響應(yīng)面法優(yōu)化長泰砂仁總黃酮提取工藝研究

★ 李秋玲 謝偉容 關(guān)夢瑤 鄭瑞燕 曾立欽 張清懿（.漳州衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院藥學(xué)系 福建 漳州 363000；.福建中醫(yī)藥大學(xué) 福州 350）

長泰砂仁是閩南民間頗具地方特色的一味草藥，常以傳統(tǒng)地方特色鹽淹漬砂仁入藥或者砸成碎末作為調(diào)料，具有較高藥用價值，用于治療腹痛痞脹、脾胃氣滯、噎膈嘔吐、寒瀉冷痢、妊娠胎動等證；也常與家禽、鯽魚一起煲湯佐餐，或者砂仁泡酒，均是閩南地區(qū)備受歡迎的營養(yǎng)食譜。

經(jīng)考證鑒定福建省漳州市長泰縣種植的砂仁是從廣東省陽春縣引種而來的陽春砂（Amomum villosumLour.），長泰縣種植砂仁有100多年歷史，是福建省最大的砂仁種植地，也是福建省砂仁主流品種。砂仁是姜科豆蔻屬多年生草本植物。果實供藥用，味辛，性溫，歸脾經(jīng)、胃經(jīng)、腎經(jīng)［1］。砂仁含有黃酮類成分，主要為槲皮苷［2］。中醫(yī)認為砂仁具有治療脾胃氣滯、宿食不消、腹痛痞脹、噎膈嘔吐、寒瀉冷痢的功效，現(xiàn)代藥理研究表明砂仁具有抗?jié)?、抗腹瀉、促進胃排空和胃腸推進運動、利膽、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗血小板聚集和延長凝血時間等作用［3-5］。黃酮類化合物廣泛存在于植物中，具有非常顯著的抗氧化和殺菌等效用，是一種天然的抗氧化劑［6］。槲皮苷除具有抗氧化作用外，對結(jié)腸炎癥具有治療作用［7］，還對結(jié)腸癌細胞、肺癌細胞具有抗增殖和凋亡作用［8-9］。

目前關(guān)于長泰砂仁總黃酮相關(guān)研究報道較少，王文杰等［10］采用浸提法對砂仁中總黃酮提取進行正交優(yōu)化，李宗主等［2］對陽春砂仁的總黃酮進行提取測定。目前常用于黃酮類化合物的提取方法為有機溶劑提取法，乙醇作為常用的提取溶劑被廣泛應(yīng)用。響應(yīng)面法用于中藥材中總黃酮的提取優(yōu)化也有較多的應(yīng)用［11-12］。本實驗通過單因素試驗考察提取方法、提取時間、提取溶劑、料液比和提取次數(shù)對長泰砂仁總黃酮提取率的影響，并以槲皮苷標(biāo)準(zhǔn)品的提取結(jié)果為參照進行對比，研究長泰砂仁黃酮類成分的最佳提取工藝，為長泰砂仁黃酮類物質(zhì)的有效利用和拓展其藥理價值提供參考。

1 材料與儀器

1.1 材料長泰砂仁，購自漳州市長泰縣益康藥房，經(jīng)漳州衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院王小平教授鑒定為姜科植物陽春砂（Amomum villosumLour.）的干燥果實；槲皮苷（111538-200504）購自中國食品藥品檢定研究院；無水乙醇、氯化鋁、三乙胺、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司，水為超純水。

1.2 儀器UV-1800紫外-可見分光光度計（日本島津公司）；電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）；AR224CN萬分之一電子天平（常州奧豪斯儀器有限公司）；KQ-500DE超聲波清洗機（昆山市超聲儀器有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液配制

2.1.1 對照品溶液配制精密稱取槲皮苷標(biāo)準(zhǔn)品5.00 mg置50 mL容量瓶中，加80 %乙醇溶液定容至刻度，得到濃度為0.1 mg/mL的對照品儲備液。

2.1.2 供試品制備將新鮮長泰砂仁挑去雜質(zhì)，置于60 ℃烘箱中烘干，粉碎，過80目篩。取適量粉末，加入一定比例體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液，混合均勻，相應(yīng)提取方法提取一定時間，提取液濾膜過濾得到供試品溶液。

