油茶分子育種現(xiàn)狀與趨勢(shì)

田仟仟，黃建建，溫 強(qiáng)★，周文才，黃 彬，龔 春，徐林初

(1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)·林學(xué)院，江西南昌330045；2.江西省林業(yè)科學(xué)院·江西省油茶種質(zhì)資源保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌330013)

油茶（Camelliaspp.）是我國(guó)南方特有木本油料植物，因其茶油品質(zhì)優(yōu)良，是聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織推薦的健康食用植物油，現(xiàn)已被正式列入國(guó)家大宗油料作物名錄[1]。油茶廣義上是指山茶屬(Camellia)植物中含油率較高且具有一定經(jīng)濟(jì)價(jià)值的木本油料植物的總稱[2]。油茶的自交可育率很低，是典型的異花授粉植物，其種類繁多，資源非常豐富。我國(guó)油茶分布區(qū)域廣泛，集中分布在南方地區(qū)的長(zhǎng)江和珠江流域，其中江西、湖南和廣西3省區(qū)為中心產(chǎn)區(qū)。目前主栽油茶主要包括普通油茶（C.oliefera）、小果油茶（C.meiocarpa）、越南油茶（C.vietnamensis）、攸縣油茶（C.yuhsienensis）、騰沖紅花油茶（C.reticulata）、浙江紅花油茶（C.chekiangoleosa）和廣寧紅花油茶（C.semiserrata）等[3]。

我國(guó)油茶育種工作始于20世紀(jì)50年代。近70年里，研究人員完成了油茶的品種調(diào)查和鑒定、優(yōu)樹選擇、栽培繁育等一系列工作，先后選育出了如岑溪軟枝油茶、中苞紅球、巴陵油茶、白皮中籽等優(yōu)良農(nóng)家品種和一大批優(yōu)良無(wú)性系如江西省的贛無(wú)系列、長(zhǎng)林系列、贛州油系列，湖南省的湘林系列，福建省的閩優(yōu)系列，廣西省的岑軟系列、桂軟系列，浙江省的亞林系列等[3-5]。目前通過(guò)國(guó)家審（認(rèn)）定的油茶良種達(dá)73個(gè)，而國(guó)家林業(yè)和草原局《全國(guó)油茶主推品種目錄》公布主推品種達(dá)121個(gè)，主要集中在江西、湖南、廣西、安徽等地[6]。油茶雖已選育出一批優(yōu)良無(wú)性系或家系良種，但具有產(chǎn)量穩(wěn)定、抗性強(qiáng)、廣適性好等優(yōu)良性狀的品種仍舊不多，因此繼續(xù)選育和推廣新的優(yōu)良品種是加快油茶產(chǎn)業(yè)發(fā)展的種業(yè)核心問(wèn)題。利用傳統(tǒng)的育種技術(shù)難以有效改良特定性狀或是選育包含多個(gè)目標(biāo)性狀的優(yōu)良品種。當(dāng)前，油茶在常規(guī)育種及優(yōu)良栽培技術(shù)等方面的研究已處于瓶頸期，很難有新的突破。分子育種可縮短育種年限、打破基因資源匱乏等局限，能夠較快獲得高產(chǎn)、廣適性好的優(yōu)良新品種，這使得育種將往更精確、高效且具可預(yù)見性的方向發(fā)展。目前經(jīng)濟(jì)林學(xué)者已將遺傳學(xué)、多組學(xué)及分子生物學(xué)等多種分子技術(shù)應(yīng)用于油茶育種研究。本文較系統(tǒng)的闡述了我國(guó)油茶分子育種研究現(xiàn)狀，通過(guò)總結(jié)述評(píng)油茶分子育種存在的問(wèn)題與未來(lái)的發(fā)展趨勢(shì)，以期為后續(xù)深入開展油茶育種研究提供理論基礎(chǔ)與技術(shù)參考。

