HPV 18型，多重感染約為13%。本研究結(jié)果顯示，120例合并高危HPV感染的宮頸癌患者中HPV 16型占比57.5%，HPV 18型占比30.83%，且多種感染率為10%，與上述研究數(shù)據(jù)基本一致。此外，本研究通過對不同病理類型宮頸癌進(jìn)行對比分析結(jié)果顯示，宮頸腺癌的HPV 18亞型占比高于鱗癌，HPV 16亞型占比低于鱗癌，且宮頸腺癌的多重感染率高于鱗癌（P＜0.05），此差異可能影響患者病情進(jìn)展與預(yù)后狀態(tài)。

國外學(xué)者Clifford等[12]報道宮頸鱗癌以HPV 16感染為主，而宮頸腺癌以HPV 18為主。張玲等[13]對我國52例宮頸腺癌HPV檢測顯示宮頸管型腺癌及子宮內(nèi)膜樣腺癌中HPV l6/18的感染率均較高，在宮頸腺癌中HPV 16及HPV 18的感染率大致相當(dāng)。本研究中宮頸腺癌以HPV 18亞型為主（64.71%），宮頸鱗癌以HPV 16亞型為主（62.79%），與Clifford等研究結(jié)論基本一致，此外，本研究中宮頸腺癌HPV 16亞型和HPV 18亞型感染率分別為41.18%和64.71%，與張玲研究中宮頸腺癌中HPV16及HPV18的感染率大致相當(dāng)結(jié)論大致相符。現(xiàn)臨床證實，宮頸腺癌預(yù)后狀態(tài)較宮頸鱗癌差，相關(guān)機(jī)制尚未完全明確[14]，根據(jù)本研究HPV 16及HPV 18亞型分布可以推測HPV 18型感染不僅與腺癌的發(fā)生有關(guān)，可能影響病情的進(jìn)展和預(yù)后。

E6和E7為HP基因早期區(qū)E中重要的非結(jié)構(gòu)蛋白，在細(xì)胞永生化和惡性轉(zhuǎn)化中起到關(guān)鍵性作用，抑癌蛋白P53和磷酸化的Rb蛋白則是二者分別對應(yīng)的接合位點，使后者失活引起細(xì)胞永生化，促進(jìn)細(xì)胞的惡性進(jìn)展[15-16]。E6蛋白結(jié)合P53并通過多種作用機(jī)制使P53失活，不僅抑制P53蛋白表達(dá)，并且引起細(xì)胞G1/S檢測點失活，使細(xì)胞周期失控，引起細(xì)胞永生化[17]。E7蛋白與Rb蛋白結(jié)合，激活轉(zhuǎn)錄因子E2F導(dǎo)致Rb-E2F復(fù)合體解離，使其凋亡作用減弱或喪失，促進(jìn)惡性細(xì)胞的發(fā)生與發(fā)展[18]。本研究中120例宮頸癌患者E6、E7蛋白表達(dá)水平均較高，P53和Rb蛋白相對較低，對不同病理類型的宮頸癌患者進(jìn)行對比分析發(fā)現(xiàn)，宮頸腺癌和宮頸鱗癌E6蛋白均呈高表達(dá)，但二者無顯著差異（P＞0.05）；而宮頸腺癌E7蛋白表達(dá)高于宮頸鱗癌，P53和Rb蛋白表達(dá)低于宮頸鱗癌，不同病理類型比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。P53和Rb蛋白表達(dá)與E6、E7蛋白表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，E6、E7致癌蛋白分別與P53和Rb蛋白結(jié)合，導(dǎo)致二者含量和表達(dá)水平下調(diào)，且在宮頸腺癌中E7表達(dá)水平高于宮頸鱗癌，有研究顯示[19]，E7表達(dá)可明顯增加E6介導(dǎo)人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（human telomerase reverse transcriptase，hTERT）轉(zhuǎn)錄能力，提示 E6 介導(dǎo)hTERT轉(zhuǎn)錄可能受到E7表達(dá)的限制和影響，而E7和hTERT在細(xì)胞永生化機(jī)制中具有協(xié)同作用。本研究Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示，宮頸癌患者HPV 16亞型、HPV 18亞型與E6、E7、P53和Rb蛋白陽性表達(dá)均為正相關(guān)（P＜0.05），且宮頸癌患者HPV 16亞型和HPV 18亞型與E7相關(guān)性系數(shù)存在顯著差異（P＜0.05），表明E6和E7的高共表達(dá)率可能是宮頸腺癌預(yù)后不良的重要因素。

綜上所述，宮頸鱗癌高危HPV亞型以HPV 16型為主，宮頸腺癌高危HPV亞型以HPV 18型為主，且宮頸鱗癌和腺癌E7、P53和Rb蛋白陽性表達(dá)存在較大差異，宮頸腺癌較高多重感染率和E6、E7較高的共表達(dá)率可能是影響預(yù)后不良的重要因素，值得進(jìn)一步研究探討。