2.2 方法學(xué)考察與含量測定

試驗分別設(shè)在甘州區(qū)黨寨鎮(zhèn)陳寨村中種集團張掖種業(yè)有限公司玉米制種基地，海拔1 509 m、東經(jīng)101.12°、北緯38.6°；臨澤縣平川鎮(zhèn)三二村甘肅臨澤奧瑞金種業(yè)有限公司玉米制種基地，海拔1 369 m、東經(jīng)99.85°、北緯39.4°。前茬作物均為制種玉米，供試土壤為灰灌漠土，地塊平整，肥力中等，灌溉設(shè)施配套齊全。

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制分別取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.6、2.0 mL槲皮苷對照品溶液置5 mL量瓶中，各加入2 %三氯化鋁1 mL，80 %乙醇定容，搖勻，顯色10 min后立即在400 nm波長處測定吸光度。所得數(shù)據(jù)經(jīng)回歸處理得到槲皮苷濃度與吸光度之間具有良好的線性關(guān)系：Y=0.029X- 0.006 5，r=0.998 2；線性范圍：4～40 μg/mL。

2.2.2 精密度試驗取供試品溶液1 mL，置于5 mL容量瓶中，按“2.2.1”項下方法，在400 nm波長處連續(xù)6次測定吸光度，RSD值為0.02 %，表明精密度好。

2.2.3 穩(wěn)定性試驗取供試品溶液1 mL，置于5 mL容量瓶中，按“2.2.1”項下方法，在400 nm波長處測定吸光度，每10 min測定一次，60 min內(nèi)RSD值為0.82 %，說明供試品顯色后在60 min內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.4 重復(fù)性試驗取同一批次樣品6份，按“2.4.4”項方法制備供試品溶液，取供試品溶液1 mL，按“2.2.1”項下方法，在400 nm波長處測定吸光度，RSD值為1.23 %，表明重復(fù)性較好。

2.2.5 加樣回收試驗取已知含量的同一批供試品6份，每份2.5 g，精密稱定，分別精密加入同量的對照品溶液，按“2.4.4”項方法制備供試品溶液，取供試品溶液1 mL，按“2.2.1”項下方法，在400 nm波長處測定吸光度，計算回收率，平均回收率為97.4 %，RSD值為2.84 %。

2.2.6 樣品測定精密吸取按“2.1.2”項下方法制備的樣品提取液1 mL于5 mL量瓶中，按“2.2.1”項下方法操作測定吸光度，計算樣品總黃酮含量。

2.3 提取工藝研究

圖1 提取方法對長泰砂仁總黃酮提取的影響

2.3.2 單因素試驗考察

2.3.2.1 提取時間精密稱取5 g長泰砂仁粉末5份，固定提取乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)80%，固定料液比為1∶10，采用回流提取法，分別提取15、30、60、90、120 min，固定提取次數(shù)為1次，按“2.2”項下方法進行總黃酮含量測定。見圖2。圖2顯示在15～90 min范圍內(nèi)，提取量隨提取時間的增加而增加；在90～120 min范圍內(nèi)，提取量隨提取時間的增加而減少，即提取時間為90 min提取量最高。乙醇加入至長泰砂仁中時，溶劑浸潤其細胞壁，而后緩慢滲透至細胞內(nèi)，并在細胞內(nèi)擴散，溶解與其極性相似的成分，從而使細胞內(nèi)外產(chǎn)生濃度差［14］。隨著時間推移，溶解的可溶性物質(zhì)逐漸增多，故提取率逐漸增大。溶解進行到一定程度，溶液達到飽和，無法繼續(xù)溶解黃酮類物質(zhì)，甚至析出部分，其可能為90 min后提取量減小的原因。

圖2 提取時間對長泰砂仁總黃酮提取的影響

2.3.2.2 提取溶劑精密稱取5 g長泰砂仁粉末5份，分別加入20 %、40 %、60 %、80 %、100 %乙醇溶液，固定料液比為1∶10，采用回流提取法提取90 min，固定提取次數(shù)為1次，按“2.2”項下方法進行總黃酮含量測定。見圖3。圖3顯示在提取乙醇體積分?jǐn)?shù)20 %～80 %范圍內(nèi)，提取量隨乙醇體積分?jǐn)?shù)升高而升高；在提取乙醇體積分?jǐn)?shù)80 %～100 %范圍內(nèi)，提取量隨乙醇體積分?jǐn)?shù)升高而降低。即提取乙醇體積分?jǐn)?shù)為80 %時提取量最高。乙醇穿透藥材細胞的能力較強，對黃酮類成分的溶解度較好。一般來說，體積分?jǐn)?shù)越大溶解度越大，即提取量越大。但乙醇的極性隨體積分?jǐn)?shù)的增大而減小，使得對黃酮苷類成分及極性大的黃酮苷元的溶解度減小。則在一定范圍內(nèi)，極性對溶解度的影響小于體積分?jǐn)?shù)對溶解度的影響，提取量隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高而升高。而超過這個范圍極性對溶解度的影響大于體積分?jǐn)?shù)對溶解度的影響，提取量隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增而減小。故乙醇體積分?jǐn)?shù)對長泰砂仁黃酮類成分的提取率先增大后減小。