1 油茶分子標(biāo)記相關(guān)研究

1.1 常用分子標(biāo)記

分子標(biāo)記是開展油茶分子育種研究的重要工具。油茶常用的分子標(biāo)記技術(shù)有：隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD)、擴(kuò)增片段 長(zhǎng) 度 多 態(tài) 性（Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP）、相 關(guān) 序 列 擴(kuò) 增 多 態(tài) 性（Sequence-related Amplified Polymorphism，SRAP）、微衛(wèi)星（Simple Sequence Repeats，SSR）、簡(jiǎn)單重復(fù)間序列標(biāo)記（Inter-simple Sequence Repeat，ISSR）等。其中RAPD和ISSR分子標(biāo)記在油茶研究的應(yīng)用較早。張?jiān)芠7]建立了油茶RAPD最適反應(yīng)體系，并從78個(gè)隨機(jī)寡核苷酸引物中篩選出19個(gè)引物。溫強(qiáng)等[8]以25個(gè)油茶高產(chǎn)無(wú)性系為材料建立了油茶ISSR反應(yīng)體系，并進(jìn)行了體系優(yōu)化。李阿池[9]從64對(duì)引物中篩選出8對(duì)AFLP引物，并對(duì)50份福建省油茶主栽品種進(jìn)行擴(kuò)增，共擴(kuò)增出313個(gè)位點(diǎn)，多態(tài)性位點(diǎn)占比為48.24%。范小寧[10]以127份油茶為試驗(yàn)材料，不僅優(yōu)化了SRAP和SSR反應(yīng)體系，還開發(fā)了多態(tài)性比率高達(dá)100%的SRAP標(biāo)記（9個(gè)）和SSR標(biāo)記（10個(gè)），平均每對(duì)引物擴(kuò)增位點(diǎn)分別為21.2個(gè)和6.0個(gè)。SSR標(biāo)記是共顯性標(biāo)記，可鑒別雜合子和純合子，具有通用性高、多態(tài)性高、穩(wěn)定性好、經(jīng)濟(jì)高效、試驗(yàn)檢測(cè)過(guò)程簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。以往有限的基因序列限制了SSR標(biāo)記在油茶中的應(yīng)用，但隨著高通量測(cè)序時(shí)代的到來(lái)，大量基因序列的獲得為規(guī)?；_發(fā)SSR標(biāo)記提供了序列資源。開發(fā)SSR標(biāo)記的序列來(lái)源于核基因組和細(xì)胞質(zhì)基因組。多數(shù)SSR標(biāo)記的開發(fā)是基于核基因組進(jìn)行的，如溫強(qiáng)等[11]通過(guò)454高通量測(cè)序獲得了普通油茶、浙江紅花油茶和短柱茶的轉(zhuǎn)錄組序列以及普通油茶基因組序列，并分析了這些序列中的微衛(wèi)星組成和分布特征；在此基礎(chǔ)上，以3個(gè)浙江紅花油茶自然群體為檢測(cè)材料開發(fā)出18個(gè)浙江紅花油茶SSR標(biāo)記，為山茶屬不同樹種SSR標(biāo)記的開發(fā)提供參考的同時(shí)，也為研究浙江紅花油茶遺傳多樣性提供有價(jià)值的工具[12]。Shi等[13]利用Roche 454測(cè)序技術(shù)獲得浙江紅花油茶基因組序列，以此設(shè)計(jì)了900對(duì)SSR引物，從中開發(fā)109個(gè)（31.4%）多態(tài)性SSR標(biāo)記。閆蕊等[14]從油茶果實(shí)和葉轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得的unigenes中開發(fā)出48個(gè)與油茶重要經(jīng)濟(jì)和生長(zhǎng)性狀相關(guān)的SSR標(biāo)記，為油茶的遺傳多樣性分析和分子標(biāo)記輔助選擇育種等研究奠定基礎(chǔ)。目前，山茶屬基于細(xì)胞質(zhì)基因組的SSR標(biāo)記開發(fā)研究較少，殷鑫等[15]基于葉綠體基因組（chloroplast genome DNA,cpDNA）全序列建立了山茶屬cpSSR分子標(biāo)記體系并篩選出6個(gè)種間通用性高的cpSSR標(biāo)記，為山茶屬多態(tài)性cpSSR標(biāo)記開發(fā)及應(yīng)用提供參考。

