lncRNA ACTA2-AS1通過(guò)靶向下調(diào)miR-586表達(dá)抑制子宮內(nèi)膜癌生物學(xué)行為的研究

劉雨欣 秦 黎 王 琳 蔡 晶 余 莉

子宮內(nèi)膜癌是對(duì)女性健康生命危害最大的惡性腫瘤之一，其細(xì)胞增殖較快、遷移性較強(qiáng)，因而惡性程度較高[1]。子宮內(nèi)膜癌位居?jì)D科生殖系統(tǒng)腫瘤第2位，術(shù)后復(fù)發(fā)率高，患者5年生存率較低[2]。針對(duì)子宮內(nèi)膜癌分子機(jī)制的研究，對(duì)于子宮內(nèi)膜癌的分子靶向治療具有重要意義。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)是一種具有生物學(xué)功能的非編碼RNA，長(zhǎng)度往往超過(guò)200個(gè)核苷酸[3]。lncRNA廣泛參與細(xì)胞的發(fā)育、增殖、遷移、衰老等生命活動(dòng)，其在癌癥的起始和發(fā)展環(huán)節(jié)具有重要調(diào)控功能[4, 5]。對(duì)lncRNA的深入研究可能為子宮內(nèi)膜癌的篩查、診療、預(yù)后評(píng)估提供新的生物學(xué)標(biāo)志物。目前已有報(bào)道顯示，ACTA2-AS1在肝癌、肺腺癌、結(jié)腸腺癌等多種癌癥組織或細(xì)胞株中低表達(dá)，發(fā)揮抑癌基因的作用[6～8]。ACTA2-AS1在子宮內(nèi)膜癌組織和細(xì)胞株中的表達(dá)和作用尚未明確。本研究旨在探究ACTA2-AS1在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)，分析ACTA2-AS1通過(guò)靶向調(diào)控miR-586對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，為子宮內(nèi)膜癌的診療提供新的分子靶點(diǎn)。

材料與方法

1.細(xì)胞與試劑:子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞HEC-1A、Ishikawa、AN3CA、HEC-1B及人正常子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞ESC購(gòu)自美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)物保藏中心。qRT-PCR試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司。ACTA2-AS1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒和空白質(zhì)粒(pGPU6)、miR-586 mimic、miR-NC mimic、熒光素酶報(bào)告載體(ACTA2-AS1-wt、ACTA2-AS1-mut)購(gòu)自上海吉瑪生物制藥有限公司。Lipofectamine 2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。雙熒光素酶報(bào)告基因試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司。RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清、DMEM/F12培養(yǎng)基、購(gòu)自美國(guó)Amresco公司。細(xì)胞周期試劑盒購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司。一抗PTEN、β-tubulin、p-PI3K、p-AKT、p-mTOR及山羊抗兔二抗均購(gòu)自美國(guó)CST公司。

2.ACTA2-AS1在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá):采用GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)(http:∥gepia.cancer-pku.cn/index.html)分析ACTA2-AS1在子宮內(nèi)膜癌組織和癌旁組織的表達(dá)水平。

3.細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染:子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株Ishikawa、AN3CA、ESC細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，HEC-1A、HEC-1B細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育。取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的AN3CA細(xì)胞接種于12孔板，待AN3CA細(xì)胞生長(zhǎng)融合度為30%，根據(jù)Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒(NC組)或ACTA2-AS1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒(ACTA2-AS1組)。

4.qRT-PCR檢測(cè)ACTA2-AS1、miR-586、PTEN mRNA相對(duì)表達(dá):用TRIzol溶液提取組織和細(xì)胞樣品總RNA，進(jìn)一步反轉(zhuǎn)錄為cDNA。ACTA2-AS1、PTEN mRNA以GAPDH為內(nèi)參，miR-586以U6為內(nèi)參，根據(jù)qRT-PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)擴(kuò)增檢測(cè)，以2-ΔΔCt公式計(jì)算ACTA2-AS1、miR-586相對(duì)表達(dá)。ACTA2-AS1上游引物為5′-GTTCTGGAGGCTGGCTTGATATGG-3′，下游引物為5′-TCCTTCA-TCGGTAGGCAACAAACG-3′；U6上游引物為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物為5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；miR-586上游引物為5′-ACACTCCAGCTGGGTATGCATTGTATTTTTAGGT-3′，下游引物為5′-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3′；GAPDH上游引物為5′-CTCAGACACCATGGGGAAGGTGA-3′，下游引物為5′-ATGATCTTGAGGCTGTTGTCATA-3′；PTEN上游引物為5′-AGGGACGAACTGGTGTAATGA-3′，下游引物為5′-CTGGTCCTTACTTCCCCATAGAA-3′。

