基于全轉(zhuǎn)錄組的心力衰竭預(yù)測標志物

馬 偉，李丹丹，張常建，陳偉浩，熊 鳴，喬媛媛，李 軍

心力衰竭（heart failure，HF）是一個復(fù)雜的臨床癥狀，其特點是心臟供血不足[1]。在發(fā)展中國家，HF 是患者住院的常見原因，其發(fā)病率和病死率也高[2-5]。HF 的發(fā)病率逐年增加，已經(jīng)成為重要公共健康問題[6-8]。在發(fā)展中國家，HF非常普遍，其患病率高達0.4%～2%[9-10]。雖然現(xiàn)在的診斷和治療水平已經(jīng)改善了HF 患者的預(yù)后，但是其5 年生存率仍不足50%[11-12]。HF 越早發(fā)現(xiàn)，患者預(yù)后越好，因此尋找預(yù)測HF的標志物對于降低患者病死率以及提高患者生活質(zhì)量非常有幫助。目前也發(fā)現(xiàn)了一些HF 的風(fēng)險因子。例如，Onoue 等[13]發(fā)現(xiàn)肌肉減少癥可以預(yù)測HF 患者的不良事件，而肌肉減少癥可以通過結(jié)合年齡、握力和小腿圍來進行評估。Soyama 等[14]通過超聲心動圖監(jiān)測心臟發(fā)現(xiàn)心臟舒張應(yīng)變（diastolic wall strain，DWS）能夠評估HF 患者心臟的功能。他們發(fā)現(xiàn)低DWS 水平患者，心功能比較好，而左心室功能受損的患者DWS 值升高，DWS 高的患者預(yù)后往往不好。近些年來，隨著高通量分子實驗技術(shù)的發(fā)展，多種多樣的基于血液或組織的分子標志物也出現(xiàn)了。Huang等[15]發(fā)現(xiàn)外周血白細胞的線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtD‐NA）的拷貝數(shù)變異（copy number variation，CNV）是HF 的獨立危險因素，能夠預(yù)測HF 患者病死率。Tumorigenicity-2 （sST2）能夠為HF 患者的后期處置提供幫助[16]。Circulating cell-free DNA （cfDNA）也可以作為HF 標志物[17]。在失代償期的HF 患者，血清高水平內(nèi)源性促紅細胞生成素的長期的臨床預(yù)后更差[18]。HF 標志物的概況參見這三篇綜述[19-21]。芯片技術(shù)的發(fā)展和二代測序及三代測序的發(fā)展，累積了很多全轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，這也為開發(fā)新的多分子標志物帶來了機遇和挑戰(zhàn)[22-23]。通過轉(zhuǎn)錄組分析，Maciejak 發(fā)現(xiàn)RNAS1、FMN1和JDP2與HF 患者的臨床指標有顯著的相關(guān)性。ST 段太高的心梗第一天，這三個基因的表達值在隨后發(fā)生HF 的患者中高于隨后未發(fā)生HF 的患者[24]?；谵D(zhuǎn)錄組的方法能夠發(fā)現(xiàn)基因表達特征作為疾病的標志物[25]。Heidecker基于轉(zhuǎn)錄組發(fā)現(xiàn)了一個45個基因特征的標志物，可以評估HF 患者的風(fēng)險[26]。然而上述標志物部分是單個分子，部分是幾十個基因的特征，相比人類將近3 萬個基因的數(shù)量，標志物涉及到的基因數(shù)量還是特別少，這就會導(dǎo)致容易產(chǎn)生過擬合，使得標志物的擴展應(yīng)用性不強。因此非常有必要尋找基于轉(zhuǎn)錄組的擴展性好的標志物。

