PD-L1胞外域密碼子優(yōu)化及原核表達(dá)純化

方 宇 呂 艦 王志華

以T細(xì)胞為基礎(chǔ)的免疫系統(tǒng)可識別和破壞異常細(xì)胞，如病原體感染的細(xì)胞和癌細(xì)胞。T細(xì)胞表面的T細(xì)胞受體(T cell receptor, TCR)與靶細(xì)胞表面的主要組織相容性復(fù)合(major histocompatibility complexes, MHC)的特異性結(jié)合在很大程度上受到一系列共刺激和共抑制受體及其配體(也稱為免疫檢查點(diǎn))的控制[1]。免疫檢查點(diǎn)通路通過調(diào)節(jié)抗原特異性T細(xì)胞的數(shù)量和功能活性，在限制組織損傷和維持自身耐受性方面發(fā)揮關(guān)鍵作用[2]。其中，程序性細(xì)胞死亡蛋白1(programmed cell death protein 1, PD-1)/程序死亡配體1(programmed death-ligand 1， PD-L1)通路因其被證明是大量惡性腫瘤的治療靶點(diǎn)而脫穎而出[3]。

1992年，PD-1的基因結(jié)構(gòu)被首次發(fā)現(xiàn)。大量研究發(fā)現(xiàn)，PD-1的特異性配體，PD-L1在許多惡性腫瘤細(xì)胞中大量表達(dá)，PD-1/PD-L1的結(jié)合會導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞免疫逃逸[4]。T細(xì)胞在抗原刺激下活化，產(chǎn)生大量的細(xì)胞因子參與免疫反應(yīng)。但同時(shí)產(chǎn)生的干擾素γ會導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞表面PD-L1增多，腫瘤細(xì)胞表面的PD-L1與T淋巴細(xì)胞表面的PD-1發(fā)生特異性結(jié)合，會抑制效應(yīng)T淋巴細(xì)胞的活性并誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞逃逸機(jī)體的免疫系統(tǒng)。因此，靶向PD-1/PD-L1免疫檢查點(diǎn)，特異性阻斷PD-1/PD-L1信號通路，可轉(zhuǎn)化為臨床抗腫瘤的方法。目前經(jīng)FDA批準(zhǔn)的PD-1/PD-L1單抗藥物已用于治療黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌、腎癌、霍奇金淋巴瘤、頭頸部腫瘤、膀胱癌等[4～6]。

有研究報(bào)道，可通過指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(systematic evolution of ligands by exponential enrichment, SELEX)篩選與靶蛋白特異性結(jié)合的DNA/RNA 適配體，通過阻斷PD-1/PD-L1信號通路從而抑制腫瘤的免疫逃逸[7～10]。SELEX篩選的DNA/RNA 適配體存在以下優(yōu)勢：①可與靶蛋白實(shí)現(xiàn)特異性結(jié)合；②由于相對分子質(zhì)量小，對腫瘤的穿透能力強(qiáng)，且在體內(nèi)易降解消除，免疫原性較低；③與抗體比較，DNA/RNA適配體易于合成、運(yùn)輸、保存等。因此，針對PD-1/PD-L1的胞外結(jié)合區(qū)域篩選特異性的DNA/RNA 適配體，以阻斷腫瘤的免疫逃逸，也為治療惡行腫瘤提供了一種新思路。

本實(shí)驗(yàn)通過體外合成PD-L1胞外域?qū)?yīng)的基因序列，重組轉(zhuǎn)化至E.coli原核表達(dá)載體中，隨后經(jīng)IPTG誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)，通過密碼子優(yōu)化使目的蛋白在菌液上清中表達(dá)，最終采用鎳離子螯合純化樹脂，得到了PD-L1胞外域目的蛋白，為后續(xù)篩選識別PD-L1胞外域特異性DNA/RNA 適配體提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

材料與方法

1.質(zhì)粒、菌株及細(xì)胞載體pET-28a(+)，感受態(tài)E.coli DH5α和E.coli BL21(DE3)購自淼靈質(zhì)粒平臺；293T細(xì)胞取自武漢大學(xué)人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室。

2.主要試劑及儀器：DMEM培養(yǎng)基(高糖，含丙酮酸鈉)、Gibco澳洲胎牛血清、蛋白marker、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、超聲破碎機(jī)購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；青霉素鏈霉素溶液購自武漢賽維爾生物科技有限公司；質(zhì)粒DNA提取試劑盒、膠回收試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；KOD-Plus-Neo購自東洋紡(上海)生物科技有限公司；限制性內(nèi)切酶購自美國NEB公司；DNA marker、RNAiso Plus (trizol)試劑購自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司；瓊脂糖購自廣州賽國生物科技有限公司；卡那霉素、IPTG購自默克生命科學(xué)有限公司；鎳離子螯合純化樹脂(complete His-Tag Purification Resin)購自上海羅氏制藥有限公司。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

