葎草中木犀草苷和蘆丁的提取工藝研究

趙留存　李　莉　靳鳳云　劉樂環(huán)　唐秀勝

1.廣西壯族自治區(qū)宜州市中醫(yī)醫(yī)院藥劑科，廣西　宜州　546300；

2. 貴陽中醫(yī)學(xué)院實驗中心，貴州　貴陽　55002；3. 北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京　100700

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藥物研究

葎草中木犀草苷和蘆丁的提取工藝研究

趙留存1李莉1靳鳳云2*劉樂環(huán)3唐秀勝2

1.廣西壯族自治區(qū)宜州市中醫(yī)醫(yī)院藥劑科，廣西宜州546300；

2. 貴陽中醫(yī)學(xué)院實驗中心，貴州貴陽55002；3. 北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京100700

【摘要】目的：優(yōu)選葎草中木犀草苷和蘆丁的最佳提取工藝。方法：采用正交實驗法，以乙醇濃度、乙醇用量、提取次數(shù)、提取時間為考察因素；采用UPLC以木犀草苷和蘆丁為考察指標(biāo)進(jìn)行含量測定，色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C(18)(100mm×2.1mm，1.7μm)；流動相：甲醇- 1%冰醋酸溶液(28∶72)；流速：0.15ml/min；檢測波長：350nm；柱溫：30℃。結(jié)果：木犀草苷和蘆丁的質(zhì)量濃度分別在25.8～645μg和12.5～313.2μg范圍內(nèi)與峰面積具有良好的線性關(guān)系；最佳提取工藝為加25ml 75%乙醇，回流提取三次，每次1h；影響提取的主次因素為：乙醇濃度>提取次數(shù)>提取時間>乙醇用量。工藝驗證結(jié)果：木犀草苷和蘆丁的平均總量為0.267mg/g。結(jié)論：優(yōu)選的提取工藝穩(wěn)定、可行，有效成分提取率高。

【關(guān)鍵詞】葎草；木犀草苷；蘆??；正交試驗；提取工藝

葎草為桑科植物葎草Humulusscandens( Lour.) Merr.的全草，別名拉拉秧、鋸子草、五爪龍、降龍草等[1]，始載于《唐本草》[2-3]。葎草為一年或多年生草本，除青海、新疆以外，全國各地均有分布，另外東北亞、北美洲也有分布[4]。葎草含有黃酮類、萜類、揮發(fā)油類、甾體等化合物[5-7]，具有清熱解毒、利尿通淋功效，主治肺熱咳嗽、肺癰、虛熱煩渴、熱淋、水腫、小便不利、濕熱瀉痢、熱毒瘡瘍、皮膚瘙癢等癥[8-9]。目前，葎草的研究主要集中在紫外分光光度法測定葎草中總黃酮的量及HPLC法測定葎草中木犀草素和木犀草苷的含量[10-12]，為更好的控制葎草質(zhì)量，本文以葎草的有效成分木犀草苷和蘆丁為考察指標(biāo)，采用正交實驗法對葎草的提取工藝進(jìn)行考察，篩選出最佳提取工藝。為以后建立更加全面可靠的葎草質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)奠定研究基礎(chǔ)。

1儀器與材料

1.1儀器超高液相色譜儀(Waters Acquity UPLC H-Class系統(tǒng)，包括四元梯度泵、恒溫自動進(jìn)樣器、柱溫箱、PDA檢測器和Empower3數(shù)據(jù)處理工作站，美國waters)；AE240電子天平(上海梅特勒有限公司)；AB204-S分析天平(上海臺衡儀器儀表有限公司)；R-200旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士步琦公司)；HS10260D型超聲波清洗器(天津奧泰儀器有限公司)；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋(上海浦東物理光學(xué)儀器廠)。

1.2材料葎草采自貴陽市花溪區(qū)十里河灘，經(jīng)貴陽中醫(yī)學(xué)院生藥教研室王祥培教授鑒定為Humulusscandens( Lour.) Merr.;木犀草苷對照品(批號“111720-201106 )、蘆丁對照品(批號：0080-97050，純度：98.6%)均購中國食品藥品檢定研究院;甲醇(色譜純，美國Tedia公司)；水為純凈水；其他試劑均為分析純。

