心室減負荷對缺血性心力衰竭MMPs/TIMPs的影響

劉永輝 孟嘉天 孟自力 李 強 鄭 浩 王浩東 邸紅芹

心臟輔助裝置特別是左心輔助裝置(LVAD)除了作為心臟移植的“橋梁”外，還可作為治療終未期心臟病的最終手段，但是其機制還沒有完全清楚，而且，LVAD 對缺血性心肌病來說，遠較其他病因的心臟病的療效差[1,2]。

心室重塑被認為是各種病因?qū)е峦砥谛呐K功能衰竭共同的發(fā)病機制， 而與心室重塑的調(diào)控最為密切是基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metallopmteinases，MMPs)及其抑制物(tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMPs)，兩者均是調(diào)控細胞外基質(zhì)代謝的重要酶類，它們之間的協(xié)調(diào)平衡在心肌塑形、血管塑形、血管形成等方面起著重要作用，與心力衰竭心臟的疾病發(fā)展過程密切相關(guān)[3,4]。本研究選用缺血性心肌病模型來進行減負荷，以探討減負荷對心室重塑中MMPs-TIMPs 軸的影響。

材料與方法

1.實驗動物：本實驗所使用的動物均為成年雄性同系lewis大鼠，首次手術(shù)前體質(zhì)量180g～220g，由北京市維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供。所有術(shù)前、術(shù)后實驗動物均在筆者醫(yī)院實驗動物中心飼養(yǎng)。所有與實驗動物相關(guān)的處理均符合《北京市實驗動物管理條例》(1996年10月)。所有的動物實驗均得到動物委員會的批準(zhǔn)。

2.實驗試劑及配方：異氟醚吸入麻醉劑購自美國百特(Baxter)公司，溴化乙錠(EB)購自美國Sigma公司，利多卡因(100毫克/支)國產(chǎn)，嗎啡注射液，國產(chǎn)，10mg/1ml，溶于10ml 0.9%NaCl注射液備用。注射用長效青霉素(120萬單位/支)購自墨西哥Lakinter公司。4%多聚甲醛：A液(8%多聚甲醛)以多聚甲醛干粉加蒸餾水配制，56℃水浴加溫同時加入適量1mol/L的NaOH促進多聚甲醛溶解；B液(0.2mol/L PBS)每1000ml中溶解有NaH2PO45.928g，Na2HPO457.996g及NaCl 2g。A液和B液等比例混合即可，保存于4℃冰箱備用。

3.大鼠心肌梗死模型的制備：使用50ml針筒作為呼吸面罩連接683型小動物呼吸機，以氧氣和異氟醚的混合氣體3L/min進行維持吸入麻醉[5,6]。麻醉成功后大鼠右側(cè)臥位，連接心電監(jiān)測，消毒鋪巾。經(jīng)第5肋骨間逐層入胸。以左心耳下緣平齊位置為定位標(biāo)記，用7-0滑線試結(jié)扎前降支，以心臟前壁局部顏色轉(zhuǎn)為蒼白為標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)扎后可見心電示波有心肌梗死表現(xiàn)，大部分情況下出現(xiàn)室性心律失常。當(dāng)左心室前壁部分顏色轉(zhuǎn)為蒼白且出現(xiàn)心電示波為心肌梗死時才能確認本模型制作成功。7×17絲線逐層關(guān)胸。

4.心力衰竭模型的制備及實驗分組[5,6]：將形成24 只缺血性心肌病心力衰竭模型動物，隨機分為兩組，即減負荷組(n=14)與心力衰竭組 (n=10)，前者通過異位心臟移植的方法，形成左心室減負荷模型；后者不進行心臟移植?？瞻讓φ战M(n=8)，大鼠接受開胸手術(shù)，但是不結(jié)扎冠狀動脈。2周后，移植后的心力衰竭心臟、未移植的心力衰竭心臟、及正常心臟分別進行取材進行分析。

5.心功能的檢測[7]：用心臟超聲檢測心力衰竭模型的心臟功能，用Langendoff模型測定心臟減負荷后的心臟功能，使用Powerlab配套軟件(chart 4.0 for windows)計算每個測定點收縮末壓力、舒張末壓力、收縮末dp/dt、舒張末dp/dt以及發(fā)展壓[7]。

