HPK1在腫瘤和免疫中的研究進展

褚玉平，晁 旭，唐海龍，賈雙雙，劉 驍，高廣勛

造血祖細胞激酶1 （hematopoietic progenitor kinase 1，HPK1）是有絲分裂原激活蛋白激酶（mito‐gen - activated protein kinase kinase kinase kinase，MAP4K）家族成員之一，是一組催化蛋白質(zhì)中絲氨酸或蘇氨酸殘基磷酸化的激酶。MAP4K 家族激酶包括MAP4K1/HPK1、MAP4K2/GCK、MAP4K3/GLK、MAP4K4/HGK、MAP4K5/KHS 和MAP4K6/mink 等，與哺乳動物ste20 絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族同源。MAP4K家族激酶具有高度相似的蛋白質(zhì)結(jié)構，在調(diào)節(jié)細胞存活、細胞遷移、細胞凋亡和自噬中發(fā)揮重要作用[1]。HPK1參與多種細胞信號級聯(lián)反應，包括抗原受體信號、細胞凋亡、生長因子信號和細胞因子信號調(diào)控。本文將以HPK1 蛋白結(jié)構為基礎,重點介紹其在疾病病理過程中的調(diào)控作用。

1 HPK1蛋白的分子結(jié)構、分布與表達

1.1 HPK1 蛋白的分子結(jié)構 HPK1 由N 端的ste20樣激酶結(jié)構域、4 個富含脯氨酸基序，分別為P1、P2、P3 和P4 的中心結(jié)構域和遠端Citron 同源結(jié)構域組成。HPK1 中心結(jié)構域包含caspase-3 裂解位點，caspase-3 激活受到嚴格控制，與單核細胞分化有關[2]。脯氨酸基序能夠結(jié)合含有SH3結(jié)構域的蛋白，如Grb2 和Gads[3]。全長HPK1 在造血細胞中可同時活化JNK和NFkB通路并與多種接頭蛋白相互作用；但在凋亡細胞中，HPK1 在DDVD 基序（cas‐pase-3識別位點）處被裂解為N末端（HPK1-N）結(jié)構域與C 末端（HPK1-C）結(jié)構域，HPK1-C 結(jié)構域?qū)F-kB 通路有抑制作用，而HPK1-N 結(jié)構域保留了激活JNK的能力，但不能結(jié)合接頭蛋白[4]。

圖1 HPK1的結(jié)構圖

1.2 HPK1蛋白分布與表達 研究表明，HPK1在骨髓、胎肝、淋巴結(jié)、胎盤、脾臟和胸腺中高表達，在肺、腎、乳腺和小腸中低表達。HPK1在大腦、心臟、肝臟、肌肉、胰腺、前列腺、睪丸和甲狀腺等器官中幾乎沒有表達[5]。值得注意的是HPK1 表達于所有類型的造血細胞和免疫細胞，如造血祖細胞（包括早期造血祖細胞）、巨噬細胞、樹突狀細胞、中性粒細胞、單核細胞和肥大細胞，特別是T 細胞（包括原始CD4+T 細胞、記憶CD4+T 細胞和CD8+T 細胞）、B細胞和NK細胞等[6]。

2 HPK1的生物學功能

2.1 HPK1調(diào)控細胞功能HPK1是T細胞和B細胞激活的負性調(diào)節(jié)因子。其負性調(diào)節(jié)主要通過二聚體的形成和廣泛的分子內(nèi)及分子間重塑來進行[7]。但HPK1缺乏并不影響T細胞和B細胞的發(fā)育[8]。

2.1.1 HPK1 負性調(diào)控T 細胞功能HPK1是T細胞受體（T cell receptors，TCR）誘導T細胞活化的負性調(diào)節(jié)因子。HPK1激酶功能的降低與T 細胞激活水平的升高密切相關，表現(xiàn)為T 細胞增殖能力增強以及持續(xù)的TCR誘導的鈣流動和促炎細胞因子，如IL-2、TNF 水平的持續(xù)升高[9]。在腫瘤的臨床前模型研究中，降低HPK1 激酶活性可增強T 細胞抗腫瘤能力[10]，人和小鼠腫瘤中HPK1表達升高與T細胞耗竭呈正相關[11]。因此，抑制HPK1活性可以抑制T細胞耗竭。HPK1 激酶完全激活需要Thr165 和Ser171殘基磷酸化，Ser171殘基可以在TCR激活后以依賴于PKD1 的方式被磷酸化，Thr165 殘基在TCR 激活后可能是一個自動磷酸化位點[12]。接頭蛋白SLP76是TCR 信號轉(zhuǎn)導的關鍵調(diào)控因子，對T細胞發(fā)育也非常重要[13]。當TCR激活后，HPK1激酶活性會完全激活，胞漿HPK1被招募到細胞膜上，Tyr381被磷酸化，為接頭蛋白SLP76 創(chuàng)造了一個結(jié)合位點[14]?；罨腍PK1 磷酸化位于SLP76 的Ser376 殘基，導致TCR 信號復合體的不穩(wěn)定，阻礙下游T 細胞激活和增殖。 廖學斌團隊[11]證明了HPK1 通過HPK1-NFkB-Blimp1軸介導T細胞功能障礙，圖2。

