新疆阿魏內(nèi)生真菌鏈格孢屬菌提取物體外抑制腫瘤增殖活性篩選△

趙亞琴，徐倞倞，李曉瑾*，樊叢照，朱軍，王果平

1.新疆維吾爾自治區(qū)中藥民族藥研究所，新疆 烏魯木齊 830002；

2.國(guó)家中醫(yī)藥管理局 新疆中藥民族藥資源重點(diǎn)研究室，新疆 烏魯木齊 830002；

3.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)，新疆 烏魯木齊 830052

阿魏應(yīng)用歷史悠久，為漢族、維吾爾族、蒙古族、藏族等各民族傳統(tǒng)醫(yī)用藥之一。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，阿魏具有抗生育、免疫抑制、解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗腫瘤等廣泛的藥理活性，近年來因發(fā)現(xiàn)其具有植物雌激素活性成分和抗癌活性物質(zhì)而備受關(guān)注[1]。新疆阿魏Ferula sinkiangensisK.M.Shen 是僅產(chǎn)于新疆的道地藥材，具有多年生早春短命植物特性，日益增長(zhǎng)的市場(chǎng)需求致使該物種瀕臨滅絕[2]，因此尋找新疆阿魏替代資源具有重要意義。

植物內(nèi)生真菌（endophytic fungi）是指部分或者全部時(shí)期生活在植物體內(nèi)，而不會(huì)引起宿主植物產(chǎn)生明顯病害癥狀的一類真菌，在與宿主植物共生的漫長(zhǎng)過程中與宿主植物建立起了互利互惠的關(guān)系。其種類豐富，次級(jí)代謝活躍，不僅能產(chǎn)生一些結(jié)構(gòu)獨(dú)特、骨架新穎的活性化合物，而且這類化合物生物活性較強(qiáng)[3]。多項(xiàng)研究表明，植物內(nèi)生菌代謝產(chǎn)物含有與宿主植物相同或相似的有效成分，從內(nèi)生真菌分離得到的活性物質(zhì)中有50%以上是新化合物且抗癌活性顯著，為臨床應(yīng)用提供了新的藥物來源[4]。

基于植物內(nèi)生真菌能夠產(chǎn)生與宿主相同或相似的活性成分，本研究對(duì)前期已分離獲得的117株新疆阿魏內(nèi)生真菌提取物進(jìn)行抗腫瘤活性體外篩選與評(píng)價(jià)，以期尋找具有產(chǎn)生抗腫瘤活性物質(zhì)潛力的菌株，對(duì)挖掘和拓寬阿魏資源及新型抗癌活性物質(zhì)的研究提供參考。

1 材料

1.1 菌株

117 株菌種源自傘形科植物新疆阿魏Ferula sinkiangensisK.M.Shen 的內(nèi)生真菌，保藏于新疆中藥民族藥研究所實(shí)驗(yàn)室菌種庫，由于菌株保密原因，其名稱尚未公開。

1.2 細(xì)胞

人宮頸癌HeLa 細(xì)胞和胃癌AGS 細(xì)胞均由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所天然藥物研究中心化學(xué)室主任斯建勇教授惠贈(zèng)，由實(shí)驗(yàn)室傳代保存。其中，HeLa 細(xì)胞使用DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)，AGS 細(xì)胞使用Ham′s F12培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.3 試藥與儀器

馬鈴薯葡萄糖（PDA）培養(yǎng)基（批號(hào)：P8931，北京索萊寶科技有限公司）；高糖DMEM 培養(yǎng)基（批號(hào)：12100-046，美國(guó)Invitrogen 公司）；Ham′s F12 培養(yǎng)基（批號(hào)：SH30026.01B，美國(guó)Hyclone 公司）；胎牛血清（批號(hào)：70220-8611，浙江天杭生物科技有限公司）；胰蛋白酶和青鏈霉素混合物（批號(hào)：25200-056，美國(guó)Gibco 公司）；二甲基亞砜（DMSO，批號(hào)：0231，美國(guó)Amresco 公司）；磷酸鹽緩沖液（PBS，批號(hào)：P1022，北京索萊寶科技有限公司）；四甲基偶氮唑鹽（MTT，批號(hào)：298-93-1，美國(guó)Sigma 公司）；SA-1500-1 型（SHJ 系列）超凈工作臺(tái)（上海上凈凈化設(shè)備有限公司）；Sorvall legend Micro 17 型高速離心機(jī)、Fomia-86C991 型低溫冰箱（美國(guó)Thermo 公司）；CKX41SF 型倒置光學(xué)顯微鏡（日本Olympus 公司）；JJ200 型電子分析天平（上海精科儀器有限公司）；MLS-3750 型全自動(dòng)高壓滅菌鍋（日本Sanyo 公司）；MQX200 型酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTek 公司）；QL-901 型96 孔培養(yǎng)板（美國(guó)Corning公司）。