3.目的基因擴(kuò)增：293T細(xì)胞采用完全培養(yǎng)基(DMEM培養(yǎng)基加入10%的Gibco澳洲胎牛血清、1%的青霉素鏈霉素溶液)于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。采用RNAiso Plus(trizol)試劑提取293T細(xì)胞總RNA，并根據(jù)試劑說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，作為后續(xù)PCR反應(yīng)的模板。根據(jù)NCBIGene子數(shù)據(jù)庫中人源PD-L1(NM_014143)基因序列，采用Primer3Plus設(shè)計(jì)特異性引物。引物序列為：上游引物為5′-CCTGCAGGGCATTCCAGAAA-3′，下游引物為5′-TCCCTGCTTGAAGATCAGAAGT-3′。按KOD-Plus-Neo配制PCR反應(yīng)體系，98℃預(yù)變性5min，98℃變性30s，60℃退火20s，68℃延伸30s，變性、退火、延伸35個(gè)循環(huán)，最后68℃再延伸5min，獲取目的基因DNA片段。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，隨后通用型DNA純化回收試劑盒純化目的片段。

4.重組質(zhì)粒的構(gòu)建：根據(jù)Uniport數(shù)據(jù)庫中人源PD-L1的細(xì)胞膜外段(Position 19-238氨基酸)，設(shè)計(jì)特異性重組引物。重組引物序列如下：上游引物為5′-TTAAGAAGGAGATATACCATGTTTACTGTCACG-GTTCCCAAG-3′，下游引物為5′-ATGGTCTTTGTAGTCGCTAGCCCTTTCATTTGGAGGATGTGC-3′。將上一步純化得到的DNA片段作為模板，PCR反應(yīng)體系同上，獲取目的基因DNA片段。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，隨后通用型DNA純化回收試劑盒純化重組目的片段。載體雙酶切：將帶有6×His標(biāo)簽的pET-28a(+)載體經(jīng)XbaⅠ和XhoⅠ雙酶切37℃水浴過夜，雙酶切產(chǎn)物進(jìn)行1 %瓊脂糖凝膠電泳，隨后通用型DNA純化回收試劑盒純化得到雙酶切后載體。將重組目的片段與雙酶切載體于37℃反應(yīng)30min，進(jìn)行重組反應(yīng)。隨后將重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)E.coli DH5α，涂布于LB培養(yǎng)基(Kan+)上，于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)12h。次日，將菌液送測序，將測序正確的菌液提取質(zhì)粒DNA。最后將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入感受態(tài)E.coli BL21中，得到PD-L1表達(dá)菌株，命名為pET-28a-PD-L1-6×His，為后續(xù)原核表達(dá)做準(zhǔn)備。

5.重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)條件篩選：將測序正確的pET-28a-PD-L1-6×His菌株置于37℃ 220r/min恒溫?fù)u床中過夜至平臺期。次日按1∶50接種至5ml LB培養(yǎng)基(Kan+)中，37℃220r/min恒溫?fù)u床中培養(yǎng)至對數(shù)增長期，A600值為0.4～0.8，約1.5～2.0h，取少量誘導(dǎo)前菌液樣本保留，隨后按表1所示的誘導(dǎo)條件，繼續(xù)誘導(dǎo)4h。取少量誘導(dǎo)后菌液樣品保留，隨后將剩余菌液12000r/min，離心3min，加入1ml 1×PBS重懸；冰浴超聲，80%功率，超聲2s，停2s，2～5min直至菌液清亮；再次離心12000r/min，離心5min，分離上清和沉淀，取少量上清及沉淀樣品與之前保留的誘導(dǎo)前菌液、誘導(dǎo)后菌液一起與蛋白上樣緩沖液混合均勻，95℃加熱10min制備蛋白樣本，進(jìn)行Western blot法檢測。