圖3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對長泰砂仁總黃酮提取的影響

2.3.2.3 料液比精密稱取5 g長泰砂仁粉末6份，固定提取乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)80 %，料液比分別為1∶4、1∶6、1∶8、1∶10和1∶12，采用回流提取法提取90 min，固定提取次數(shù)為1次，按“2.2”項下方法進行總黃酮含量測定。見圖4。圖4顯示料液比為1∶8時提取量最高。長泰砂仁中總黃酮的含量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，這可能是因為料液比較小時，有效成分無法充分溶入乙醇中，同時較高體積分?jǐn)?shù)的乙醇會破壞黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)；而料液比較大時，雖然溶解度大，但乙醇易揮發(fā)，料液比隨著提取過程的進行而不斷減小，綜合整個過程實際料液比減小。則在一定范圍內(nèi)，提取溶劑量越大，總黃酮的提取量越大，達到一個峰值。而超過這個范圍，提取量不斷減小。料液比和損失量對實驗的影響處于一個動態(tài)平衡。

圖4 料液比對長泰砂仁總黃酮提取的影響

2.3.2.4 提取次數(shù)精密稱取5 g長泰砂仁粉末2份，固定提取乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)80 %，固定料液為1∶8，采用回流提取法，提取3次，每次提取90 min。按“2.2”項下方法進行總黃酮含量測定，結(jié)果見圖5。圖5顯示總黃酮提取量隨著提取次數(shù)的增加而增加，但提取2次與提取3次的含量差異不大，因此提取2次最佳。

圖5 提取次數(shù)對長泰砂仁總黃酮提取的影響

2.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗

2.4.1 試驗設(shè)計根據(jù)單因素試驗得出的最佳提取條件：回流提取、提取時間為90 min 、乙醇體積分?jǐn)?shù)為80 %、料液比為1∶8、提取次數(shù)為2次。固定提取次數(shù)為2次，選擇影響提取工藝的因素提取時間（A）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（B）、料液比（C），根據(jù) Box-behnken 試驗設(shè)計原理設(shè)計三因素三水平試驗，因素及水平編碼表見表1-2。

表1 響應(yīng)面試驗因素水平編碼表

表2 Box-Behnken試驗設(shè)計與結(jié)果

2.4.2 模型的建立及顯著性檢驗：以長泰砂仁中總黃酮含量為響應(yīng)值，采用Design-Expert.V8.0.6軟件對表3的結(jié)果進行回歸分析，得到綜合評分對提取時間（A）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（B）、料液比（C）的二元多項回歸模型為Y=-6.517 5+0.033 042 A-0.071B+1.274 38C-3.33×10-5AB-1.25×10-4AC-5.2×10-18BC-1.9×10-4A2-4.718×10-4B2-0.072 8C2，回歸方程及各影響因素的ANOVA分析見表3。

表3 回歸方程的顯著性檢驗及方差分析

由表3回歸方程的顯著性檢驗及方差分析可知，F(xiàn)模型=436.19，且P<0.000 1，表明該模型對提取工藝具有極顯著的影響。失擬項P=0.835 9>0.05，表明無明顯失擬因素存在，數(shù)據(jù)沒有異常點。因此可用該回歸方程分析和預(yù)測長泰砂仁總黃酮的最佳提取工藝條件。由表3可以看出二次項A2、B2、C2和一次項A、B、C的P值均<0.000 1，說明二次項A2、B2、C2和一次項A、B、C對綜合評分的影響都是極顯著的；其余各項的P值均大于0.05，對綜合評分沒有顯著影響。提示各影響因素與長泰砂仁總黃酮提取率之間并非簡單的線性關(guān)系。從表3中可以看出，單因素A、B、C的F值大小分別為493.93、519.59、889.40，提示單因素對長泰砂仁中總黃酮的提取率影響順序為C>B>A。

