一種脊髓型頸椎病慢性壓迫性動(dòng)物模型的建立及評(píng)價(jià)

李成立，曲軍杰，陳松，張為*

(1.濱州醫(yī)學(xué)院煙臺(tái)附屬醫(yī)院骨科，山東 煙臺(tái) 264100；2.河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院脊柱外科，河北 石家莊 050000)

脊髓型頸椎病(cervical spondylotic myelopathy，CSM)是一種以運(yùn)動(dòng)感覺(jué)障礙為主的常見(jiàn)頸椎病，病變機(jī)理為頸椎退變、韌帶異常增生鈣化等，導(dǎo)致椎管容積減少，從而繼發(fā)脊髓的慢性壓迫[1]。脊髓受到慢性機(jī)械壓迫后可繼發(fā)神經(jīng)元細(xì)胞損傷、局部微循環(huán)障礙、炎癥反應(yīng)，從而造成脊髓的損傷性病變，出現(xiàn)功能障礙[2]。本研究從構(gòu)建SD大鼠脊髓型頸椎病模型基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)出發(fā)，采用聚乙烯醇-聚丙烯酰胺互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠植入大鼠C5～7椎板下，建立脊髓型頸椎病慢性壓迫性大鼠模型，研究脊髓不同壓迫程度、不同時(shí)間點(diǎn)的病理學(xué)形態(tài)變化及相應(yīng)節(jié)段椎間盤中相關(guān)炎癥因子的表達(dá)情況，并研究炎癥因子表達(dá)程度與頸椎退行性病變程度的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)試劑 HE 染色試劑盒(北京索來(lái)寶科技)；脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法(terminal dexynucleotidyl transferase dutp nick end labeling，TUNEL)細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(美國(guó)，Promega Corporation)；Western blot抗體(上海恒斐生物科技有限公司)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與模型建立

1.2.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 購(gòu)入70只3個(gè)月齡健康雄性SD大鼠，從1～70編號(hào)，隨機(jī)分為三組，對(duì)照組(n=10)、輕度壓迫模型組(n=30)、重度壓迫模型組(n=30)。SD大鼠來(lái)自河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2.1.2 水凝膠材料的制作 配制10%聚乙烯醇水溶液，然后用液氮進(jìn)行3次冷凍-解凍，使之成凝膠態(tài)。將上述制得凝膠置于3.0 mol/L丙烯酰胺溶液中，溶脹充分后置于60Coγ射線下進(jìn)行處理形成聚乙烯醇-聚丙烯酰胺互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠，再將其放入10%戊二醛水溶液中浸泡30 s，重復(fù)10次浸泡烘干操作，最后將制得的水凝膠用環(huán)氧乙烷消毒后備用。

1.2.1.3 建立模型 輕度壓迫模型組：通過(guò)腹腔對(duì)大鼠注射10%水合氯醛進(jìn)行麻醉(3 mL/kg)，然后俯臥，并固定于手術(shù)臺(tái)上。術(shù)區(qū)備皮后，碘伏反復(fù)消毒3遍后切開(kāi)大鼠頸部使其C5～7椎板暴露，將椎板間韌帶部分切掉，小心將1.6 mm×0.8 mm×0.4 mm尺寸水凝膠復(fù)合物放在C5～7節(jié)段的椎板下方。重度壓迫模型組：重復(fù)上述操作，互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠尺寸為5.5 mm×1.6 mm×0.8 mm。對(duì)照組：重復(fù)上述操作但不在椎板下植入壓迫物。造模后4周、8周和12周，使用過(guò)量麻醉劑注射進(jìn)入SD大鼠腹腔處死大鼠，留取C5～7整段脊髓和椎間盤進(jìn)行后續(xù)研究。手術(shù)造模過(guò)程見(jiàn)圖1。