表1 誘導(dǎo)條件的篩選

6.大規(guī)模誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)：恒溫?fù)u床中過夜至平臺期的pET-28a-PD-L1-6×His菌株按1∶50接種至500ml LB培養(yǎng)基(Kan+)中，37℃ 220r/min恒溫?fù)u床中培養(yǎng)至對數(shù)增長期，A600值為0.4～0.8，約1.5～2.0h。隨后采用0.1mmol/L IPTG，37℃誘導(dǎo)溫度誘導(dǎo)4h。將菌液分成兩管，7500r/min離心3min收集菌液，分別加入20ml PBS重懸后，冰浴超聲，80%功率，超聲2s，停2s，1h直至菌液清亮, 離心收集上清或沉淀用于后續(xù)純化過程。

7.包涵體洗脫及蛋白復(fù)性：若目的蛋白表達(dá)在沉淀中，便采用變性洗脫包涵體沉淀得到PD-L1目的蛋白。首先采用10ml Buffer A(50mmol/L Tris，pH值為8)重懸包涵體沉淀，12000r/min離心10min棄上清，清洗兩遍；隨后采用10ml Buffer B(50mmol/LTris、2mol/L尿素，pH值為8)重懸包涵體沉淀，12000r/min離心10min棄上清，清洗兩遍；最后采用5ml變性液(0.1mol/L Tris、8mol/L尿素，pH值為8)重懸沉淀，37℃搖床孵育1h使包涵體完全溶解，12000r/min離心10min取上清，得到變性目的蛋白溶液。隨后，將目的蛋白的變性溶液裝于半透膜中，利用尿素濃度梯度配制復(fù)性液A～E，主要成分(1×PBS、10%甘油、2mmol/L還原型GSH、0.2mmol/L GS-SG氧化型)不變，尿素濃度由5、3、2、1、0mol/L依次遞減，每遍均于4℃透析12h。

8.稀有密碼子優(yōu)化：為提高PD-L1胞外域在上清中誘導(dǎo)表達(dá)，進(jìn)行天然蛋白的純化，將PD-L1胞外域?qū)?yīng)核苷酸序列進(jìn)行稀有密碼子優(yōu)化。通用生物公司將稀有密碼子替換、考慮GC比例，優(yōu)化后的基因序列及氨基酸序列如下圖(圖1)。隨后將優(yōu)化后的目的基因序列構(gòu)建至pET-28a表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)化至轉(zhuǎn)化入感受態(tài)E.coli BL21中，得到NewPD-L1表達(dá)菌株，命名為pET-28a-newPD-L1-6×His。

圖1 PD-L1基因序列及氨基酸序列優(yōu)化前后對A.基因序列優(yōu)化前后對比結(jié)果；B.氨基酸序列優(yōu)化前后對比結(jié)果；1.優(yōu)化前基因序列；2.優(yōu)化后基因序列

9.鎳離子螯合純化樹脂純化目的蛋白：將大規(guī)模誘導(dǎo)后得到上清液進(jìn)行后續(xù)的鎳柱親和層析純化目的蛋白，具體純化步驟如下。將3ml鎳離子螯合純化樹脂用20ml平衡液(50mmol/L二水合硫酸二氫鈉、300mmol/L氯化鈉，pH值為8)進(jìn)行柱平衡，流速1ml/min。隨后，將上清液通過鎳離子螯合純化樹脂，流速0.5ml/min，流通兩遍。采用20ml流通液(50mmol/L二水合硫酸二氫鈉、300mmol/L氯化鈉、25mmol/L咪唑，pH值為8)通過樹脂，流速1ml/min，去除樹脂上非特異性蛋白。隨后，用5ml洗脫液(50mmol/L二水合硫酸二氫鈉、300mmol/L氯化鈉、250mmol/L咪唑，pH值為8)，流通樹脂兩遍，收集目的蛋白。最后，將目的蛋白洗脫液裝入透析袋，于透析液中(1×PBS+5%甘油)4℃透析過夜，去除殘留的咪唑，用蔗糖濃縮目的蛋白，液氮速凍后，-80℃保存。

結(jié) 果

1.PD-L1胞外域目的蛋白誘導(dǎo)條件篩選：本研究篩選了IPTG誘導(dǎo)濃度1mmol/L或0.1mmol/L，誘導(dǎo)溫度37℃或16℃。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與誘導(dǎo)前的菌液比較，不同條件下誘導(dǎo)后的菌液在26kDa附近均有特異性目的蛋白過表達(dá)，表明目的蛋白能成功表達(dá)。此外，1mmol/L和0.1mmol/L IPTG均能誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)，兩者比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而在不同誘導(dǎo)溫度下，PD-L1的蛋白表達(dá)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在37℃誘導(dǎo)溫度下，目的蛋白的表達(dá)顯著高于16℃(圖2)。不同的誘導(dǎo)條件下，目的蛋白均在細(xì)菌裂解的沉淀中，而非裂解的上清中。因此，后續(xù)大規(guī)模誘導(dǎo)蛋白表達(dá)采用誘導(dǎo)溫度37℃，0.1mmol/L IPTG。