1.2 遺傳多樣性分析

油茶的遺傳背景復(fù)雜，研究其種群遺傳結(jié)構(gòu)及種群間的遺傳分化，可為種質(zhì)資源的保護(hù)與利用提供理論依據(jù)。目前，已有大量利用分子標(biāo)記研究油茶種質(zhì)資源遺傳多樣性的報(bào)道。張?jiān)芠7]以RAPD標(biāo)記為工具研究了32個(gè)油茶雜優(yōu)品系及10個(gè)龍眼茶豐產(chǎn)農(nóng)家品種的遺傳多樣性，結(jié)果表明，各位點(diǎn)Shannon信息指數(shù)和Nei氏遺傳多樣性指數(shù)平均值分別為0.2516和0.1653，樣本間的無(wú)偏遺傳距離和遺傳相似系數(shù)的平均值分別為0.1780和0.8388，表明供試樣本遺傳多樣性水平較低。彭方仁等[16]利用ISSR和SRAP兩種分子標(biāo)記對(duì)192份油茶種質(zhì)材料的遺傳多樣性進(jìn)行分析，結(jié)果表明油茶種質(zhì)資源的相似系數(shù)范圍分別為0.52~1.00和0.65~0.95，說(shuō)明這些油茶種質(zhì)材料的遺傳基礎(chǔ)較窄，親緣關(guān)系比較接近。黃勇[17]利用11對(duì)SSR引物對(duì)5個(gè)同域分布的小果油茶和普通油茶居群進(jìn)行了遺傳多樣性研究，兩種間表型頻率存在一定差異，種內(nèi)遺傳多樣性較高；同域分布的兩物種間的平均遺傳分化系數(shù)（Gst）為0.057低于物種內(nèi)異域居群間的遺傳分化系數(shù)的平均值，UPGMA聚類結(jié)果表明，這兩個(gè)種間的親緣關(guān)系非常接近，存在明顯的種間漸滲雜交[17]。陳宣等[18]采用SRAP分子標(biāo)記分析了海南島31個(gè)油茶居群的遺傳多樣性和親緣關(guān)系，結(jié)果表明海南島油茶遺傳多樣性較低，物種水平的Nei’s基因多樣性（H）為0.2228，居群水平的有效等位基因數(shù)（Ne）為1.2371；海南島油茶居群間的平均遺傳距離為0.1077，遺傳分化指數(shù)（Gst）為0.380，表明居群間的親緣關(guān)系較近，僅有38.05%的變異發(fā)生在居群間。甘沛華等[19]采用熒光AFLP標(biāo)記技術(shù)，對(duì)3個(gè)自然類型的騰沖紅花油茶進(jìn)行遺傳變異分析，發(fā)現(xiàn)騰沖紅花油茶具有豐富的遺傳變異，UPGMA聚類分析將半重瓣歸為單瓣和重瓣類型的過(guò)渡類型。從現(xiàn)有研究分析，油茶是個(gè)在DNA分子水平上高度雜合的物種類群，而分子標(biāo)記類型選擇趨向于使用穩(wěn)定、可靠且具高多態(tài)性的標(biāo)記。

1.3 品種甄別

傳統(tǒng)的油茶品種劃分主要依據(jù)葉、花和果實(shí)等表觀形態(tài)。但油茶是典型的異花授粉植物，性狀分離嚴(yán)重，個(gè)體差異大，有著豐富的表型變異，其幼苗較難區(qū)分。此外，油茶還存在同物異名或同名異物的現(xiàn)象。因此，隨著油茶新品種的不斷出現(xiàn)，品種鑒定面臨的形勢(shì)將更加嚴(yán)峻。利用分子標(biāo)記技術(shù)在苗期直接鑒定品種的基因型，不僅解決了目前生產(chǎn)上種苗混亂以及品種名亂用的同時(shí)，還為早期選擇育種提供一種新手段。陳永忠等[20]利用6對(duì)RAPD引物對(duì)12個(gè)油茶優(yōu)良無(wú)性系進(jìn)行品種鑒別，結(jié)合S1107、S1127、S1464、S1469和S1510引物所提供的18個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)可鑒別出12個(gè)無(wú)性系以及普通油茶品種，其中S1106標(biāo)記的鑒定效果最好。溫強(qiáng)等[21]以江西油茶高產(chǎn)無(wú)性系為材料，采用9個(gè)ISSR分子標(biāo)記進(jìn)行分子鑒定研究，最終利用引物UBC843、UBC844、UBC845、UBC854分別與引物UBC873進(jìn)行兩兩組合搭配，建立了25個(gè)油茶無(wú)性系的DNA指紋庫(kù)。李阿池[9]首次采用AFLP技術(shù)，從E1M1選擇性引物組合擴(kuò)增獲得的多態(tài)性位點(diǎn)中挑選13個(gè)條帶，構(gòu)建50份福建省油茶主栽品種的DNA指紋圖譜，根據(jù)構(gòu)建的指紋圖譜來(lái)鑒定各個(gè)材料。林萍等[22]利用15對(duì)SRAP引物，對(duì)12個(gè)油茶長(zhǎng)林系列無(wú)性系進(jìn)行品種鑒定，其中有13對(duì)引物都可以對(duì)供試無(wú)性系進(jìn)行有效鑒別，從Me1Em4、Me1Em11、Me1Em24和Me2Em9引物中篩選24個(gè)條帶建立12個(gè)油茶長(zhǎng)林系列無(wú)性系DNA指紋圖譜。Chen等[23]篩選出10對(duì)高多態(tài)性的SSR引物，構(gòu)建了128個(gè)油茶優(yōu)良品種的DNA指紋圖譜，分析發(fā)現(xiàn)‘長(zhǎng)林40號(hào)’和‘富陽(yáng)40號(hào)’在這10對(duì)SSR引物的指紋圖譜上具有完全相似性，表明它們可能是同物異名。周文才等[24]利用從油茶DNA序列中開發(fā)的SSR標(biāo)記構(gòu)建了油茶43個(gè)栽培品種的DNA指紋圖 譜，利 用4個(gè) 標(biāo) 記CO_gSSR16、CO_gSSR37、CO_eSSR4和CO_eSSR44兩兩組合就可以對(duì)43個(gè)油茶栽培品種進(jìn)行鑒別。