6.TMPs 及TIMPs 的基因表達：從心臟組織提取總RNA，通過反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)，將mRNA反轉(zhuǎn)錄形成cDNA,即取2μg總RNA 在MMLV反轉(zhuǎn)錄酶(Promega)、Oligo(dT)15 37℃下孵育 1h，形成cDNA[3,8]。用5μl cDNA 在Tag DNA多聚酶下行PCR。GAPDH作內(nèi)對照，檢測MMP-1、MMP-2、MMP-7、MMP-9以及TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3。每個PCR產(chǎn)物用10μl進行瓊脂糖凝膠電泳，用紫外透照燈進行相應(yīng)的分析[9,10]。

7.Western blot 法檢測分析：取適量冰凍樣品，置入細胞裂解液、勻漿、離心后，取上清液行濃度測定[8,11]。用抗 TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3、MMP-1、MMP-2、MMP-7、MMP-9 的抗體，作為一抗，用辣根過氧化物酶標(biāo)記的相應(yīng)抗體作為二抗，EB染色，拍照，密度掃描。計算出待測基因表達量與相應(yīng)GADPH表達量的比值。

結(jié) 果

1.3組大鼠心臟功能變化：從心臟超聲結(jié)果(圖1A)可見， 與對照組比較，移植前心力衰竭組與減負荷組的FS及EF有明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000)，但是，心力衰竭組與減負荷組FS及EF比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。Langendorff模型心功能評價(圖1C)顯示，減負荷2周后可以改善心臟功能。與心力衰竭組比較，減負荷組的左心室發(fā)展壓有明顯的升高，左心室發(fā)展壓在左心室球囊容積為0.04ml時,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.007)。

圖1 3 組大鼠減負荷前后心功能的改變A.3組大鼠減負荷前射血分數(shù)的變化；B.3組大鼠減負荷前短軸縮短率的變化；C.3組大鼠Langendorff 檢測的變化。與對照組比較，*P<0.01;Δ1mmHg=0.133kPa

2.3組大鼠MMPs 的表達：與對照組比較，心力衰竭組中的MMP-1、MMP-2和MMP-9 基因表達明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，其中以 MMP-2 的上升更為明顯。與心力衰竭組比較，在減負荷后，減負荷組的 MMP-2和MMP-9基因表達水平下降明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。心力衰竭組與減負荷組MMP-7的基因表達水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，詳見圖2。

圖2 3組大鼠MMPs 的不同基因表達水平A.3組大鼠MMPs 的數(shù)據(jù)表達；B.3組大鼠MMPs 的基因變化。與心力衰竭組比較， *P<0.05,**P<0.01；與對照組比較，#P<0.05, ##P<0.01

3.3組大鼠TIMPs的表達：左心室減負荷改變了心力衰竭心臟的TIMP基因的表達 (圖3)。與心力衰竭組比較，減負荷后的TIMP-2 和 TIMP-3 的基因表達明顯升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義，其中TIMP-3升高更為明顯，幾乎達到正常水平。TIMP-1的升高雖然沒有達到統(tǒng)計學(xué)意義，但也有所升高。

圖3 3組大鼠TIMPs不同基因在減負荷2周后的表達水平A.3組大鼠TIMPs 的數(shù)據(jù)表達；B.3組大鼠TIMPs 的基因變化。與心力衰竭組比較，*P<0.05, **P<0.01

4.3組大鼠TIMPs/MMPs的比值：減負荷后 TIMPs/MMPs的比值也有所升高 (圖4)。與心力衰竭組比較，TIMP-1/MMP-1的比值和 TIMP-3/MMP-9 均有明顯升高 (P<0.05)； TIMP-2/MMP-2的比值升高更為明顯 (P<0.01)。

圖4 3組大鼠TIMPs/MMPs 基因表達的比值在減負荷2周后的表達水平A.3組大鼠TIMP1/MMP1的變化；B.3組大鼠TIMP2/MMP2的變化；C.3組大鼠TIMP3/MMP9的變化。與心力衰竭組比較，TIMP-1/MMP-1的比值和 TIMP-3/MMP-9 均有明顯升高 (P<0.05)；TIMP-2/MMP-2 的比值升高更為明顯(P<0.01);與心力衰竭組比較，*P<0.05, **P<0.01