圖2 PD-L1原核表達(dá)誘導(dǎo)條件篩選A.誘導(dǎo)前細(xì)菌樣本；B.誘導(dǎo)后細(xì)菌樣本；C.誘導(dǎo)后細(xì)菌裂解上清液；D.誘導(dǎo)后細(xì)菌裂解沉淀；M.蛋白marker

2.大規(guī)模誘導(dǎo)表達(dá)及包涵體變性純化：于37℃，0.1mmol/L IPTG條件下大規(guī)模誘導(dǎo)表達(dá)，結(jié)果與圖2一致，目的蛋白均能在沉淀中大量表達(dá)，因此后續(xù)采用溶解包涵體的方式純化目的蛋白。結(jié)果如圖3所示，對PD-L1胞外域目的蛋白的包涵體洗脫后，能得到純度較高的目的蛋白，但在目的蛋白復(fù)性過程中，目的蛋白均析出?？紤]到目的蛋白變性的洗脫方法無法成功純化得到目的蛋白，為此需使目的蛋白表達(dá)于上清中，采用非變性的鎳柱親和層析純化。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中對目的蛋白的基因序列進(jìn)行了稀有密碼子優(yōu)化。

圖3 PD-L1原核表達(dá)大規(guī)模誘導(dǎo)及包涵體洗脫A.誘導(dǎo)前細(xì)菌樣本；B.誘導(dǎo)后細(xì)菌樣本；C.誘導(dǎo)后細(xì)菌裂解上清液；D.誘導(dǎo)后細(xì)菌裂沉淀；E. 誘導(dǎo)后細(xì)胞包涵體洗脫；M.蛋白marker

3.密碼子優(yōu)化后目的蛋白誘導(dǎo)條件篩選：根據(jù)圖1可以發(fā)現(xiàn)，利用密碼子的簡并性，稀有密碼子的優(yōu)化并未改變PD-L1胞外域蛋白氨基酸序列，優(yōu)化后的PD-L1胞外域蛋白保持原有的抗原性及生物活性。經(jīng)過稀有密碼子優(yōu)化后，筆者仍按表1方式篩選目的蛋白誘導(dǎo)表達(dá)條件。篩選結(jié)果如圖4所示，1mmol/L和0.1mmol/LIPTG均能誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)，且兩者比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。不同的誘導(dǎo)溫度，目的蛋白的表達(dá)模式有顯著差別。37℃的誘導(dǎo)溫度下，目的蛋白在沉淀中大量表達(dá)，但在上清裂解液中無明顯表達(dá)。16℃的誘導(dǎo)溫度下，雖然目的蛋白的表達(dá)量大大減少，但在上清裂解液中表達(dá)成功?？紤]到目的蛋白需采用非變性的鎳離子螯合樹脂純化。因此，稀有密碼子優(yōu)化后采用的最佳誘導(dǎo)條件為16℃，0.1mmol/L IPTG，誘導(dǎo)12h。

圖4 基因優(yōu)化后PD-L1原核表達(dá)誘導(dǎo)條件篩選A.誘導(dǎo)溫度37℃的原核表達(dá)結(jié)果；B.誘導(dǎo)溫度16℃的原核表達(dá)結(jié)果。1.誘導(dǎo)前細(xì)菌樣本；2.誘導(dǎo)后細(xì)菌樣本；3.誘導(dǎo)后細(xì)菌裂解上清液；4.誘導(dǎo)后細(xì)菌裂解沉淀；M.蛋白marker

4.鎳離子螯合樹脂純化目的蛋白：經(jīng)稀有密碼子優(yōu)化后，PD-L1胞外域目的蛋白于16℃，0.1mmol/L IPTG條件下進(jìn)行大規(guī)模誘導(dǎo)表達(dá)，并將細(xì)菌超聲裂解后的上清液通過鎳離子螯合樹脂進(jìn)行親和層析純化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5，在該誘導(dǎo)條件下，目的蛋白仍大量表達(dá)于包涵體中，但有小部分以可溶方式表達(dá)于上清中，通過親和層析后，成功得到了較高純度的目的蛋白。綜上所述，通過優(yōu)化稀有密碼子后，可使PD-L1胞外域目的蛋白少量表達(dá)于細(xì)菌裂解上清中，通過鎳柱親和層析可純化純度較高的目的蛋白，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。