a 暴露頸椎椎板 b 剝離椎板間黃韌帶 c 植入壓迫材料 d 縫合后頸椎壓迫情況

1.2.2 主要觀察指標(biāo) 行為學(xué)評(píng)價(jià)采用改良的Rivlin斜板測(cè)試方法(見(jiàn)圖2)。手術(shù)前和術(shù)后的第4、8和12周，對(duì)三組大鼠的運(yùn)動(dòng)行為能力觀察。每組隨機(jī)選取6只大鼠，依次放入斜板上，每只大鼠在斜板上留置10s，每只進(jìn)行3次，每次記錄最大傾斜角，取3次平均值，術(shù)后后4周、8周和12周對(duì)上述6只大鼠進(jìn)行處死，然后取C5～7節(jié)段椎間盤和脊髓部分。脊髓HE染色、凋亡細(xì)胞檢測(cè)(400倍鏡下隨機(jī)選擇8個(gè)視野計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)和Western blot對(duì)C5～7椎間盤組織內(nèi)腫瘤壞死因子(tumour necrosis factor，TNF)-a、白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-1β、IL-33和IL-6 mRNA水平的變化進(jìn)行測(cè)定。余下大鼠作為備用，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后一同處死取材。

a 對(duì)照組 b 輕度壓迫模型組 c 重度壓迫模型組

2 結(jié) 果

2.1 運(yùn)動(dòng)功能評(píng)價(jià)結(jié)果 對(duì)照組術(shù)后各時(shí)間運(yùn)動(dòng)功能與術(shù)前比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而輕度壓迫模型組和重度壓迫模型組大鼠術(shù)后8周和12周所能承受的斜板角度均顯著下降，三組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)表1)。

表1 三組大鼠斜板爬坡試驗(yàn)結(jié)果

2.2 脊髓HE染色結(jié)果 術(shù)前大鼠的神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)正常規(guī)則，髓鞘緊密排列，對(duì)應(yīng)的軸突和白質(zhì)均正常(見(jiàn)圖3a～b)。術(shù)后第4周輕度、重度壓迫模型組與對(duì)照組之間病理HE染色結(jié)果基本相同，細(xì)胞之間未見(jiàn)明顯改變(見(jiàn)圖3c～d)。術(shù)后第8周顯微鏡下觀察輕度壓迫模型組較對(duì)照組神經(jīng)元細(xì)胞變性、皺縮，有輕度脫髓鞘；重度壓迫模型組神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)目顯著減少，可觀察到顯著的皺縮、脫髓鞘以及空泡發(fā)生變性(見(jiàn)圖3e～f)。術(shù)后第12周輕度壓迫模型組較對(duì)照組神經(jīng)元細(xì)胞的變性程度增大，脫髓鞘加重，軸突空泡變性程度增大；重度壓迫模型組神經(jīng)元細(xì)胞出現(xiàn)壞死情況，脫髓鞘和軸突空泡變性程度加重(見(jiàn)圖3g～h)。因此，選取對(duì)照組、術(shù)后第8周組和12周組進(jìn)行后續(xù)研究。

a 輕度壓迫模型組術(shù)前 b 重度壓迫模型組術(shù)前

2.3 凋亡細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果 脊髓壓迫組中神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡隨壓迫輕重和時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸增多，對(duì)照組中大鼠的脊髓中未觀察到上述損傷改變，而且神經(jīng)元細(xì)胞凋亡陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯增多，且不同大鼠模型組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)圖4，表2)。

a 對(duì)照組術(shù)后8周 b 輕度壓迫模型組術(shù)后8周 c 重度壓迫模型組術(shù)后8周

表2 TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞率的比較

2.4 大鼠椎間盤中IL-1β、TNF-α、IL-33和IL-6 mRNA的變化 輕度壓迫模型組和重度壓迫模型組大鼠椎間盤組織中IL-1β、TNF-α、IL-33和IL-6 mRNA表達(dá)平均高于對(duì)照組(P<0.05)，且重度壓迫模型組較輕度壓迫模型組表達(dá)量高(P<0.05)。此外，隨著壓迫時(shí)間延長(zhǎng)，輕度、重度壓迫模型組中各因子表達(dá)水平術(shù)后12周比8周明顯增高，且組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)圖5)。