2 方法

2.1 凍存菌株的復(fù)蘇純化與發(fā)酵粗提取

將本課題組前期分離鑒定的內(nèi)生真菌菌株活化，利用PDA 培養(yǎng)基培養(yǎng)，獲得供試內(nèi)生真菌提取物[5]。菌株接入培養(yǎng)基中，于25 ℃、180 r·min-1搖床振蕩培養(yǎng)15 d；濾過，分別收集培養(yǎng)液與菌絲體；培養(yǎng)液旋蒸后得到浸膏，編號(hào)為1～117；菌絲體用甲醇回流提取，旋蒸，回收甲醇，得到菌絲體醇提浸膏117 份，編號(hào)為118～224（10 份菌絲體浸膏難以溶解未編入受試樣品，菌株編號(hào)為2661/6852、2694/7253、2604/7251、2692/6826、2645/7250、2582/6614、2692/6836、2633/6835、501/3340、2584/6636）。

2.2 供試品制備

供試母液用DMSO 配制，分別稱取供試品（含菌絲體提取物、培養(yǎng)液體提取物）500 μg 于離心管中，加DMSO 500 μL，超聲助溶后置于4 ℃冰箱備用。

2.3 MTT法檢測(cè)提取物抗腫瘤活性

2.3.1 提取物對(duì)HeLa、AGS細(xì)胞增殖的影響 HeLa、AGS細(xì)胞以5×104個(gè)/mL接種于96孔板，每孔100 μL，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 至長(zhǎng)滿單層。加入終質(zhì)量濃度為100 μg·mL-1受試樣品100 μL[6-7]，每個(gè)樣品設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，設(shè)置調(diào)零孔（只加培養(yǎng)基）、溶劑對(duì)照組（加入終體積分?jǐn)?shù)為0.1%的DMSO）。培養(yǎng)48 h 后，加MTT（5 mg·mL-1）溶液20 μL 避光孵育4 h，棄去，每孔加DMSO 150 μL 振蕩溶解，490 nm 波長(zhǎng)條件下測(cè)吸光度（A）值，計(jì)算每個(gè)樣品3 個(gè)復(fù)孔A值的平均值，按公式（1）計(jì)算不同質(zhì)量濃度提取物對(duì)HeLa、AGS 細(xì)胞的增殖抑制率（IR）。

2.3.2 有效樣品的半數(shù)抑制濃度（IC50）測(cè)定 以抑制率>50%為標(biāo)準(zhǔn)，篩選具有明顯的腫瘤細(xì)胞增殖抑制活性的提取物，采用MTT 法（受試樣品質(zhì)量濃度從200 μg·mL-1起，2倍比稀釋供試提取物）測(cè)定有效樣品的IC50。

2.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件的t檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)用（）表示。

3 結(jié)果

3.1 新疆阿魏內(nèi)生真菌提取物對(duì)HeLa、AGS 細(xì)胞增殖的影響

結(jié)果表明，在質(zhì)量濃度為100 μg·mL-1時(shí)，以抑制率大于50%為標(biāo)準(zhǔn)，得到有抑制腫瘤細(xì)胞增殖活性的樣品49 份（表1），占受試菌株的36.7%。其中菌液提取物12 份、菌絲體提取物37 份；有6 株菌（編號(hào)分別為2618/6821、2596/6643、465/N190、2571/6657、487/3322、439/N158）的菌液提取物及菌絲體提取物對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖均具有顯著抑制作用；15 份樣品對(duì)2 種細(xì)胞均具有明顯的抑制作用（圖1）。

圖1 15個(gè)新疆阿魏內(nèi)生真菌提取物對(duì)AGS和HeLa細(xì)胞增殖的抑制率（,n=3）

表1 阿魏內(nèi)生真菌提取物對(duì)2種腫瘤細(xì)胞增殖的影響

3.2 有效樣品的IC50測(cè)定結(jié)果

結(jié)果顯示，1938/TL168號(hào)菌株對(duì)HeLa細(xì)胞抑制作用最強(qiáng)，IC50為（25.95±3.39）μg·mL-1；2682/6626號(hào)菌株提取物次之，IC50為（30.53±2.84）μg·mL-1。對(duì)AGS 細(xì)胞抑制作用最強(qiáng)的是2690/7242 號(hào)菌株，IC50為（32.17±2.47）μg·mL-1（表2）。

