血清SFRP5、IL-13及MPO在急性哮喘發(fā)作患兒中的表達(dá)及相關(guān)性分析

徐曉蓬，袁伯穩(wěn)，季鳳華

哮喘是臨床常見(jiàn)的呼吸道慢性疾病，目前對(duì)其發(fā)病機(jī)制尚無(wú)明確闡述，臨床主要癥狀為反復(fù)咳嗽、喘息、氣促等，多發(fā)生在早晨或夜間[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球目前有超過(guò)1 億哮喘患者，而國(guó)內(nèi)哮喘患病率約占1%，其中兒童可達(dá)到2%～7%，且大多數(shù)兒童成年后哮喘仍存在，因此及早防治兒童哮喘具有重要意義[2]。哮喘是一種呼吸道慢性炎癥，主要特征是氣道痙攣和氣道高反應(yīng)性，故檢測(cè)氣道炎癥對(duì)其診斷、治療及預(yù)后評(píng)估具有重要作用。分泌型卷曲相關(guān)蛋白5（secreted frizzled - related protein5,SFRP5）是源自脂肪細(xì)胞的抗炎因子，可通過(guò)Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路介導(dǎo)炎性因子低表達(dá)發(fā)揮抗炎作用[3]。研究顯示，“細(xì)胞炎性因子網(wǎng)絡(luò)失衡”參與哮喘患兒發(fā)病發(fā)展重要過(guò)程，白細(xì)胞介素13（inter‐leukin-13，IL-13）及過(guò)氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）是重要炎性因子，可能參與急性哮喘發(fā)作[4]。國(guó)外研究發(fā)現(xiàn)IL-3 和MPO 在變態(tài)反應(yīng)和炎癥性疾病方面發(fā)揮重要作用[5]。目前血清SFRP5、IL-13 及MPO 在急性哮喘發(fā)作患兒中關(guān)系尚不清楚，因此本研究重點(diǎn)探究血清SFRP5、IL-13 及MPO 在哮喘患兒急性發(fā)作期中的表達(dá)及相關(guān)性，為提高哮喘患兒急性發(fā)作期的防治提供可靠資料。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2018 年5 月至2020 年5 月海安市人民醫(yī)院兒科收治的哮喘患兒98 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南（2016年版）》[6]中診斷標(biāo)準(zhǔn)，急性發(fā)作期為長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)發(fā)生不同程度喘息、氣急或胸悶，或在雙肺可聞及散在或彌性，以呼氣相為主的哮鳴音；緩解期為癥狀體征消失，1 秒用力呼氣量或最大呼氣流速在80% 預(yù)計(jì)值及以上，持續(xù)1個(gè)月以上；②年齡5～12歲，且為初診。排除標(biāo)準(zhǔn)：①急性感染，或嚴(yán)重免疫缺陷；②合并血液系統(tǒng)疾病；③患有惡性腫瘤；④近1 個(gè)月使用免疫抑制劑或激素治療。根據(jù)病情分為急性組（47 例）和緩解組（51 例），急性組男25 例，女22例，年齡5～12（7.92±2.68）歲；緩解組男27例，女24例，年齡5～12（8.02±2.55）歲。選擇同期健康兒童45 例作為對(duì)照組，均無(wú)哮喘和其他過(guò)敏性疾病，近3 個(gè)月未出現(xiàn)感染情況；男23 例，女22 例，年齡5～12（7.75±2.43）歲。又根據(jù)急性發(fā)作期病情嚴(yán)重程度[6]分為輕度急性組（25 例）和中重度急性組（22例），具體分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：輕度急性：步行氣短，可平臥，無(wú)出汗，呼吸頻率輕度增加，無(wú)輔助呼吸肌活動(dòng)及三凹征，心率＜100/min，哮鳴音散在/呼吸末期，奇脈/深吸氣時(shí)收縮壓下降＜10 mmHg 氧分壓正常，二氧化碳分壓＜45 mmHg，氧飽和度＞95%。中重度急性：輕微活動(dòng)/休息時(shí)氣短，多坐位/端坐呼吸，有出汗/大汗淋漓，呼吸頻率增加/超過(guò)30/min，心率在100～120/min及以上，有輔助呼吸肌活動(dòng)及三凹征，哮鳴音彌漫、響亮，奇脈/深吸氣時(shí)收縮壓下降10～2510 mmHg 及 以 上，氧 分 壓＞60 mmHg 或＜60 mmHg，二氧化碳分壓＜45 mmHg或＞45 mmHg，氧飽和度在91%～95%或＜90%。