2方法與結(jié)果

2.1對照品溶液的制備精密稱定對照品木犀草苷、蘆丁適量，加甲醇適量制成每毫升含木犀草苷25.8μg，含蘆丁12.5μg的對照品溶液，備用。

2.2色譜條件色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18(100mm×2.1mm，1.7μm)；流動相：甲醇-1%冰醋酸溶液(28∶72)；流速：0.15ml/min；檢測波長：350nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：1μl。木犀草苷和蘆丁與相鄰峰的分離度均大于1.5。UPLC色譜圖如下。

2.3線性關(guān)系與靈敏度分別精密吸取上述木犀草苷對照品溶液(25.8μg/ml)、蘆丁對照品溶液(12.5μg/ml)0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5μl ，在上述色譜條件下進(jìn)樣,測定峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，得出木犀草苷線性回歸方程：Y=2.4×107X-16133(r=0.9998)；蘆丁線性回歸方程：Y=1.0×107X-2418.8(r=0.9998)，結(jié)果表明，木犀草苷和蘆丁質(zhì)量濃度分別在25.8～645μg和12.5～313.2μg范圍內(nèi)與峰面積具有良好的線性關(guān)系。以3倍信噪比(S/N)對應(yīng)分析物濃度作為檢出限(LOD)，木犀草苷LOD為310.8×10-3μg/ml，蘆丁LOD為150.6×10-3μg/ml；以10倍信噪比(S/N)對應(yīng)分析物濃度作為定量限(LOQ)，木犀草苷LOQ為1036×10-3μg/ml，蘆丁LOQ為502×10-3μg/ml。

2.4供試品溶液的制備取本品粉末(過三號篩)約1.6g，精密稱定，置具塞圓底燒瓶中，精密加入75%乙醇25ml，密塞，稱定重量，回流提取40min，放冷，再稱定重量，用75%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。進(jìn)樣前用0.22μm微孔濾膜過濾，吸取1μl，注入超高液相色譜儀，照前述色譜條件進(jìn)行測定。

2.5精密度取木犀草苷和蘆丁對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，，每次進(jìn)樣1μl，分別測定峰面積，其中木犀草苷的峰面積RSD為1.32%，蘆丁的峰面積RSD為1.86%，表明儀器精密度良好。木犀草苷和蘆丁的平均回收率分別為98.28%和99.35%，RSD分別為2.94%和2.94。

2.6葎草提取工藝的設(shè)計

2.6.1正交試驗設(shè)計參考文獻(xiàn)[12]，確定用乙醇為提取溶劑，采用回流提取方法，選擇提取工藝中對提取含量有影響的四項因素，即乙醇濃度A，乙醇用量B，提取次數(shù)C，提取時間D。以木犀草苷和蘆丁的總提取含量為評價標(biāo)準(zhǔn)，每個因素選擇3個水平，采用四因素三水平正交試驗表L9(34)設(shè)計試驗方案，見表4。

2.6.2正交試驗方案及結(jié)果由正交試驗結(jié)果(見表5)和方差分析(見表6)可知：乙醇濃度、提取次數(shù)、提取時間對實驗結(jié)果的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，而乙醇用量對實驗結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義，4個因素對實驗結(jié)果影響大?。阂掖紳舛?提取次數(shù)>提取時間>乙醇用量，四因素最優(yōu)水平組合是A2B1C3D2，即加25ml 75%乙醇回流提取3次每次1h。

表4　因素水平表

表5　L9(34)正交試驗方案及結(jié)果

表6　SPSS軟件方差分析結(jié)果

注：F0.01(2,2)=99.00

2.6.3驗證試驗取同一批藥材粉末，平行稱取三份，每份約1.6g，按最佳提取工藝A2B1C3D2進(jìn)行驗證試驗，測定葎草中木犀草苷和蘆丁的含量，結(jié)果三份藥材中木犀草苷和蘆丁的總量分別為0.258、0.279、0.263mg/g，因此木犀草苷和蘆丁的平均總量為0.267mg/g。工藝驗證結(jié)果表明，通過正交實驗設(shè)計得到的葎草中木犀草苷和蘆丁的提取率較高、工藝穩(wěn)定、科學(xué)合理。