圖2 HPK1負性調(diào)控T細胞功能示意圖

2.1.2 HPK1 負性調(diào)控B 細胞功能HPK1 也是B 細胞受體（B cell receptors，BCR）誘導B 細胞活化的負性調(diào)節(jié)因子。由圖3可知HPK1調(diào)節(jié)BCR的方式與TCR 類似。B 細胞連接蛋白（B cell linker protein，BLNK）是一種調(diào)節(jié)BCR 下游信號的接頭蛋白，BLNK 在 結(jié) 構 上 與SLP - 76 同 源。 HPK1 誘 導 的BLNK 在Thr152 處的磷酸化誘導其與BLNK/14-3-3結(jié)合，并被一種E3連接酶泛素化，隨后發(fā)生蛋白降解，進而抑制BCR 信號轉(zhuǎn)導[15]。在生發(fā)中心B 細胞中，AKT 優(yōu)先靶向負調(diào)控HPK1，產(chǎn)生負反饋，抑制了上游的BCR 信號。AKT 抑制降低這種負反饋，增強生發(fā)中心B 細胞中BCR-近端激酶以及下游BCR信號分子的激活[16]，圖3。

圖3 HPK1負性調(diào)控B 細胞功能示意圖

2.2 HPK1 負性調(diào)節(jié)免疫功能 HPK1 激酶活性在免疫功能負性調(diào)節(jié)中起關鍵作用[17]。MAP4K1KOT細胞TCR 激活閾值降低，增殖活性顯著提升，Th1細胞分泌能力增強。在小鼠實驗性自身免疫性腦脊髓炎模型中，MAP4K1-/-小鼠在用髓鞘少突膠質(zhì)細胞糖蛋白衍生的多肽免疫時，出現(xiàn)嚴重的自身免疫相關癥狀，超過60%的MAP4K1-/-小鼠在6個月大時出現(xiàn)脾臟腫大，并且在脾、肺、肝和腎等多個臟器中發(fā)現(xiàn)有淋巴細胞浸潤[18]。遺傳學研究發(fā)現(xiàn)，靶向阻斷HPK1等位基因可以使T細胞和骨髓來源的樹突狀細胞免疫功能顯著增強[9,19]。綜合表明，HPK1是TCR 誘導的T細胞活化的負調(diào)節(jié)因子，也是維持外周免疫耐受的重要分子之一。

3 HPK1參與病理過程調(diào)控

3.1 HPK1 與自身免疫性疾病 有學者在自身免疫性疾病研究中，發(fā)現(xiàn)HPK1 與系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）有關。和健康對照組相比，SLE 患者CD4+T 細胞中HPK1 mRNA 和蛋白水平降低。含有Jumonji 結(jié)構域的蛋白3（ju‐monji domain containing 3，JMJD3）與HPK1 啟動子結(jié)合減少導致SLE CD4+T 細胞中HPK1 啟動子H3K27me3富集增加，抑制HPK1轉(zhuǎn)錄[20]。在SLE 患者中HPK1 的表達受抑制與JMJD3 結(jié)合減少以及H3K27me3 在HPK1 啟動子上富集增加有關，導致SLE患者T細胞過度激活。銀屑病關節(jié)炎是一種免疫介導的慢性炎癥性關節(jié)病，HPK1 在銀屑病關節(jié)炎疾病患者的外周血白細胞中表達水平降低可能與銀屑病關節(jié)炎的發(fā)病相關[21]。目前，在銀屑病關節(jié)炎疾病中HPK1的研究還較少，仍需進一步研究。