1.2 方法 ①血清SFRP5、IL-13 檢測(cè)：采集各組清晨空腹靜脈血3 mL，通過(guò)枸櫞酸鈉抗凝處理，送至檢驗(yàn)科離心，并置于零下80 ℃保存。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)SFRP5、IL-13 水平，將對(duì)應(yīng)一抗稀釋至10 mg/L，置于96 孔板（北京希凱恩生物科技有限公司）中，在4 ℃條件下過(guò)夜，將血清置于96 孔板中，在37 ℃條件下孵育60 min；加入新配置對(duì)應(yīng)二抗0.1 mL 孵育60 min；加3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺底物溶液（上海研拓生物科技有限公司）0.1 mL，顯色20 min，加2 mol/L 硫酸（石家莊豐民貿(mào)易有限公司）0.05 mL結(jié)束反應(yīng)，在波長(zhǎng)450 nm處檢測(cè)各孔吸光度值。②血清MPO 檢測(cè)：采集各組清晨空腹靜脈血3 mL，置于試管，靜置15 min，送至檢驗(yàn)科離心，置于零下20 ℃保存。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)MPO 水平，均嚴(yán)格按照試劑盒（德國(guó)IBL）說(shuō)明書(shū)操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS20.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件。計(jì)量資料符合正態(tài)分布，采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用F檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)（%）表示，計(jì)數(shù)資料組間比較采用卡方檢驗(yàn)，相關(guān)性采用Pearson 分析。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 急性組和對(duì)照組SFRP5、ⅠL-13 及MPO 水平比較 急性組SFRP5 水平低于對(duì)照組，IL-13 及MPO 水平高于對(duì)照組，差異比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表1。

表1 急性組和對(duì)照組SFRP5、IL-13及MPO水平比較（±s）

表1 急性組和對(duì)照組SFRP5、IL-13及MPO水平比較（±s）

t SFRP5：32.248，P ＜0.001；t ⅠL-13：13.599，P ＜0.001；t MPO：35.314，P ＜0.001

組別急性組（n=47）對(duì)照組（n=45）SFRP5（μg/L）6.49±0.91 13.52±1.17ⅠL-13（ng/L）184.01±78.14 23.94±11.44679.72±33.46 MPO（U/L）878.63±18.87

2.2 急性組與緩解組SFRP5、ⅠL-13 及MPO 水平比較 急性組SFRP5 水平低于緩解組，IL-13 及MPO水平高于緩解組，差異比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 急性組與緩解組SFRP5、IL-13及MPO水平比較（±s）

表2 急性組與緩解組SFRP5、IL-13及MPO水平比較（±s）

t SFRP5：15.655，P ＜0.001；t ⅠL-13：10.883，P ＜0.001；t MPO：46.611，P ＜0.001

組別急性組（n=47）緩解組（n=51）SFRP5（μg/L）6.49±0.91 9.88±1.20ⅠL-13（ng/L）184.01±78.14 58.03±25.97 MPO（U/L）878.63±18.87 703.27±18.36

2.3 急性發(fā)作期病情不同程度之間SFRP5、ⅠL-13及MPO 水平比較 中重度急性組SFRP5 水平低于輕度急性組，IL-13 及MPO 水平高于輕度急性組，差異比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表3。

表3 急性發(fā)作期病情不同程度之間SFRP5、IL-13及MPO水平比較（±s）

表3 急性發(fā)作期病情不同程度之間SFRP5、IL-13及MPO水平比較（±s）

t SFRP5：9.059，P ＜0.001；t ⅠL-13：2.102，P ＜0.001；t MPO：4.152，P ＜0.001

組別輕度急性組（n=25）中重度急性組（n=22）SFRP5（μg/L）7.45±0.90 5.48±0.51ⅠL-13（ng/L）160.23±80.23 208.17±75.34 MPO（U/L）865.33±22.34 891.33±20.32

2.4 急性組SFRP5 與ⅠL-13、MPO 水平及病情嚴(yán)重程度相關(guān)性比較 急性組SFRP5 與IL-13、MPO 水平呈負(fù)相關(guān)（r=-0.356，-0.425，P＜0.05,P＜0.05），與病情嚴(yán)重程度呈正相關(guān)（r=0.647，P＜0.05），圖1。