使用全轉(zhuǎn)錄組的特征而不是僅僅局限于差異基因可以產(chǎn)生更穩(wěn)定的HF標志物。傳統(tǒng)的觀點認為蛋白質(zhì)功能的改變是由于突變導(dǎo)致了氨基酸序列發(fā)生了變化，然而有人發(fā)現(xiàn)原子含量，尤其是氧原子也與蛋白質(zhì)功能有關(guān)。大氣中氧含量的增加促進細胞交流與細胞器的形成，跨膜蛋白長度與蛋白質(zhì)氧含量有關(guān)，而蛋白質(zhì)氧含量又受到大氣氧含量的約束[27]。與無氧呼吸比較，有氧呼吸能夠有效的獲取能量，發(fā)生更多的代謝反應(yīng)[28-29]。對于HF患者，其特征就是組織缺氧，細胞氧化應(yīng)激增加[30]。因此，我們猜想在這樣的缺氧情況下，轉(zhuǎn)錄組會產(chǎn)生系統(tǒng)性的缺氧反應(yīng)，不同氧含量的蛋白質(zhì)其表達量會有不同的變化，這種不同的變化可以用來尋找HF 標志物。為了證實此猜想，本課題組從GEO（Gene Expression Omnibus，GEO）下載了兩套HF 數(shù)據(jù)（GSE57345 和GSE21610），然后開發(fā)了一個基于全轉(zhuǎn)錄組的預(yù)測HF的標志物[25,31]，發(fā)現(xiàn)基因的表達水平與氧原子含量（oxygen atom content，OAC）的Spearmam’s相關(guān)系數(shù)能夠很好的區(qū)分HF。

1 數(shù)據(jù)與方法

1.1 蛋白質(zhì)、mRNA 序列與基因表達數(shù)據(jù) 本研究從Ensembl 數(shù)據(jù)庫下載了蛋白質(zhì)序列和mRNA 序列[32]。從GEO 數(shù)據(jù)庫下載了兩套HF 數(shù)據(jù)，篩選標準為：組織來源為心肌組織活檢并且有正常心肌組織，最終篩選獲得GSE57345（Affymetrix Human Gene 1.1 ST Array）和GSE21610（Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array）[33]。在GSE57345 中，心臟組織樣本是MAGNet 聯(lián)盟從患者取得。本文的數(shù)據(jù)分析采用R 語言進行統(tǒng)計分析（version 3.6.2，https://www.r-project.org/）。

1.2 計算蛋白質(zhì)氧原子含量以及OAC 與基因表達的Spearman 相關(guān)性 蛋白質(zhì)氧原子含量定義為：蛋白質(zhì)序列中氧原子的數(shù)量/蛋白質(zhì)總原子數(shù)。在計算相關(guān)性之前，先根據(jù)轉(zhuǎn)錄本最優(yōu)密碼子的比例（codon optimality ratio of protein，CORP）進行排序，然后分成10 等份。CORP 定義為：mRNA 中最優(yōu)密碼子數(shù)量/總的密碼子數(shù)量。最優(yōu)密碼子定義為：密碼子的最佳穩(wěn)定性相關(guān)系數(shù)得分（correlation coefficient，CSC），而正值得分的密碼子就是最優(yōu)密碼子[34]。首先計算所有的蛋白質(zhì)編碼轉(zhuǎn)錄本的表達量與其相應(yīng)蛋白質(zhì)OAC 的Spearman 相關(guān)系數(shù)，然后針對上述10 份的每一份再計算一次。因此，對于每個樣本，會得到11 個相關(guān)系數(shù)，1 個總的和10個10等份的。

1.3 構(gòu)建分類器 使用randomForest R包構(gòu)建隨機森林模型，模型參數(shù)為：樹的數(shù)量為800，其他參數(shù)為默認值[35]。在構(gòu)建分類器這里，將兩套數(shù)據(jù)的相關(guān)系數(shù)范圍使用公式（1）縮放至[-1,1]，y’表示放縮后的值，y表示放縮前的值，min 表示原數(shù)據(jù)值中最小值，max 表示原數(shù)據(jù)中最大值。10 個10 等份的相關(guān)系數(shù)作為輸入特征。然后通過特征重要性篩選特征。使用準確率、陽性預(yù)測值（positive pre‐dictive value，PPV）和陰性預(yù)測值（negative predic‐tive value，NPV）作為分類器性能評估參數(shù)。使用5折交叉驗證、測試集以及獨立驗證集測試模型準確性。準確率=（真陽性數(shù)量+真陰性數(shù)量）/總量；PPV=真陽性數(shù)量/（真陽性數(shù)量+假陽性數(shù)量）；NPV=真陰性數(shù)量/（真陰性數(shù)量+假陰性數(shù)量）。