3.2 HPK1 與炎癥 在單核細胞分化過程中，全長HPK1 會 被caspase-3 裂 解 為HPK1-N 和HPK1-C，HPK1-N 可以促進祖細胞向單核細胞方向分化[2]。在小鼠原代祖細胞分化過程中阻斷caspase 活性會導致HPK1-N水平降低，JNK活性受到抑制，單核細胞分化減弱。對MAP4K1-/-小鼠中性粒細胞的功能分析表明，HPK1 在CXCL1 誘導淋巴細胞功能相關抗原1（lymphocyte function-associated antigen 1，LFA-1）介導的中性粒細胞與細胞間黏附分子1黏附中起關鍵作用。對小鼠提睪肌觀察證實，在MAP4K1-/-小鼠中CXCL1 誘導的白細胞黏附存在缺陷。無論在體外還是體內(nèi)，β2 整合素介導白細胞的黏附、擴散和中性粒細胞的定向遷移都涉及HPK1。陰囊內(nèi)注射腫瘤壞死因子α后，MAP4K1-/-小鼠的中性粒細胞黏附和滲出嚴重受損[22-23]。 這些研究均提示HPK1在急性炎癥過程中與LFA-1介導的中性粒細胞功能密切相關

3.3 HPK1 與腫瘤 研究發(fā)現(xiàn)，HPK1 與胰腺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關。

3.3.1 HPK1 與胰腺癌 研究發(fā)現(xiàn)，HPK1 蛋白表達缺失與胰腺上皮內(nèi)腫瘤的進展和侵襲性胰腺導管腺癌的發(fā)生密切相關[24]。在超過95% 的胰腺癌中，由于蛋白酶體途徑介導的降解導致HPK1 缺失。HPK1 可以抑制細胞增殖，增加細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑p21和p27的表達。致癌受體酪氨酸激酶Axl可以和HPK1相互作用，HPK1可以下調(diào)Axl的表達并縮短其半衰期。HPK1 介導的Axl 降解可以被內(nèi)吞途徑抑制劑抑制，如亮肽素、巴氟霉素A1和莫能菌素。在用Axl配體生長停滯特異性6處理的胰腺癌細胞中，HPK1加速Axl從質(zhì)膜向內(nèi)體的運動，還增加了Axl 與Cbl 原癌基因的結(jié)合。HPK1 通過其C末端結(jié)構域與Axl相互作用，使Axl蛋白表達下調(diào)。HPK1功能缺失可能導致Axl過表達，從而增強胰腺導管癌中Axl依賴的下游信號轉(zhuǎn)導和腫瘤侵襲。HPK1通過內(nèi)吞途徑針對Axl進行泛素化降解，降低胰腺癌侵襲能力及其下游AKT 和ERK 信號轉(zhuǎn)導。通過TCGA 數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)低HPK1 和高Axl 表達水平的腫瘤患者生存期短于低Axl 或高HPK1 表達的患者，綜合表明，在胰腺癌中HPK1是一種通過內(nèi)吞途徑靶向Axl降解的腫瘤抑制物[8]。

3.3.2 HPK1 與乳腺癌 Wang 等人[25]首次報道HPK1 的表達與乳腺癌，特別是浸潤性導管癌發(fā)生發(fā)展的潛在聯(lián)系。由表1和表2可知在雌激素受體（estrogen receptor, ER）陽性組中，HPK1 陽性與總生存率（overall survival，OS）增高相關，在浸潤性導管癌組中HPK1 表達水平低于正常乳腺組織；HPK1表達與ER陽性呈顯著負相關，與生存期呈正相關。這些數(shù)據(jù)提示HPK1 可能對腫瘤細胞有抑制作用。在國內(nèi)也有乳腺癌與HPK1 相關報道，在乳腺癌小鼠腫瘤模型中發(fā)現(xiàn)乳腺癌細胞株HPK1 過表達可抑制乳腺癌細胞的增殖、遷移并誘導凋亡[26]。國內(nèi)研究也表明，在乳腺癌組織中HPK1 表達顯著降低[27]。表1 和表2 數(shù)據(jù)引自Molecular medicine re‐ports, 2017, 16: 4634-4642。

表1 浸潤性導管癌患者HPK1蛋白表達與ER表達的關系

表2 浸潤性導管癌ER陽性患者中HPK1表達與預后的相關性

3.3.3 HPK1 與其他腫瘤 在膀胱癌中發(fā)現(xiàn)hsamiR-96可能通過上調(diào)胰島素受體底物1和HPK1水平來影響膀胱癌細胞的生長。雖然在膀胱癌中HPK1的表達上調(diào)，但其磷酸化過程可能受到抑制，從而阻斷了MAPK/ERK 通路[28]。程序性細胞死亡因子4 通過抑制HPK1 的表達阻斷c-jun 的激活進而抑制AP-1 依賴的轉(zhuǎn)錄，來抑制結(jié)腸癌細胞的腫瘤進展及遠處轉(zhuǎn)移[29]。在急性髓細胞白血?。╝cute myeloid leukemia，AML）中發(fā)現(xiàn)全長HPK1 是維生素D 誘導的AML 細胞分化的正調(diào)控因子，但裂解的HPK1 片段則會抑制AML 細胞的分化[30]，表明HPK1 在AML 細胞分化中具有雙重作用。在黑色素瘤小鼠模型中，MAP4K1-/-小鼠較正常對照組腫瘤生長速度明顯降低，并且浸潤性T 細胞的衰竭程度降低，活性或增殖性更高[11]。