5.流式細(xì)胞法檢測(cè)AN3CA細(xì)胞周期:NC組和ACTA2-AS1組AN3CA細(xì)胞用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液洗滌5次，用預(yù)冷的乙醇溶液重懸、固定，在4℃下孵育13h。用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液洗滌5次，用200μl RNA酶溶液重懸，37℃下孵育20min，加入40μl溴化丙錠溶液，4℃下孵育20min，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)AN3CA細(xì)胞周期。

6.細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)AN3CA細(xì)胞遷移能力:NC組和ACTA2-AS1組AN3CA細(xì)胞鋪于12孔板上，AN3CA細(xì)胞生長(zhǎng)融合度為90%，用10μl的無(wú)菌移液槍槍頭在12孔底劃線，保證劃痕為單層細(xì)胞。用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液洗滌5次，至沒(méi)有脫落的細(xì)胞存在。添加不含胎牛血清的培養(yǎng)基，在100倍倒置顯微鏡下，于0h和24h拍照并測(cè)量細(xì)胞遷移距離，計(jì)算細(xì)胞遷移率。

7.雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)驗(yàn)證ACTA2-AS1與靶基因的結(jié)合:運(yùn)用LncBase v.2數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)ACTA2-AS1的靶基因?yàn)閙iR-586。在AN3CA細(xì)胞中，共轉(zhuǎn)染ACTA2-AS1-wt或ACTA2-AS1-mut以及miR-586、miR-NC。共轉(zhuǎn)染48h后，采用細(xì)胞裂解液收集AN3CA細(xì)胞，采用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒分析每組AN3CA細(xì)胞中熒光素酶的相對(duì)活性。

8.Western blot法檢測(cè)PTEN蛋白和PI3K-AKT-mTOR信號(hào)通路蛋白表達(dá):用RIPA裂解液提取ACTA2-AS1組和NC組AN3CA細(xì)胞總蛋白，BCA法分析蛋白濃度，每個(gè)泳道60μg蛋白的上樣量行SDS-PAGE凝膠電泳，將分離蛋白電轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯膜。10%脫脂牛奶封閉0.5h，加入一抗PTEN(1∶1000稀釋)、β-tubulin(1∶3000稀釋)、p-PI3K(1∶1000稀釋)、p-AKT(1∶1000)、p-mTOR(1∶1000)，4℃孵育13h。加入羊抗鼠二抗(1∶5000稀釋)，在室溫下?lián)u床孵育3h。按比例配制ECL顯影發(fā)光液，在暗室內(nèi)曝光、采集圖像。

結(jié) 果

1.ACTA2-AS1在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá):GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)顯示，ACTA2-AS1在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)水平顯著低于癌旁組織(P<0.01,圖1)。

圖1 ACTA2-AS1在子宮內(nèi)膜癌組織和癌旁組織中的表達(dá)水平

2.ACTA2-AS1在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株中的表達(dá):qRT-PCR檢測(cè)顯示，ACTA2-AS1在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞(HEC-1A、Ishikawa、AN3CA、HEC-1B)及正常子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞ESC的表達(dá)分別為0.58±0.07、0.41±0.05、0.18±0.06、0.66±0.08和1.05±0.09(圖2)。與ESC細(xì)胞比較，ACTA2-AS1在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株中的表達(dá)明顯下降(P<0.05)，AN3CA細(xì)胞ACTA2-AS1表達(dá)下降最明顯(P<0.01)，因而采用AN3CA細(xì)胞進(jìn)行研究。

圖2 ACTA2-AS1在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株和正常子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中的表達(dá)水平與ESC細(xì)胞比較，*P<0.05，**P<0.01

3.轉(zhuǎn)染ACTA2-AS1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒對(duì)AN3CA細(xì)胞中ACTA2-AS1表達(dá)的影響:轉(zhuǎn)染ACTA2-AS1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒后，ACTA2-AS1組和NC組AN3CA細(xì)胞中ACTA2-AS1表達(dá)分別為12.26±1.12和1.21±0.20，ACTA2-AS1組ACTA2-AS1表達(dá)顯著高于NC組(P<0.01)。