1.4 標(biāo)記性狀關(guān)聯(lián)分析

關(guān)聯(lián)分析又稱連鎖不平衡作圖（Linkage Disequilibrium Mapping，LD mapping），已廣泛應(yīng)用于農(nóng)作物有益基因的挖掘，但當(dāng)前在油茶中的應(yīng)用僅有兩篇文獻(xiàn)報(bào)道。Lin等[25]對(duì)普通油茶中包括含油量和脂肪酸組成在內(nèi)的性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析研究，通過(guò)連鎖不平衡方法對(duì)來(lái)自6個(gè)全同胞家系的279個(gè)雜交子代進(jìn)行單標(biāo)記(或單倍型)和性狀關(guān)聯(lián)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：有90個(gè)單標(biāo)記-性狀和1個(gè)單倍型-性狀在關(guān)聯(lián)群體中是顯著的，這些標(biāo)記對(duì)表型變異解釋率為1.87%~17.93%；來(lái)自Cofad2-A、CoSAD1和CoSAD2的6個(gè)SNP標(biāo)記性狀關(guān)聯(lián)(Q<0.10)也在驗(yàn)證群體中得到成功驗(yàn)證。董樂(lè)等[26]利用49個(gè)多態(tài)性較高的EST-SSR標(biāo)記對(duì)浙江紅花油茶17個(gè)經(jīng)濟(jì)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，廣義線性模型(GLM)中共檢測(cè)到21個(gè)SSR標(biāo)記與浙江紅花油茶的9個(gè)性狀極顯著關(guān)聯(lián)，表型變異解釋率為13.51%～56.55%；混合線性模型(MLM)中則檢測(cè)到11個(gè)SSR標(biāo)記與上述性狀顯著關(guān)聯(lián)，表型變異的貢獻(xiàn)率為20.39%～57.36%，其中與油品質(zhì)相關(guān)的標(biāo)記有6個(gè)。油茶是異花授粉樹種，容易形成較高的遺傳變異與較低的連鎖不平衡程度，是理想的關(guān)聯(lián)分析作圖樹種。在未來(lái)，可以預(yù)見該技術(shù)將會(huì)廣泛應(yīng)用于油茶產(chǎn)量、品質(zhì)以及抗性等關(guān)鍵目標(biāo)基因的挖掘。

2 油茶多組學(xué)研究

2.1 基因組與轉(zhuǎn)錄組研究

基因組學(xué)的發(fā)展為植物育種等研究開辟了新的分析技術(shù)方法，已被廣泛應(yīng)用于植物育種中。高通量測(cè)序時(shí)代的到來(lái)使得測(cè)序成本大大降低，同時(shí)提高了基因信息的精確性和全面性，因此，越來(lái)越多的植物完成了全基因組測(cè)序。目前，油茶全基因組的數(shù)據(jù)尚未報(bào)道，僅有部分基因組的數(shù)據(jù)。趙松子[27]基于3代測(cè)序技術(shù)完成了普通油茶良種“贛無(wú)1號(hào)”的全基因組測(cè)序，其中酶讀段數(shù)據(jù)40.1 G，亞讀段數(shù)據(jù)40.06 G，測(cè)序正確率為91.41%，與茶樹基因組序列的相似度為93.38%。楊曉蘭等[28]以基因組大小水稻“日本晴”為內(nèi)標(biāo)對(duì)15個(gè)普通油茶品種的基因組大小進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)基因組的大小在6 411.99~9 398.58 Mbp之間且品種間存在顯著差異?，F(xiàn)有的普通油茶部分基因組數(shù)據(jù)和基因組大小為油茶全基因組的組裝提供參考依據(jù)。