綜上可知，供試液的制備方法為：取葎草粉末(過三號篩)約1.6g，精密稱定,置圓底燒瓶中，精密加入75%乙醇25ml，加熱回流提取三次，每次1h，濾過，合并三次濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮近干，將濃縮液轉(zhuǎn)移至10ml容量瓶中，加75%乙醇至刻度，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，經(jīng)0.22μm濾膜過濾，即得。

3討論

3.1木犀草苷和蘆丁是葎草的有效成分，實驗通過正交試驗設(shè)計確定了葎草中木犀草苷和蘆丁的顯著性影響因素，其中四因素中乙醇濃度是影響最大的因素，其次是提取次數(shù)、提取時間，乙醇用量對實驗結(jié)果沒有影響，本實驗為以后葎草木犀草苷和蘆丁的含量測定提供了最佳提取制備方法。

3.2在葎草指標(biāo)性成分選擇中，先后選擇了木犀草素、大波斯菊苷、木犀草苷、蘆丁等，結(jié)果木犀草素和大波斯菊苷的含量都很低，測定木犀草素在提取過程中需要水解，時間相對較長，通過比較最后選擇以木犀草苷和蘆丁為指標(biāo)性成分。

3.3本文通過UPLC法對葎草的提取工藝進(jìn)行研究，UPLC與HPLC相比，具有分析效率更高、分析時間更短、分離能力更強(qiáng)、靈敏度更高的優(yōu)點，為今后UPLC法測定葎草的含量提供了依據(jù)。

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Optimal Extractive Technology of luteolin-7-O-glucoside and rutin inHumulusscandens

ZHAO Liucun1LI Li1JIN Fengyun2*LIU Lehuan3TANG Xiusheng2

1.Dept. of Pharmacy,Yizhou Traditional Chinese Medicine Hospital，Yizhou 546300，China;2.The Experiment Center，Guiyang College of Traditional Chinese Medicine，Guiyang 550002，China;3. School of Chinese Materia Medica，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100700，China

Abstract:Objective optimal extractive technology of luteolin-7-O-glucoside and rutin in Humulus scandens. Methods The extraction technology were optimised by the orthogonal experimental method with ethanol concentration, alcohol amount, extraction time and the extraction times as factors. Luteolin-7-O-glu-coside and rutin were as indexes, which were determined by UPLC. ACQUITY UPLC BEH C(18)(100mm×2.1mm，1.7μm) was adopted .The mobile phase consisted of methanol-1%glacial acetic acid(28∶72).The flow rate was 0.15 ml/min.The column temperature was 30℃,and the UV detection wavelength was 350nm．Results The linear range were 25.8-645μg/ml of Luteolin-7-O-glu-coside , 12.5-313.2μg/ml for rutin . the optimal extraction technology is: add 25ml amount of 75% alcohol refluxing extract three times, one hour per time. Major order factors affecting the extraction yield was ethanol concentration，the extraction times，the extraction time，alcohol amount. Process validation show that total production averages 0.267mg/g for luteolin-7-O-glucoside and rutin .Conclusion The optimized extraction techniques is stable and feasible, and the extraction rate of active components is high.

Key words:Humulus scandens; luteolin-7-O-glucoside; rutin; orthogonal experiment; extraction techniques

(收稿日期：2015.12.30)

【中圖分類號】R284.2

【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A

【文章編號】1007-8517(2016)06-0016-04

作者簡介：趙留存(1984-)，山東菏澤人，碩士研究生，執(zhí)業(yè)中藥師，主要從事中藥新制劑、中藥質(zhì)量控制與新藥研發(fā)。E-mail：zhaoliucun@126.com。通信作者：靳鳳云(1954-)，女，教授，山東菏澤人，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事中藥質(zhì)量控制與新藥研發(fā)。E-mail：jinfengyun01@163.com。

基金項目：貴州省教育廳自然科學(xué)研究項目(黔教科(2011)048號)。