2 結(jié)果

2.1 數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)特征 數(shù)據(jù)的人口統(tǒng)計學(xué)資料和基本臨床信息見表1。GSE57345 包含313 個樣本，包括177 個HF 樣本和136 個正常樣本（non-HF con‐torls，NF）。HF樣本中有男性144例和女性33例，正常樣本有男性73例和女性63例。兩組的平均年齡分別為55.4 和49.4。GSE21610 有38 個樣本，30（28例男性和2例女性）和HF樣本和8個正常樣本（6例男性和2例女性），兩組平均年齡分別為51.3和29.0。

2.2 HF患者OAC與基因表達的相關(guān)性 首先對所有編碼蛋白的轉(zhuǎn)錄本計算了OAC 與基因表達的相關(guān)性。發(fā)現(xiàn)在GSE57345數(shù)據(jù)集中，HF 樣本的相關(guān)系數(shù)遠高于正常樣本（圖1A，P=2.25×10-11）。然后再使用相關(guān)系數(shù)作為參數(shù)做受試者工作曲線（re‐ceiver operating characteristic curve，ROC），曲線下面積（the area under curve，AUC）為0.772，如圖1B 所示。數(shù)據(jù)集GSE21610的結(jié)果類似（P=0.04），AUC為0.729，見圖1C和1D。數(shù)據(jù)集GSE21610沒有數(shù)據(jù)集GSE57345 顯著可能是由于其樣本量的原因（38 VS 313）。雖然兩個數(shù)據(jù)集中的相關(guān)系數(shù)差別比較大，但是HF樣本都高于正常樣本。

表1 數(shù)據(jù)集基本信息

圖1 兩個數(shù)據(jù)集中所有轉(zhuǎn)錄本的相關(guān)系數(shù)

2.3 基于選擇特征的隨機森林分類器 轉(zhuǎn)錄本最優(yōu)密碼子的比例與轉(zhuǎn)錄本的翻譯速度有關(guān)系[34]。因此，我們根據(jù)轉(zhuǎn)錄本的COPR 將所有轉(zhuǎn)錄本等分為10 組，每組分別計算表達水平與氧含量的Spearman 相關(guān)系數(shù)。在數(shù)據(jù)集GSE57345 中，第3、5、6、7、8、9、10 部分有顯著的區(qū)分能力，AUC 大于0.6，表2。尤其是第5 部分和第8 部分，AUC 大于0.8。第4 部分的AUC 也將近0.6（0.599）。在所有10部分中，HF樣本的相關(guān)系數(shù)都大于正常樣本。

表2 總體和10部分相關(guān)系數(shù)的區(qū)分能力

為了構(gòu)建分類器，本研究將GSE57345 隨機分為訓(xùn)練集和測試集兩部分，訓(xùn)練集包含250 個樣本（142 HF 和108 NF），測試集包含63 個樣本（35 HF和28NF）。 為了評估分類器的性能，把數(shù)據(jù)集GSE21610 作為完全獨立的一個測試集，僅僅在構(gòu)建好分類器后才使用。為了保持數(shù)據(jù)的通用性，再將兩套數(shù)據(jù)的相關(guān)系數(shù)范圍都縮放至[-1,1]。然后使用訓(xùn)練集進行模型構(gòu)建。10 部分的相關(guān)系數(shù)作為特征輸入隨機森林模型，根據(jù)特征重要性得分，選擇了前三個重要性得分最高的特征（圖2A），分別為第3、5、8部分。最終使用這三個特征作為輸入特征構(gòu)建隨機森林分類器。首先，使用5 折交叉驗證測試分類器性能。5 折交叉驗證的AUC 為0.851（圖2B），其準確率為83.6%，PPV 為85.7%，NPV 為81.5%，結(jié)果雖然不錯，但是也可能是由于過擬合導(dǎo)致，必須通過測試集進行驗證。使用訓(xùn)練集所有樣本構(gòu)建模型，然后使用GSE57345 的測試集部分數(shù)據(jù)進行測試，其AUC 為0.793（圖2C），準確率、PPV和NPV 分別為77.8%、80.0% 和75.0%。最終，在完全一個獨立的數(shù)據(jù)集GSE21610上測試了我們的分類器（圖2D），AUC高達0.908。準確率、PPV和NPV分別為86.8%、86.7% 和87.5%。總體上，本研究構(gòu)建的分類器能夠很好地區(qū)分HF和NF（表3）。