轉(zhuǎn)錄組分析是研究植物表型的方法之一，對(duì)油茶轉(zhuǎn)錄組測(cè)序后獲得的大量unigene序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，將為分析油茶基因表達(dá)調(diào)控模式以及調(diào)控元件的變化規(guī)律，揭示不同發(fā)育期基因表達(dá)差異等研究打下良好基礎(chǔ)，以及進(jìn)一步為油茶定向育種提供理論依據(jù)和技術(shù)指導(dǎo)。2011年，陳英等[29]通過(guò)新一代高通量454測(cè)序技術(shù)獲得大量的油茶、浙江紅花油茶和短柱茶EST序列，經(jīng)拼接后油茶、浙江紅花油茶和短柱茶分別獲得contig 15 733條、19 397條和14 779條，GO注釋表明3個(gè)物種的序列都較多的被注釋到分子功能類別。同年，林萍等[30]采用solexa技術(shù)對(duì)普通油茶“長(zhǎng)林4號(hào)”無(wú)性系發(fā)育中的種子進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，獲得80 310條unigenes，其中確定編碼蛋白功能的有21 789條，主要涉及新陳代謝、遺傳信息加工、細(xì)胞代謝等相關(guān)代謝途徑。2014年，Xia等[31]采用新一代高通量454 GS-FLX測(cè)序技術(shù)，率先對(duì)普通油茶的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了大規(guī)模平行測(cè)序，從中鑒定出2 345個(gè)SSRs、20 250個(gè)SNPs和16 906個(gè)InDels，與茶樹開展比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，兩者之間共存在3 022個(gè)直系同源基因?qū)?。隨后，有學(xué)者通過(guò)高通量測(cè)序?qū)ζ胀ㄓ筒柽M(jìn)行了花發(fā)育[32]和優(yōu)良單株[33]轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。至2020年，Gong等[34]完成了普通油茶種子的全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，獲得40 143個(gè)Isoforms，其中37 982個(gè)獲得了功能注釋，271個(gè)(2.43%)屬于脂肪酸代謝；鑒定出783個(gè)選擇性剪接事件(AS)和1 910個(gè)長(zhǎng)非編碼核糖核酸(lncRNAs)；蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析表明，上調(diào)的WRI1、MYB和ZIP轉(zhuǎn)錄因子在油脂合成中起關(guān)鍵作用。通過(guò)PacBio Iso-Seq鑒定的基因、AS事件和lncRNAs為未來(lái)油茶高含油量和最佳脂肪酸組成的基因發(fā)現(xiàn)和分子育種研究提供了寶貴的遺傳資源。

2.2 蛋白質(zhì)組

樹木不同發(fā)育階段的蛋白質(zhì)組分和含量是有所變化的，在特定階段會(huì)有特異蛋白質(zhì)的出現(xiàn)或消失，由此可見，在一定程度上特異蛋白能解釋植物不同階段功能轉(zhuǎn)變的機(jī)理[35]。利用蛋白質(zhì)組學(xué)、質(zhì)譜和生物信息學(xué)技術(shù)，比較分析油茶芽苗砧嫁接口不同發(fā)育時(shí)期蛋白質(zhì)組的變化，有助于了解芽苗砧嫁接愈合的生理生化代謝機(jī)制。Feng等[36]以不同發(fā)育時(shí)期的油茶芽苗砧嫁接口為材料，建立了相應(yīng)蛋白質(zhì)雙向凝膠電泳技術(shù)體系，對(duì)嫁接口愈合差異蛋白質(zhì)進(jìn)行了分析與研究，并為今后調(diào)控油茶芽苗砧嫁接愈合、加快育種進(jìn)度打下基礎(chǔ)。油茶是一個(gè)自交不親和的樹種，利用蛋白質(zhì)組學(xué)探究油茶自交親和性具有重要意義。鄭碧娟[37]以油茶閩43為材料，發(fā)現(xiàn)在自交花粉管發(fā)育過(guò)程中有一個(gè)差異蛋白（26S蛋白酶體）始終高度表達(dá)，推測(cè)與花粉管生長(zhǎng)受抑制有一定的關(guān)系。這一發(fā)現(xiàn)對(duì)油茶生產(chǎn)配置及遺傳改良育種有著重要意義。何藝凡等[38]對(duì)油茶種仁蛋白進(jìn)行電泳，分析發(fā)現(xiàn)有21個(gè)蛋白點(diǎn)在生理落果中下調(diào)，成功鑒定了17個(gè)蛋白；隨后建立了一套適合普通油茶種仁雙向電泳的體系[39]，該研究從蛋白質(zhì)水平探究了油茶生理落果的原因，為解析油茶產(chǎn)量形成機(jī)理提供了一條新的思路。

3 油茶農(nóng)藝性狀相關(guān)基因的研究

3.1 油茶籽含油率相關(guān)基因

當(dāng)前油茶生產(chǎn)中最突出的問(wèn)題是茶油總產(chǎn)量很低。因此，高含油率品種選育是油茶育種面臨的主要問(wèn)題之一，而挖掘與油脂合成及種子含油率相關(guān)的目標(biāo)基因，從而開展高油率油茶的遺傳改良將會(huì)是今后油茶育種的一個(gè)重要策略。三酰甘油(TAG)是茶油的主要成分。二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶(DGAT)是催化TAG合成途徑唯一的限速酶，直接影響TAG的累積。劉凱等[40]基于已有的Co-DGAT1基因全長(zhǎng)cDNA序列，通過(guò)雙酶切位點(diǎn)特異引物擴(kuò)增出Co-DGAT1基因的開放讀碼框，定向克隆到轉(zhuǎn)化載體，并導(dǎo)入農(nóng)桿菌LBA4404，為下一步獲得轉(zhuǎn)基因植株，通過(guò)分子手段培育高含油率的油茶新品種提供重要的理論基礎(chǔ)和技術(shù)支撐。長(zhǎng)期選育含油量高的油茶品種，能夠增加Rubisco基因的轉(zhuǎn)錄豐度從而提高光合效率，增加油脂合成，最終達(dá)到間接提高產(chǎn)油量的目的[41]。Chen等[42]從油茶葉片中分離克隆了Rubisco rbcL和rbcS基因的cDNA序列，分別命名Co-rbcL和Co-rbcS，它們具有作為早期高油產(chǎn)量油茶品種選擇分子標(biāo)記的潛力，結(jié)合凈光合速率測(cè)定，這種早期鑒定將會(huì)縮短育種時(shí)間并提高育種效率。