圖5 術(shù)后8周和12周椎間盤中IL-1β、TNF-α、IL-33和IL-6 mRNA表達(dá)水平

2.5 大鼠椎間盤中IL-1β、TNF-α、IL-33和IL-6蛋白的變化 大鼠椎間盤中IL-1β、TNF-α、IL-33和IL-6蛋白結(jié)果顯示，輕度壓迫模型組和重度壓迫模型組中壓迫越重及壓迫時(shí)間越長(zhǎng)，各細(xì)胞因子蛋白表達(dá)越高，椎間盤相對(duì)應(yīng)的退變?cè)絿?yán)重，炎性蛋白表達(dá)越高。而且相關(guān)炎性因子的表達(dá)與壓迫時(shí)間也存在正相關(guān)的關(guān)系，時(shí)間越長(zhǎng)，相關(guān)炎性蛋白因子表達(dá)越高，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)上意義(P<0.05)。此外，術(shù)后8周的TNF-α蛋白相對(duì)表達(dá)量略高于12組，這可能與大鼠個(gè)體差異有關(guān)(見(jiàn)圖6)。

圖6 術(shù)后8周和12周時(shí)椎間盤中IL-1β、TNF-α、IL-33和IL-6蛋白表達(dá)水平

3 討 論

CSM是頸椎病中常見(jiàn)的一種類型[3]，建立合適的動(dòng)物模型模擬人的脊髓慢性壓迫的病變過(guò)程，對(duì)治療脊髓型頸椎病尤其重要。目前，學(xué)者們選取大鼠、兔子和狗等動(dòng)物進(jìn)行CSM慢性壓迫性模型的建立[4-5]。根據(jù)學(xué)者們的不斷證實(shí)，SD大鼠頸椎構(gòu)造與人的頸椎具有高度相似性，而且成本相對(duì)低，比小鼠更容易操作，因此，采用SD大鼠構(gòu)建CSM慢性壓迫性動(dòng)物模型進(jìn)行后續(xù)研究是十分理想的選擇。

關(guān)于CSM慢性壓迫動(dòng)物模型的建立方法，學(xué)者們也進(jìn)行了大量的嘗試。鋼釘法[6]、球囊法[4]等常被用于CSM慢性壓迫性模型的建立，但這些壓迫方法都存在一定缺陷。如鋼釘法的鋼釘進(jìn)入深度不可控，球囊法壓迫面積不可控，造模需要?jiǎng)游矬w積較大，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)成本較高，難以獲得較大的標(biāo)本量等缺點(diǎn)阻礙了在科研中的應(yīng)用。隨著學(xué)者們不斷探索，膨脹壓迫材料具有壓迫方向、程度易于控制、可反復(fù)使用等優(yōu)點(diǎn)，逐漸應(yīng)用到慢性脊髓壓迫頸椎病模型的建立中。其中，研究比較成熟的膨脹壓迫材料多為水凝膠，且以聚乙烯醇-聚丙烯酰胺互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠應(yīng)用最為廣泛[7-8]。因此，本研究采用該壓迫材料建立慢性脊髓壓迫頸椎病大鼠模型，并用于后續(xù)研究。