4.上調(diào)ACTA2-AS1對(duì)AN3CA細(xì)胞周期的影響:流式細(xì)胞法結(jié)果顯示，ACTA2-AS1組和NC組AN3CA細(xì)胞在G0～G1期的細(xì)胞比例分別為61.34%±4.51%和29.73%±3.39%，上調(diào)ACTA2-AS1能明顯提升G0～G1期細(xì)胞比例，誘導(dǎo)G0～G1期停滯(P<0.05，圖3)。

圖3 上調(diào)ACTA2-AS1對(duì)AN3CA細(xì)胞周期的影響A.流式細(xì)胞法；B.細(xì)胞周期比例分析。與NC組比較，*P<0.05，**P<0.01

5.上調(diào)ACTA2-AS1對(duì)AN3CA細(xì)胞遷移能力的影響:細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ACTA2-AS1組和NC組AN3CA細(xì)胞的遷移率分別為40.46%±3.76%和69.54%±6.64%，上調(diào)ACTA2-AS1可抑制AN3CA細(xì)胞的遷移能力(P<0.01,圖4)。

圖4 上調(diào)ACTA2-AS1對(duì)AN3CA細(xì)胞遷移能力的影響A.細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)(×100)；B.細(xì)胞遷移率定量分析

6.ACTA2-AS1對(duì)miR-586的靶向位點(diǎn)預(yù)測(cè):采用LncBase v.2數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)ACTA2-AS1的潛在靶基因，ACTA2-AS1與miR-586具有潛在的互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)(圖5)。

圖5 LncBase v.2數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)ACTA2-AS1的潛在靶基因

7.雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)驗(yàn)證ACTA2-AS1對(duì)miR-586的靶向調(diào)控:雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果顯示，在AN3CA細(xì)胞中，與共轉(zhuǎn)染ACTA2-AS1-wt和miR-NC比較，共轉(zhuǎn)染ACTA2-AS1-wt和miR-586后相對(duì)熒光素酶活性明顯下降(P<0.01)，ACTA2-AS1能夠靶向調(diào)控miR-586(圖6)。

圖6 雙熒光素酶報(bào)告基因法驗(yàn)證ACTA2-AS1對(duì)miR-586的靶向調(diào)控與miR-NC組比較，*P<0.01

8.上調(diào)ACTA2-AS1對(duì)miR-586和PTEN mRNA表達(dá)的影響:qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，ACTA2-AS1組和NC組AN3CA細(xì)胞中miR-586表達(dá)分別為0.21±0.05和1.12±0.09，上調(diào)ACTA2-AS1可抑制miR-586表達(dá)(P<0.01)。ACTA2-AS1組和NC組AN3CA細(xì)胞中PTEN mRNA表達(dá)分別為6.11±1.76和1.23±0.53，上調(diào)ACTA2-AS1可促進(jìn)PTEN mRNA表達(dá)(P<0.01)。

9.上調(diào)ACTA2-AS1對(duì)PTEN蛋白和PI3K-AKT-mTOR信號(hào)通路蛋白表達(dá)的影響:Western blot法檢測(cè)結(jié)果顯示，上調(diào)ACTA2-AS1表達(dá)后，PTEN蛋白表達(dá)升高，PI3K-AKT-mTOR信號(hào)通路蛋白p-PI3K、p-AKT、p-mTOR表達(dá)降低(圖7)。