3.2 茶油品質(zhì)相關(guān)基因

未來(lái)油茶品質(zhì)育種，將會(huì)是油茶育種的重要課題。油茶富含油酸、亞油酸和α-亞麻酸等不飽和脂肪酸以及角鯊烯和生育酚等三萜類活性物質(zhì)。這些對(duì)人體有益的成分都可用來(lái)衡量茶油品質(zhì)的好壞。α-亞麻酸是人體自身無(wú)法合成的必需脂肪酸，具有降血脂血壓和增強(qiáng)智力等多方面的作用。江南等[43]根據(jù)FAD2、FAD3、LOX等關(guān)鍵酶功能基因調(diào)控α-亞麻酸代謝過(guò)程的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)的反應(yīng)，結(jié)合油茶種子調(diào)控此代謝的關(guān)鍵酶基因不同時(shí)期基因表達(dá)差異分析，繪制了油茶種子α-亞麻酸代謝過(guò)程關(guān)鍵酶功能基因調(diào)控途徑。硬脂酰-ACP脫飽和酶(stearoyl-ACP desaturase,SAD)是飽和脂肪酸轉(zhuǎn)化為不飽和脂肪酸的關(guān)鍵酶之一。為了深入研究油茶不飽和脂肪酸合成的分子機(jī)制，陳鴻鵬等[44]進(jìn)行了油茶SAD(CoSAD)原核表達(dá)載體、植物表達(dá)載體和RNA干擾載體的構(gòu)建，采用PCR擴(kuò)增及雙酶切方法對(duì)這些載體進(jìn)行鑒定，并對(duì)基因轉(zhuǎn)化后的植株進(jìn)行轉(zhuǎn)基因鑒定和功能分析，明確了CoSAD基因具有調(diào)控飽和脂肪酸向不飽和脂肪酸轉(zhuǎn)化的功能。FAD2(fatty acid desaturase 2)是油茶種子發(fā)育過(guò)程中油酸生成亞油酸的關(guān)鍵基因。目前，培育高油酸含量油茶品種的主要途徑就是構(gòu)建FAD2基因表達(dá)載體，并將其反義基因轉(zhuǎn)入油料作物中[45]。因此，通過(guò)對(duì)油茶FAD2(CoFAD2)基因進(jìn)行克隆，并分析其結(jié)構(gòu)和生物功能，可為改善油茶的茶油品質(zhì)提供理論支持的同時(shí)也為油茶的分子育種提供了新的基因資源。王仲偉等[46]基于油茶轉(zhuǎn)錄組454測(cè)序數(shù)據(jù)注釋獲得了油茶FAD2基因的cDNA全長(zhǎng)，經(jīng)克隆得到的油茶FAD2基因CoFAD2-2(登錄號(hào):JQ739518)不同于已知的FAD2-1基因(KJ995981)，但與油橄欖(Olea europaeaLinn.)的FAD2-2基因有著較近的親緣關(guān)系；經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)CoFAD2-2基因相對(duì)表達(dá)量與油茶種子中亞油酸相對(duì)含量變化一致。隨后王仲偉等[47]又以浙江紅花油茶轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，克隆得到了CcFAD2基因(KC342951)，其研究發(fā)現(xiàn)浙江紅花油茶CcFAD2蛋白與其他油料植物FAD2蛋白均存在3個(gè)保守的組氨酸簇，同時(shí)與普通油茶一樣，浙江紅花油茶CcFAD2基因相對(duì)表達(dá)量與籽仁亞油酸相對(duì)含量的變化高度吻合。除油脂合成方面的研究外，還有學(xué)者對(duì)茶氨酸和角鯊烯做了研究。馬林龍等[48]對(duì)大別山地區(qū)野生幼年與成年油茶根、葉中的茶氨酸進(jìn)行檢測(cè)，并結(jié)合分子生物學(xué)手段對(duì)油茶中茶氨酸合成酶(theanine synthetase，TS)基因進(jìn)行克隆與生物信息學(xué)分析，研究發(fā)現(xiàn)只有幼年的油茶根中含有茶氨酸，而油茶TS基因序列與茶樹谷氨酰胺合成酶(AB117934)基因和TS(DD410896)序列的同源性達(dá)到98%。目前，有關(guān)油茶角鯊烯的相關(guān)研究報(bào)道極少，僅局限在調(diào)控萜類代謝的WRKY基因分析[49]。