表2 新疆阿魏內(nèi)生真菌提取物對(duì)AGS和HeLa細(xì)胞的IC50（,n=3）μg·mL-1

表2 新疆阿魏內(nèi)生真菌提取物對(duì)AGS和HeLa細(xì)胞的IC50（,n=3）μg·mL-1

4 討論

4.1 新疆阿魏內(nèi)生真菌具備開發(fā)為抗腫瘤新藥的潛質(zhì)

植物內(nèi)生真菌通過與植物交換基因，可以產(chǎn)生與宿主相同或相似的化合物，現(xiàn)已成為天然活性物質(zhì)的重要資源庫之一[8]。本團(tuán)隊(duì)前期對(duì)新疆阿魏不同部位提取物進(jìn)行體外抗腫瘤活性研究，發(fā)現(xiàn)新疆阿魏樹膠和種子的脂溶性部分對(duì)人胃癌、宮頸癌等細(xì)胞增殖具有顯著的抑制作用[9-10]。本研究發(fā)現(xiàn)，新疆阿魏內(nèi)生真菌可有效抑制胃癌、宮頸癌等癌細(xì)胞的體外增殖，亦證實(shí)了內(nèi)生真菌可以產(chǎn)生與其宿主相關(guān)的活性物質(zhì)?！秶?guó)家新藥（西藥）臨床前研究指導(dǎo)原則匯編》規(guī)定，體外抗腫瘤效果的評(píng)價(jià)以體外IC50表示，當(dāng)植物提取物對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的IC50≤30 μg·mL-1，即被認(rèn)為體外具有抗腫瘤活性[11]，新疆阿魏內(nèi)生真菌編號(hào)為1938/TL168 的菌株提取物對(duì)HeLa 細(xì)胞增殖的IC50為（25.95±3.39）μg·mL-1，表明阿魏內(nèi)生真菌提取物符合抗腫瘤藥物體外篩選標(biāo)準(zhǔn)，可為新型抗腫瘤藥物的研發(fā)提供新來源，具備開發(fā)為抗腫瘤新藥的潛質(zhì)。

4.2 新疆阿魏不同種屬的內(nèi)生真菌抗腫瘤活性存在較大差異

供篩的117 株阿魏內(nèi)生真菌中具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖活性的菌株有43 株，主要?dú)w屬于鏈格孢屬（Alternariasp.）。鏈格孢屬在植物中分布較為廣泛，從該屬的內(nèi)生真菌中分得的生物堿（如長(zhǎng)春堿、細(xì)胞松弛素等）、萜類（如紫杉醇）、黃酮類等化合物具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性，是一類具有抗癌應(yīng)用潛力的生物資源[12-14]。而本研究中相關(guān)內(nèi)生真菌發(fā)揮抗腫瘤活性的物質(zhì)基礎(chǔ)具體是什么，是否與其宿主阿魏抗腫瘤活性成分一致等問題有待進(jìn)一步研究；同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)阿魏內(nèi)生真菌不同種屬提取物之間的抗腫瘤活性存在較大差異，而同一菌株的提取物對(duì)不同腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用也存在差異，這些作用的差異可能與不同種屬提取物中化學(xué)成分結(jié)構(gòu)的多樣性有關(guān)。

4.3 新疆阿魏內(nèi)生真菌的培養(yǎng)條件和提取方式與其抗腫瘤活性相關(guān)

研究結(jié)果顯示，雖然2682/6626號(hào)菌株的菌液提取物對(duì)HeLa細(xì)胞的IC50為（30.53±2.84）μg·mL-1，但在所有受試提取物篩選結(jié)果中，菌絲體提取物的腫瘤增殖抑制作用效果明顯優(yōu)于菌液提取物，說明內(nèi)生真菌活性成分的積累、釋放可能與菌株所處的溫度、光照、終止培養(yǎng)時(shí)間等外在因素密切相關(guān)，其產(chǎn)生與作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。如何大批量培養(yǎng)能穩(wěn)定產(chǎn)生抗腫瘤活性物質(zhì)的提取物將是今后研究的一個(gè)重要方向。