圖7 上調(diào)ACTA2-AS1對(duì)AN3CA細(xì)胞PTEN蛋白和PI3K-AKT-mTOR信號(hào)通路蛋白表達(dá)的影響

討 論

lncRNA在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮廣泛的基因表達(dá)調(diào)節(jié)功能，其異常表達(dá)可誘導(dǎo)細(xì)胞活動(dòng)的紊亂，引起腫瘤的發(fā)生[9]。不同的lncRNA在同一種腫瘤細(xì)胞中的功能不同，可能為抑癌基因，也可能為癌基因[10]。lncRNA如LA16c-313D11.11在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)水平顯著降低，其可充當(dāng)miR-205-5p的海綿分子，間接增加PTEN基因的表達(dá)，抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的侵襲、遷移和活力[11]。lncRNA如RHPN1-AS1、UCA1、DLX6-AS1、CHL1-AS1等在子宮內(nèi)膜癌組織和細(xì)胞株中表達(dá)均顯著上調(diào)，與子宮內(nèi)膜癌的分期、組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、不良預(yù)后等顯著相關(guān)，促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的周期進(jìn)展、遷移以及侵襲[12～15]。近年來(lái)，ACTA2-AS1已被證實(shí)與多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)。Ying等[8]研究發(fā)現(xiàn)，ACTA2-AS1在肺腺癌組織和細(xì)胞株中低表達(dá)，上調(diào)ACTA2-AS1可抑制肺腺癌細(xì)胞的上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。其可能成為垂體泌乳素瘤發(fā)病機(jī)制的新型生物學(xué)標(biāo)志物。Pan等[6]研究發(fā)現(xiàn)，ACTA2-AS1在結(jié)腸腺癌組織和細(xì)胞株中表達(dá)降低，其可明顯抑制結(jié)腸腺癌細(xì)胞的活力和集落形成能力。

ACTA2-AS1在子宮內(nèi)膜癌中的作用鮮有報(bào)道。本研究通過(guò)GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)，ACTA2-AS1在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)水平明顯低于癌旁組織，且ACTA2-AS1在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株中的表達(dá)水平明顯低于正常子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞，提示ACTA2-AS1表達(dá)的異常改變與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生存在相關(guān)性。本研究利用ACTA2-AS1表達(dá)最低的AN3CA細(xì)胞進(jìn)行了系列細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，上調(diào)ACTA2-AS1表達(dá)可以促進(jìn)G0～G1期細(xì)胞比例增加、抑制細(xì)胞的遷移能力，ACTA2-AS1在子宮內(nèi)膜癌中發(fā)揮抑癌基因的作用。lncRNA通過(guò)與靶微小RNA(miRNA)以不完全或完全的堿基配對(duì)方式，降低miRNA的表達(dá)，調(diào)控細(xì)胞周期、凋亡、遷移等生物過(guò)程[16, 17]。研究ACTA2-AS1的作用機(jī)制，重點(diǎn)在于探究ACTA2-AS1與靶miRNA的相互結(jié)合。本研究通過(guò)LncBase v.2數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)，ACTA2-AS1與miR-586可能互補(bǔ)結(jié)合。Yang等[18]研究發(fā)現(xiàn)，miR-586可以促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移，同時(shí)抑制骨肉瘤細(xì)胞的凋亡，發(fā)揮癌基因作用。

本研究通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)ACTA2-AS1可互補(bǔ)結(jié)合miR-586。qRT-PCR結(jié)果也證明了，ACTA2-AS1能負(fù)性調(diào)控miR-586的表達(dá)。這些結(jié)果提示ACTA2-AS1能直接靶向作用miR-586。Yu等[19]研究發(fā)現(xiàn)，miR-586通過(guò)靶向結(jié)合PTEN mRNA的非翻譯區(qū)，干擾PTEN基因表達(dá)，促進(jìn)癌癥的發(fā)生。本研究中qRT-PCR和Western blot法均顯示上調(diào)ACTA2-AS1后，PTEN基因表達(dá)降低，進(jìn)一步證明ACTA2-AS1靶向作用miR-586。Zheng等[20]研究發(fā)現(xiàn)，PTEN通過(guò)影響PI3K-AKT-mTOR信號(hào)通路的活化，抑制子宮內(nèi)膜癌的進(jìn)展。本研究中Western blot法檢測(cè)結(jié)果顯示，上調(diào)ACTA2-AS1后，PI3K-AKT-mTOR信號(hào)通路活化被抑制。

綜上所述，本研究觀察到ACTA2-AS1在子宮內(nèi)膜癌組織和細(xì)胞株中存在異常低表達(dá)。對(duì)于存在PI3K-AKT-mTOR信號(hào)通路的子宮內(nèi)膜癌類(lèi)型，上調(diào)ACTA2-AS1表達(dá)通過(guò)靶向調(diào)控miR-586，促進(jìn)PTEN基因表達(dá)和抑制PI3K-AKT-mTOR信號(hào)通路活化，抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞周期和遷移。ACTA2-AS1可能為子宮內(nèi)膜癌的靶向治療提供了新的靶點(diǎn)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。