3.3 控制成花基因

油茶屬于自交不親和物種，授粉受精會(huì)受到環(huán)境條件的影響，最終影響果實(shí)的產(chǎn)量。因此利用現(xiàn)代分子生物技術(shù)進(jìn)一步研究油茶花發(fā)育特點(diǎn)、成花途徑、成花關(guān)鍵基因以及花期和花器官形成的調(diào)控，對(duì)了解油茶花果調(diào)控規(guī)律及提高油茶結(jié)實(shí)效率具有重要作用。胡玉玲等[32]開展油茶成花相關(guān)基因的表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)T基因(60063)是油茶成花的關(guān)鍵基因，PI基因(56059)與雄蕊發(fā)育關(guān)系緊密，這為油茶成花機(jī)制研究提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。為了解影響果實(shí)產(chǎn)量的花蕾中的基因發(fā)掘和表達(dá)水平與含油率之間的聯(lián)系，Xie等[50]鑒定了2 395個(gè)差異表達(dá)基因(DEGs)，發(fā)現(xiàn)包括AP2在內(nèi)的12種已識(shí)別的轉(zhuǎn)錄因子涉及花的發(fā)育；脂肪酸合成中FabB，F(xiàn)abF，F(xiàn)abZ和AccD這些關(guān)鍵DEG均在花蕾中有較高表達(dá)，且與果實(shí)的高含油率相關(guān)?；ㄉ帐侵参锘ê凸麑?shí)的主要色素成分，不僅可以吸引授粉者和種子傳播者，還有著過(guò)濾紫外線、抵御病原菌、提高植物育性的作用。Wang等[51]基于浙江紅花油茶轉(zhuǎn)錄組，鑒定并克隆了9種花色苷生物合成途徑相關(guān)基因(PAL，CHS1，CHS2，CHS3，CHI，F(xiàn)3H，DFR，ANS和UFGT)，研究結(jié)果不僅豐富了油茶基因資源，而且為進(jìn)一步研究花色苷的生物合成提供了有價(jià)值的信息。

4 問(wèn)題與展望

4.1 油茶良種選育應(yīng)重視遺傳學(xué)基礎(chǔ)

目前油茶育種主要表現(xiàn)為主推良種數(shù)量多，而良種選育又在持續(xù)不斷的進(jìn)行之中。近年來(lái)，油茶的良種選育工作又有了新的進(jìn)展，如湖南省選育出“華碩”“金華”“華鑫”等華系列油茶良種[52-54]，云南省林業(yè)科學(xué)院油茶研究所選育出5個(gè)云油茶系列油茶新品種[55]。貴州省選育出黎平系列油茶品種[56]，湖北省的“陽(yáng)新米茶202”“陽(yáng)新桐茶208”和“谷城大紅果8號(hào)”[57-58]以及填補(bǔ)了陜南地區(qū)油茶良種空白的“漢油”系列[59]。另外，紅花油茶的育種工作也方興未艾，除宛田紅花油茶(C．polyodonta)和浙江紅花油茶尚未形成品種，騰沖紅花油茶已選育出騰沖系列優(yōu)良無(wú)性系[60]，廣寧紅花油茶同時(shí)選育出‘紅羽1號(hào)’[61]和‘紅羽2號(hào)’[62]兩個(gè)新品種?，F(xiàn)有油茶良種選育表明，加強(qiáng)對(duì)油茶種質(zhì)資源尤其是尚未形成優(yōu)良品種或家系的育種材料的搜集和研究，將有利于油茶新品種選育和利用。此外，在實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中，油茶仍然存在種質(zhì)混雜、采穗圃建設(shè)管理難度大、良種水平降低和實(shí)際產(chǎn)量下降等一系列問(wèn)題。究其原因，如選擇育種評(píng)價(jià)指標(biāo)相對(duì)單一，評(píng)價(jià)過(guò)于依賴表型性狀而忽視遺傳基礎(chǔ)，且良種確定過(guò)程區(qū)域化試驗(yàn)的規(guī)模、布局不夠系統(tǒng)與充分，從而影響了品種選育的精準(zhǔn)度。針對(duì)油茶物種繁多，長(zhǎng)期的選擇進(jìn)化，復(fù)雜的遺傳背景，我們必須重視油茶種質(zhì)資源和育成品種的遺傳背景研究。從分子水平開展準(zhǔn)確的遺傳評(píng)價(jià)，可為品系配置、子代變異以及雜種優(yōu)勢(shì)預(yù)測(cè)等提供較好的參考價(jià)值，也是成功實(shí)現(xiàn)育種目標(biāo)的重要基礎(chǔ)，而這正是最近幾年大量油茶分子標(biāo)記研究涌現(xiàn)的主要原因。從遺傳標(biāo)記的類型分析，穩(wěn)定、可靠的分子標(biāo)記將會(huì)更廣泛的應(yīng)用于油茶遺傳學(xué)研究，如國(guó)際植物新品種權(quán)保護(hù)聯(lián)盟(UPOV)BMT分子測(cè)試指南和國(guó)內(nèi)《植物品種鑒定DNA指紋方法總則》(NY/T2594-2016)已明確只推薦SSR和SNP分子標(biāo)記[63]。另外，由于油茶品種類群的多倍化特性，適用于多倍體的基因分型技術(shù)，更合適的生物學(xué)統(tǒng)計(jì)軟件的研發(fā)，也將會(huì)是未來(lái)研究的熱點(diǎn)。