3.3.4 HPK1 與腫瘤免疫治療 將MAP4K1KOT 細胞注射到T 細胞缺陷的Lewis 肺癌小鼠模型中，小鼠表現(xiàn)出強大的T 細胞介導的抗腫瘤免疫[9]。MAP4K1-/-小鼠模型也顯示免疫細胞活化和抗腫瘤活 性 增 強[31]。 通 過MAP4K1-/-小 鼠 發(fā) 現(xiàn)HPK1 在CD8+T 細胞中的激酶依賴性作用，HPK1 激酶功能的喪失增強了T 細胞受體信號和細胞因子的分泌。MAP4K1-/-小鼠伴隨著效應CD8+T細胞功能增強，病毒清除和抑制腫瘤生長作用顯著增強[10]。在人乳腺癌的小鼠模型上接受Her2 嵌合抗原受體T 細胞（chimeric antigen receptor T-cell，CAR -T）治 療，MAP4K1KOCAR-T 細胞體內(nèi)抗腫瘤效果較PDCD1KOCAR-T 細胞明顯提升，腫瘤生長受到明顯抑制[11]。HPK1小分子抑制劑化合物K可以使TCR對病毒和腫瘤抗原的敏感性增加，與抗PD1抗體協(xié)同增強抗原特異性T 細胞反應，并且可以促進DC 的成熟，動物模型研究也顯示小分子抑制劑化合物K和抗PD-1 聯(lián)合使用可以改善免疫反應和增強抗腫瘤效果[32]。在小鼠結(jié)腸腺癌模型中口服HPK1抑制劑與抗PD1藥物聯(lián)合使用較單用抗PD1抗體產(chǎn)生的抗腫瘤的療效增強，并且沒有對體質(zhì)量產(chǎn)生顯著的變化。聯(lián)合阻斷PD-L1 可進一步增強T 效應細胞功能，從而產(chǎn)生比單一靶點阻斷更好的抗病毒和抗腫瘤免疫[33]。上述研究表明，MAP4K1KOT 細胞較PDCD1KOT細胞具有更強大的抗腫瘤免疫，聯(lián)合使用HPK1抑制劑和抗PD1藥物可以增強抗腫瘤的療效。

4 小結(jié)與展望

目前，腫瘤免疫治療已成為腫瘤治療的重要方法之一，與手術、放化療和靶向治療相互補充。對已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移的腫瘤患者，免疫療法有望成為最有效的治療方式之一。在腫瘤的發(fā)生過程中，往往T 細胞、B 細胞以及樹突狀細胞的功能決定免疫功能的強弱，HPK1 是T 細胞、B 細胞及樹突狀細胞激活的負性調(diào)節(jié)因子，抑制其功能可增強免疫細胞殺傷腫瘤細胞能力，阻斷HPK1激酶和抗PD-1/PD-L1具有協(xié)同抗腫瘤效應，這些都為腫瘤的治療提供了新的思路，有望為藥物的研發(fā)和疾病的治療提供新的靶點。目前，阻斷HPK1在動物模型上取得良好效果，未來靶向HPK1 的策略可從以下幾方面展開，①CAR-T 細胞上的應用：基于HPK 敲除的CAR-T 項目正在開展臨床研究，初步結(jié)果提示，MAP4K1KOCAR-T細胞在多種腫瘤中表現(xiàn)出較好的安全性、有效性和抗腫瘤能力，有望未來為臨床上應用提供理論基礎。②聯(lián)合應用：包括與其他臨床一線治療藥物或靶向PD-1/PD-L1 治療聯(lián)合應用來提高腫瘤的治療效果，延長患者生存率。③藥物研發(fā)：蛋白水解靶向嵌合體和小分子抑制劑是當下藥物研發(fā)的熱點，HPK1 可以為藥物的研發(fā)提供新的靶點。④恢復腫瘤微環(huán)境免疫“正?；保耗[瘤微環(huán)境中免疫細胞浸潤的數(shù)量，殺傷能力以及HPK1 表達等都將不同程度影響腫瘤微環(huán)境中免疫細胞抗腫瘤能力，靶向HPK1 有望恢復腫瘤微環(huán)境免疫功能的“正?；?。考慮到HPK1 在人體的正常生理功能方面也十分重要, 其臨床應用仍存在著許多問題與挑戰(zhàn), 需進一步通過臨床試驗和真實數(shù)據(jù)研究來完善。