討 論

MMPs及TIMPs出現(xiàn)在心臟、血管等組織中，MMPs及TIMPs之間比例失衡導(dǎo)致正常纖維膠原降解增加及進行性心室擴張，從而影響細胞外基質(zhì)的塑形，在心力衰竭的心室重構(gòu)中發(fā)揮重要作用，因此，調(diào)節(jié)MMPs、TIMPs的活性及比例為限制心室重構(gòu)和預(yù)防心力衰竭提供了一個重要的治療手段[8,12,13]。

本研究通過對大鼠缺血性心力衰竭心臟進行移植構(gòu)建減負荷模型，利用該模型來進行MMPs-TIMPs 軸的分析。在減負荷2周后，心力衰竭心臟MMP-1、 MMP-2和MMP-9的表達下降，TIMP-2和TIMP-3上升， TIMP-3/MMP-9、TIMP-1/MMP-1和TIMP-2/MMP-2三者之比均顯著增高(尤其TIMP-2/MMP-2之比增高更為明顯)，而 TIMP-1和MMP-7 的增高不明顯。因此， 在判斷心肌基質(zhì)穩(wěn)態(tài)方面，TIMPs與 MMPs之比值較單個MMPs或TIMPs 更敏感， TIMPs與 MMPs之比值更能反映基質(zhì)的降解與修復(fù)的穩(wěn)態(tài)，這一點與臨床中患者的心力衰竭心臟的表達水平相似[14]。由于左心輔助的減負荷作用，使心力衰竭的心臟的TIMP-3與 MMP-9 之間不平衡得到恢復(fù)，從而產(chǎn)生了逆向重塑，使心臟功能得到恢復(fù)[1,13,15,16]。Kasten等[17]在擴張型心肌病心力衰竭的研究中發(fā)現(xiàn)，心臟減負荷后可以使心力衰竭后上升的MMP-1、MMP-9下降，TIMP-1 上升，從而維持 MMP-1/TIMP-1 比值的穩(wěn)定。Klotz等[18]在另一擴張型心肌病的實驗中發(fā)現(xiàn)，由于TIMP-3與 MMP-9 之間的不平衡，直接導(dǎo)致了細胞間質(zhì)的降解加重，從而引起了擴張型心肌病。

在某些心肌病的實驗顯示，MMPs的抑制劑可抑制心室塑型、改善心臟功能，這提示降低MMP的活性，其利大于弊[12,13,19]。TIMP-3與MMP-9的比例不協(xié)調(diào)通過加速基質(zhì)的降解而引起擴張型心肌病，反之，在臨床上，由于機械減負荷，使TIMP-3與MMP-9的比例協(xié)調(diào)，調(diào)節(jié)了細胞外基質(zhì)穩(wěn)態(tài)及組織塑型，從而減輕心室重構(gòu)[10,12,20]。本研究中減負荷2周后，VAD支持后心臟的MMPs和TIMPs保持較好的穩(wěn)態(tài)，其可能機制是減輕了心臟組織的張力，減少了細胞滲出，減輕了炎性因子的剌激反應(yīng)，缺血剌激了MMPs的產(chǎn)生，抑制了TIMP-1， MMPs 的降低及TIMPs的升高，可使正常心臟組織的破壞減輕。因此，VAD支持后心臟可以逆轉(zhuǎn)MMPs和TIMPs 的比例，并增加心臟冠注。因此，筆者認為，減負荷改善心室重構(gòu)的機制在于，其可能通過調(diào)節(jié)TIMP-MMPs之間旁分泌的機制，促進基質(zhì)重構(gòu)。

綜上所述，本實驗的心力衰竭后減負荷模型可以模擬臨床上心力衰竭患者進行VAD情況。通過研究證實，MMPs-TIMPs軸在心力衰竭后減負荷中有一定的作用，減負荷可以顯著降低心臟的MMP-1、MMP-2和MMP-9水平，升高TIMP-1和TIMP-3水平，從而使TIMPs-MMPs之比增高，其中，與單一的MMPs 或 TIMPs水平比較，TIMPs-MMPs對評估心肌的基質(zhì)穩(wěn)態(tài)更加敏感。