4.2 復(fù)雜倍性下油茶全基因組測(cè)序策略

隨著油茶產(chǎn)業(yè)的不斷發(fā)展，油茶育種的目標(biāo)性狀必將趨于多元化，僅靠常規(guī)育種難以實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)，而分子輔助育種可以通過(guò)對(duì)各優(yōu)良性狀進(jìn)行綜合改良來(lái)滿足人們的需求。實(shí)現(xiàn)植物分子輔助育種的基礎(chǔ)是要清楚該植物的遺傳背景，而油茶的遺傳背景非常復(fù)雜，如何獲取遺傳背景將是油茶分子育種成敗的關(guān)鍵。高通量測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展讓我們完成了眾多植物全基因組測(cè)序?；谌蚪M信息開發(fā)遺傳標(biāo)記和挖掘關(guān)鍵基因?qū)罄m(xù)分子育種的研究具有里程碑的意義。當(dāng)前，油茶尚未完成全基因組測(cè)序，復(fù)雜的倍性和較大的基因組[64]阻礙了油茶全基因組測(cè)序工作的進(jìn)行，而全基因組數(shù)據(jù)的缺乏又導(dǎo)致油茶全基因組關(guān)聯(lián)選擇等研究無(wú)法開展。從倍性相對(duì)簡(jiǎn)單的如紅花油茶等二倍體油茶物種入手完成全基因組測(cè)序，并以此類物種作為油茶模式種將有望解決油茶全基因組測(cè)序的問(wèn)題。

4.3 油茶農(nóng)藝性狀形成關(guān)鍵基因的挖掘與應(yīng)用

農(nóng)藝性狀形成的分子機(jī)制是分子育種技術(shù)體系建立的重要基礎(chǔ)，對(duì)控制油茶重要農(nóng)藝性狀關(guān)鍵基因的定位、克隆和功能分析可以為分子育種提供實(shí)用標(biāo)記。目前，油茶農(nóng)藝性狀形成分子機(jī)制研究主要集中在品質(zhì)和產(chǎn)量方面，還缺乏對(duì)病蟲害及逆境等抗性方面的研究，且研究深度不夠，尤其對(duì)復(fù)雜農(nóng)藝性狀分子遺傳基礎(chǔ)的認(rèn)識(shí)還相對(duì)有限，急需在油茶品質(zhì)和非生物脅迫抗性等性狀形成的遺傳和分子基礎(chǔ)等方面開展深入研究。在方法方面，運(yùn)用關(guān)聯(lián)分析與功能基因標(biāo)記進(jìn)行分子標(biāo)記輔助育種的優(yōu)勢(shì)在于選擇效率高和選擇效果好，且可不用依賴于構(gòu)建作圖子代群體，因此關(guān)聯(lián)分析聯(lián)合功能基因標(biāo)記將是今后分子輔助育種發(fā)展的一個(gè)方向。前人通過(guò)篩選和研究油茶重要農(nóng)藝性狀相關(guān)基因及其表達(dá)機(jī)理，闡明基因在種質(zhì)資源中的各種等位變異類型及其遺傳效應(yīng)，為目標(biāo)基因關(guān)聯(lián)分析提供標(biāo)記、基因和其它遺傳信息。因此，進(jìn)一步在油茶控制重要經(jīng)濟(jì)和生長(zhǎng)性狀基因的研究基礎(chǔ)上，甚至今后在全基因組水平，通過(guò)關(guān)聯(lián)分析從群體、個(gè)體、細(xì)胞、分子水平上系統(tǒng)解析油茶種質(zhì)遺傳特性，挖掘優(yōu)異基因并將常規(guī)育種與分子設(shè)計(jì)育種相結(jié)合將是油茶育種研究的一個(gè)重要趨勢(shì)。