膨脹壓迫材料因其良好的生物組織相容性，吸收椎管中組織間液的水分后體積呈線性膨脹增大，使椎管容積減少，致使脊髓受壓，從而建立CSM的動(dòng)物模型。先前國(guó)外有研究把一種親水性膨脹材料植入SD大鼠頸部C5～6節(jié)段椎管后方，隨著膨脹材料吸水膨脹后，位于大鼠頸部椎管內(nèi)脊髓受到的壓迫程度也逐漸增加，成功模擬出了脊髓頸椎病受壓的模型[9-10]。國(guó)內(nèi)王軍[11]通過(guò)改變吸水膨脹材料的體積大小，將不同體積的壓迫材料植入大鼠頸部C5～7椎板和硬脊膜間，形成了輕型脊髓頸椎病、重型脊髓頸椎病的動(dòng)物模型。本實(shí)驗(yàn)也同樣受到了上述實(shí)驗(yàn)的啟發(fā)，通過(guò)植入兩種大小不同體積水凝膠材料，短期內(nèi)制造出輕度、重度兩種脊髓型頸椎病慢性壓迫性模型，加入對(duì)大鼠的運(yùn)動(dòng)功能評(píng)價(jià)，并更深一步研究受壓節(jié)段椎間盤中炎性因子的mRNA和蛋白的表達(dá)水平，探索脊髓型頸椎病慢性壓迫的發(fā)病機(jī)理。術(shù)中通過(guò)直接的觀察，發(fā)現(xiàn)脊髓后方脊膜上有毛細(xì)血管充血受壓改變，脊髓壓迫導(dǎo)致了脊髓缺血和靜脈的阻塞[12]，引發(fā)了脊髓神經(jīng)元細(xì)胞損傷，出現(xiàn)相應(yīng)臨床癥狀。當(dāng)然本方法也有自身的缺點(diǎn)和不足，由于膨脹速度只能依靠材料本身特性，實(shí)驗(yàn)者難以人為控制其對(duì)頸髓的壓迫速度和程度。因此，吸水性膨脹材料法制造脊髓型頸椎病的慢性壓迫性動(dòng)物模型，需要相關(guān)技術(shù)和材料的進(jìn)步來(lái)對(duì)其進(jìn)一步的完善和提高。

慢性脊髓損傷中神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡和脫髓鞘改變?cè)诩顾韫δ芟陆颠^(guò)程中起到了非常重要的作用。戎利民等[13]通過(guò)對(duì)CSM患者的尸體解剖，發(fā)現(xiàn)在椎管狹窄脊髓受壓節(jié)段有凋亡細(xì)胞的存在，并在頸椎管狹窄的小鼠模型病變節(jié)段脊髓中發(fā)現(xiàn)多種凋亡蛋白的高表達(dá)，參與并調(diào)節(jié)了脊髓受壓部位的神經(jīng)元細(xì)胞的損傷過(guò)程，說(shuō)明了神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡機(jī)制在脊髓型頸椎病神經(jīng)損傷的過(guò)程中起到了非常重要的作用。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)脊髓病理HE染色及細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組脊髓灰白質(zhì)細(xì)胞形態(tài)正常，無(wú)損傷改變，術(shù)后隨著壓迫時(shí)間延長(zhǎng)和壓迫程度增加，神經(jīng)元細(xì)胞和軸突空泡的變性，脫髓鞘逐漸加重，甚至出現(xiàn)神經(jīng)元細(xì)胞壞死，凋亡細(xì)胞陽(yáng)性數(shù)也在逐漸增加，與手術(shù)建模的時(shí)間成正相關(guān)，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有明顯差異。通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，我們的CSM慢性壓迫性模型與預(yù)想結(jié)果相符合。

大量的研究發(fā)現(xiàn)，椎間盤中炎性因子在椎間盤退變中起到了非常重要的作用[14-15]。我們通過(guò)PCR對(duì)椎管內(nèi)受壓節(jié)段椎間盤中的炎性因子進(jìn)行測(cè)量，各組中隨著壓迫時(shí)間延長(zhǎng)mRNA含量逐漸增加，而且植入水凝膠尺寸越大對(duì)脊髓壓迫越重，mRNA含量越高，且兩組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Western blot方法輕度、重度壓迫模型組中隨著壓迫增加，壓迫時(shí)間延長(zhǎng)，各細(xì)胞炎性因子蛋白表達(dá)越高，說(shuō)明脊髓受壓越重，受壓脊髓周圍組織中炎性蛋白表達(dá)越高。而且相關(guān)炎性因子的表達(dá)與壓迫時(shí)間之間也存在正相關(guān)，時(shí)間越長(zhǎng)相關(guān)炎性因子表達(dá)越高。說(shuō)明炎癥因子表達(dá)與壓迫程度關(guān)系密切，在脊髓型頸椎病發(fā)展過(guò)程中起到了非常重要的作用，也對(duì)我們的治療有一定啟示作用。