圖5 PD-L1原核表達(dá)大規(guī)模誘導(dǎo)及親和層析純化A.誘導(dǎo)前細(xì)菌樣本；B.誘導(dǎo)后細(xì)菌樣本；C.誘導(dǎo)后細(xì)菌裂解上清液；D.誘導(dǎo)后細(xì)菌裂沉淀；E. 誘導(dǎo)后細(xì)菌裂解上清液親和層析純化；M.蛋白marker

討 論

目前，PD-1/PD-L1免疫檢查點(diǎn)療法仍存在很多問題，如不同類型的腫瘤對PD-1/PD-L1抗體的敏感程度不同；免疫系統(tǒng)的非特異性激活[11～13]。某些患者接受治療后加速腫瘤進(jìn)程。SELEX技術(shù)可從隨機(jī)單鏈核酸序列庫中篩選出與靶蛋白特異性結(jié)合的核酸適配體，可為PD-1/PD-L1免疫檢查點(diǎn)療法提供一個(gè)新的思路[7～10]。本研究通過篩選IPTG誘導(dǎo)濃度、誘導(dǎo)溫度、密碼子優(yōu)化，最終成功表達(dá)、純化PD-L1胞外域片段，為后續(xù)的SELEX篩選PD-L1 適配體提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

與繁瑣、復(fù)雜且蛋白得率低的真核表達(dá)系統(tǒng)比較，基于大腸桿菌的原核表達(dá)系統(tǒng)簡單易行、目的蛋白得率高，已成為獲取目的蛋白的常規(guī)方法[14～17]。本研究發(fā)現(xiàn)，在密碼子優(yōu)化前后，0.1mmol/L與1mmol/L IPTG誘導(dǎo)濃度均可成功誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)，且兩者間無明顯差異。而誘導(dǎo)溫度不僅影響目的蛋白的誘導(dǎo)效率，還會影響目的蛋白的表達(dá)模式。筆者發(fā)現(xiàn)在密碼子誘導(dǎo)前后，誘導(dǎo)溫度越高，目的蛋白的誘導(dǎo)效率越高。此外，通過稀有密碼子優(yōu)化后，16℃低溫誘導(dǎo)表達(dá)可使目的蛋白表達(dá)于細(xì)菌裂解上清中，可能是因?yàn)榈蜏厥沟鞍妆磉_(dá)效率降低的同時(shí)，改善了蛋白的空間構(gòu)想，使其正常折疊。

真核生物的蛋白在大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)中，由于缺乏某些蛋白質(zhì)折疊輔助因子或環(huán)境不適，易形成包涵體[11]。此外，不同物種間存在明顯的密碼子偏好，若使用頻率低的稀有密碼子大量存在，會嚴(yán)重減小目的蛋白的表達(dá)水平，甚至?xí)斐牲c(diǎn)突變或移碼突變表達(dá)出序列錯(cuò)誤的多肽[12, 18～20]。目的蛋白中含有大量稀有密碼子，最直接、高效的方法是對目的蛋白進(jìn)行稀有密碼子優(yōu)化，可改善蛋白的空間構(gòu)象，使其正常折疊，從而減少包涵體的形成并保持生物活性實(shí)現(xiàn)可溶性的表達(dá)[21]。本研究發(fā)現(xiàn)在密碼子優(yōu)化前，在最優(yōu)篩選條件下，PD-L1蛋白仍在包涵體中表達(dá)，并在蛋白復(fù)性析出最終無法得到目的蛋白。而在密碼子優(yōu)化后，采用16℃，0.1mmol/L IPTG誘導(dǎo)12h可使PD-L1目的蛋白以可溶狀態(tài)少量表達(dá)于細(xì)菌裂解上清液中，隨后通過鎳離子螯合純化樹脂得到了少量的PD-L1胞外域目的蛋白。

綜上所述，本研究表達(dá)、純化了PD-L1胞外域目的片段，為PD-L1的其他相關(guān)研究提供了物質(zhì)基礎(chǔ)，為后續(xù)篩選PD-L1胞外域特異性結(jié)合的核酸適配體提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。SELEX利用該技術(shù)可以從隨機(jī)單鏈核酸序列庫中篩選出特異性與靶物質(zhì)高度親和的核酸適體[7～10]。若利用SELEX技術(shù)篩選得到的特異性適配體能阻斷PD-1/PD-L1間的結(jié)合，則能為腫瘤逃逸的防治提供新的思路與方向。