2.4.3 響應(yīng)面分析依據(jù)回歸模型作出相應(yīng)的響應(yīng)曲面圖，分析各考察因素對長泰砂仁總黃酮含量的影響。見圖6-8。由圖可知，根據(jù)擬合模型方程可知，AB、BC和AC之間不顯著，即交互作用較弱，表現(xiàn)為曲面平滑。當(dāng)料液比一定時，總黃酮得率均隨提取時間或乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加而先增大后減小，但是等高線變化幅度較小，說明總黃酮得率變化幅度不大；當(dāng)提取時間或者乙醇體積分?jǐn)?shù)固定時，其他兩個變量對總黃酮提取率的影響均為先增后減，且變化幅度較弱。通過軟件Design-Expert. V8.0.6對模型求解得長泰砂仁中總黃酮提取最優(yōu)工藝條件為：提取時間77.61 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)72.49 %，料液比1∶8.68（g/mL），總黃酮達到最大值2.872 mg/g。

圖6 乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取時間的響應(yīng)面圖

圖7 料液比和提取時間的響應(yīng)面圖

圖8 乙醇體積分?jǐn)?shù)和料液比的響應(yīng)面圖

2.4.4 驗證試驗考慮到實際操作的可行性，調(diào)整工藝參數(shù)為：提取時間77.6 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)72.5 %、料液比1∶8.7（g/mL）、回流提取2次。在此最優(yōu)提取工藝條件下進行3次平行驗證試驗，計算出長泰砂仁中總黃酮的平均提取量為2.85 mg/g。與預(yù)測值的偏差為0.70 %，表明優(yōu)選的工藝條件準(zhǔn)確可靠、合理可行。同時采用王文杰等［10］和李宗主等［2］關(guān)于砂仁總黃酮的提取方法對同一批次砂仁進行總黃酮含量測定，結(jié)果王文杰等的方法測定為2.45 mg/g，李宗主等的方法測定為2.57 mg/g，本文優(yōu)化的提取方法總黃酮含量更高，且提取時間更短。

3 討論

為了優(yōu)選長泰砂仁提取工藝，首先對長泰砂仁總黃酮的含量測定方法進行選擇，查閱文獻，關(guān)于砂仁總黃酮的含量測定方法已有報道，主要包括氫氧化鈉-亞硝酸鈉-硝酸鋁顯色法［13-14］，氯化鋁顯色法［15］，以及使用不顯色258 nm下單一波長檢測法［2］，而經(jīng)過考察本次研究的長泰砂仁原液不顯色，干擾較大，無法使用單一波長檢測法，同時對比了顯色方法：氫氧化鈉-亞硝酸鈉-硝酸鋁顯色法、氯化鋁顯色法以及2015版《中國藥典》總黃酮測定也常用的三乙胺顯色法，參考范世明等［16］文獻，發(fā)現(xiàn)氯化鋁法在400 nm處吸光度最高，并且根據(jù)砂仁黃酮成分研究和含量測定，其含量最高的成分為槲皮苷［2］，以槲皮苷為對照的，考察氯化鋁用量（0.5 %、1 %、2 %、4 %、6 %、8 %、10 %、12 %、16 %、20 %），確定2 %氯化鋁溶液為最優(yōu)顯色條件，與龐曉晗［15］結(jié)果一致，采用該方法應(yīng)用于工藝的結(jié)果評價。

關(guān)于長泰砂仁響應(yīng)面優(yōu)化工藝的研究中，通過單因素考察提取時間、液料比和乙醇體積分?jǐn)?shù)對長泰砂仁總黃酮提取優(yōu)選的基礎(chǔ)上，運用Box-Benhnken的中心組合設(shè)計原理，分析各單因素對長泰砂仁總黃酮提取率的影響，并模擬回歸方程及方差結(jié)果顯示，提取時間、液料比和乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比的二次方項、提取時間的二次方項和和乙醇體積分?jǐn)?shù)的二次方項對長泰砂仁總黃酮提取率的影響具有顯著性，各單因素影響長泰砂仁總黃酮提取的順序為料液比>乙醇體積分?jǐn)?shù)>提取時間，采用響應(yīng)面法確定最佳的單因素水平為回流提取，優(yōu)化得到長泰砂仁總黃酮最佳提取條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)72.5 %，料液比1∶8.684、提取時間77.61 min、提取次數(shù)為2次。通過精密度試驗、穩(wěn)定性試驗、重復(fù)性實驗和加樣回收試驗，確定該提取工藝準(zhǔn)確、穩(wěn)定、簡單，為長泰砂仁總黃酮的提取開發(fā)奠定基礎(chǔ)。