圖1 急性哮喘患兒SFRP5與IL-13、MPO水平及病情嚴(yán)重程度的關(guān)系

3 討論

研究證實(shí)，哮喘多由免疫系統(tǒng)損傷導(dǎo)致，細(xì)胞因子類(lèi)別決定著哮喘的發(fā)生和發(fā)展[7]。相關(guān)研究顯示，炎癥參與氣道炎癥發(fā)生與發(fā)展，同時(shí)也決定了肺功能轉(zhuǎn)歸情況，SFRP5、IL-13 及MPO 三者均參與了哮喘發(fā)病過(guò)程[8-9]。 SFRP5 屬于SFRP 家族，SFRP5 基因位于人染色體10q24.1，伴有一個(gè)細(xì)胞外富含半胱氨酸結(jié)構(gòu)域，與Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路跨膜受體卷曲蛋白的半胱氨酸結(jié)構(gòu)域存在同源性，與跨膜受體卷曲蛋白競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合Wnt配體，從而發(fā)揮阻礙Wnt 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通作用[10-11]。Wnt 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)能夠介導(dǎo)T細(xì)胞、B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞分化，參與機(jī)體免疫應(yīng)答[12-13]。SFRP5在脂肪和肺等組織中分布較廣，可阻礙脂肪組織中巨噬細(xì)胞分泌（如IL-13等）起到抗炎作用。研究顯示，通過(guò)檢測(cè)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者SFRP5水平得出，SFRP5可降低非經(jīng)典Wnt 通路的下游靶點(diǎn)c-Jun 氨基末端激酶-1，阻礙白細(xì)胞介素6 釋放，說(shuō)明SFRP5 基因沉寂可激活c-Jun 氨基末端激酶-1，增加炎性因子水平，SFRP5抑制Wnt 通路的下游靶點(diǎn)c-Jun 氨基末端激酶-1 信號(hào)通路，從而發(fā)生炎癥反應(yīng)[13-14]。本研究結(jié)果表示，急性組SFRP5水平低于緩解組和對(duì)照組，且中重度急性組SFRP5水平低于輕度急性組，提示哮喘急性發(fā)作期患兒血清SFRP5水平較低，且與其病情嚴(yán)重程度存在顯著關(guān)系。

IL-13源自活化TH2細(xì)胞，誘發(fā)氣道高反應(yīng)性是通過(guò)刺激嘈酸性粒細(xì)胞加速白介素1β 轉(zhuǎn)化酶分泌完成，從而導(dǎo)致哮喘患兒氣道炎癥發(fā)生；同時(shí)IL-13還能直接作用于成纖維細(xì)胞，導(dǎo)致氣道狹窄和呼吸道重塑[15-16]。研究顯示，在小鼠哮喘模型中注入IL-13抗體，發(fā)現(xiàn)氣道炎癥顯著減少，小鼠哮喘癥狀明顯減輕[17-18]。本研究結(jié)果表示，急性組IL-13水平高于對(duì)照組和緩解組；同時(shí)中重度急性組IL-3水平高于輕度急性組。說(shuō)明IL-13 參與急性哮喘發(fā)作，哮喘患兒在緩解期呼吸道炎癥仍存在，且與急性發(fā)作病情嚴(yán)重程度有關(guān)。MPO源自單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及某些組織中巨噬細(xì)胞的血紅素蛋白酶，隸屬血紅素過(guò)氧化物酶超家族，在多種疾病發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色。MPO 活性反映了其浸潤(rùn)數(shù)目和活性，其水平表達(dá)和活性也反映了嗜中性多形核白細(xì)胞功能和活性狀態(tài)，被臨床用作評(píng)估炎癥嚴(yán)重程度重要指標(biāo)[19-20]。本研究結(jié)果表示，急性組MPO 水平高于對(duì)照組和緩解組，中重度急性組MPO水平高于輕度急性組。提示MPO參與急性哮喘發(fā)作，且在中重度急性哮喘發(fā)作患兒中水平更高，因此檢測(cè)MPO水平有利于保護(hù)易感人群，同時(shí)也便于急性哮喘發(fā)作防治。經(jīng)Pearson 相關(guān)分析得出，急性組SFRP5與IL-13、MPO水平呈負(fù)相關(guān)，與病情嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。說(shuō)明SFRP5、IL-13 和MPO 參與急性哮喘發(fā)作過(guò)程，SFRP5 與IL-13、MPO 相互影響，參與哮喘病理生理變化，與細(xì)胞因子研究中“因子網(wǎng)絡(luò)失衡”在參與哮喘發(fā)生發(fā)展重要過(guò)程結(jié)果相似。因此動(dòng)態(tài)檢測(cè)SFRP5、IL-13和MPO水平，有利于急性哮喘發(fā)作病情評(píng)估和預(yù)后評(píng)估，為阻斷IL-13 和MPO 產(chǎn)生途徑，治療哮喘提供新思路。

綜上所述，急性哮喘發(fā)作患兒血清SFRP5水平降低，IL-13 及MPO 水平升高，血清SFRP5 水平與IL-13、MPO 水平及急性發(fā)作期嚴(yán)重程度顯著相關(guān)。本研究不足之處在于為單中心研究，后續(xù)會(huì)進(jìn)行多中心深入研究。