表3 分類器的性能評估

圖2 隨機森林模型性能評估

在獨立的測試集GSE21610中，HF和NF的年齡不匹配。為了排除年齡的影響，我們挑選了10個年齡在11.6 至46.4（NF 樣本年齡的）的HF 樣本來匹配NF樣本。這18個樣本（10個HF 和8個NF）的準確率、PPV和NPV分別為83.3%、80.0%和87.5%。這說明我們的分類器在獨立測試集上的效果不受年齡影響，也并非正負樣本差引起。

3 討論

在本研究中，本研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄本表達量與轉(zhuǎn)錄本對應(yīng)蛋白質(zhì)的氧原子含量的相關(guān)性能夠很好地區(qū)分HF 與NF。相關(guān)性在HF 組中更高，這說明在缺氧環(huán)境下，轉(zhuǎn)錄組受到了很大影響，系統(tǒng)更傾向于表達氧原子含量更高的蛋白質(zhì)，可能是為了補償缺氧或者是緩解氧化應(yīng)激壓力。通過交叉驗證、測試集以及獨立測試集評估，發(fā)現(xiàn)利用表達量-氧原子含量相關(guān)性構(gòu)建的分類器展現(xiàn)了非常穩(wěn)定的預(yù)測性能。本研究開發(fā)的基于全轉(zhuǎn)錄組的策略能夠避免少量表達波動帶來的影響。

然而本研究仍然存在缺陷。首先，受限于數(shù)據(jù)庫中HF 患者心臟組織表達譜數(shù)據(jù)的限制，僅僅評估了其區(qū)分HF 和NF 的性能，沒有評估其與HF 患者預(yù)后的關(guān)系。其次，使用的數(shù)據(jù)集，其樣本來源是心肌組織（作為臨床預(yù)測標志物，更容易取材或者非侵襲的取材更方便合適，比如血液、尿液等）?，F(xiàn)實中，常用的很多HF 標志物確實來自血液或者是身體檢查。盡管如此，也有基于心肌組織的標志物。Heidecker 用心肌活檢組織找到了HF 的轉(zhuǎn)錄組標志物[26]。Morgun 使用心肌活檢組織轉(zhuǎn)錄組構(gòu)建了預(yù)測是否發(fā)生心臟移植排斥反應(yīng)的預(yù)測器，提高了心臟移植排斥診斷率[36]。實際上，心肌活檢組織是診斷心臟移植排斥反應(yīng)的金標準。最后，本研究開發(fā)的標志物是基于整個轉(zhuǎn)錄組的，不是基于個別基因或者少數(shù)基因的，無法對其功能做闡釋。我們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄效率低的轉(zhuǎn)本部分（F1、F2、F3）對HF鑒別無作用，而轉(zhuǎn)錄效率高的部分對HF 有鑒別作用，這可能與人類進化過程中氧含量的變化有關(guān)，也可能與人體反應(yīng)機制有關(guān)。在缺血情況下，心肌組織氧含量高的轉(zhuǎn)錄本轉(zhuǎn)錄更多，可能是反應(yīng)性的存儲更多的氧而導(dǎo)致的。隨著技術(shù)的發(fā)展，心肌組織樣本提取會變得越來越容易，侵襲性越來越小，基于心肌組織的標志物會越來越多。由于HF是臨床死亡最多原因之一，多變量的標志物將會更好的預(yù)測HF，改善其預(yù)后[37]。因此，如果有合適的數(shù)據(jù)，我們非常樂意在新的數(shù)據(jù)中檢驗我們預(yù)測器預(yù)測HF及HF預(yù)后的能力。

總的來說，本研究構(gòu)建了一個基于全轉(zhuǎn)錄組的HF 標志物，能夠準確的區(qū)分HF 與NF。隨著全轉(zhuǎn)錄組技術(shù)的成熟，價格越來越低，本研究提出的策略能夠很容易的實施，未來將會有更多的轉(zhuǎn)錄組標志物甚至多組學(xué)整合策略的標志物出現(xiàn)。