油茶組織培養(yǎng)研究進(jìn)展

李春永

（廣東省德慶林場(chǎng)，廣東 廣州 526600）

1.關(guān)于油茶

1.1 油茶

油茶（Camellia oleifera Abel.）是山茶科山茶屬植物，為常綠小喬木或灌木，是指山茶屬植物中種子含油率較高、有栽培應(yīng)用價(jià)值的一類物種的總稱。油茶主要分布在我國(guó)長(zhǎng)江流域及其以南的省份和自治區(qū)，主要包括普通油茶、小果油茶、枚縣油茶、浙江紅花油茶、廣寧紅花油茶、騰沖紅花油茶、越南油茶等10多個(gè)種。

1.2 油茶的作用

油茶是我國(guó)重要的木本油料樹(shù)種，具有悠久的栽培歷史和重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，在我國(guó)國(guó)民生產(chǎn)和人民生活中占據(jù)著重要的地位。油茶的主要產(chǎn)品是茶油，茶油中不飽和脂肪酸高達(dá) 90%左右，還富含脂溶性 VA、VE、VK，可預(yù)防心血管硬化，降血壓，降血脂等，被公認(rèn)為是一種理想的營(yíng)養(yǎng)保健食用油，已被國(guó)際糧農(nóng)組織列為重點(diǎn)推廣的健康型高級(jí)食用植物油。

此外，茶油還被廣泛地應(yīng)用于工業(yè)、醫(yī)藥、化妝業(yè)領(lǐng)域中，具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。油茶還是一種優(yōu)良的荒山荒地綠化樹(shù)種，尤其是對(duì)于維護(hù)我國(guó)南方丘陵紅壤地區(qū)的生態(tài)穩(wěn)定性起著十分重要的作用，具有綠化美化環(huán)境、凈化空氣、調(diào)節(jié)氣候、保持水土、涵養(yǎng)水源等多種生態(tài)效益，是我國(guó)南方丘陵紅壤地區(qū)的先鋒闊葉樹(shù)種和主要造林綠化樹(shù)種。

2.油茶組培

2.1 油茶產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀

油茶雖在我國(guó)栽培歷史悠久，但目前對(duì)油茶的開(kāi)發(fā)、研究、應(yīng)用仍不盡人意，盡管在育種、種植、管理等方面取得諸多成果，但油茶生產(chǎn)長(zhǎng)期以來(lái)一直采用自然實(shí)生繁殖、品種良蕎不齊、粗放經(jīng)營(yíng)，全國(guó)總產(chǎn)量很低，栽培面積也大幅度的減少，起經(jīng)濟(jì)效益并未能得到充分發(fā)揮。

目前，國(guó)內(nèi)主要采用油茶優(yōu)良無(wú)性系造林，雖然該方法在一定程度上提高了茶油的產(chǎn)量和品質(zhì)，但油茶優(yōu)良無(wú)性系繁育所需的時(shí)間較長(zhǎng)，而且造林成活率極不穩(wěn)定，在采穗圃繁育中還容易受病毒感染而出現(xiàn)容易老化的現(xiàn)象，極大地影響到油茶優(yōu)良無(wú)性系的推廣和應(yīng)用，仍遠(yuǎn)不能滿足速生豐產(chǎn)油茶育苗的需求。全國(guó)油茶產(chǎn)業(yè)發(fā)展規(guī)劃要求在近10年內(nèi)發(fā)展新造油茶林165.80萬(wàn)hm2，經(jīng)初步估算，需優(yōu)質(zhì)苗木60多億株，就現(xiàn)有供苗能力計(jì)算，年均缺口3.67億株，因此，良種苗木供應(yīng)是油茶產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展的瓶頸。

2.2 油茶組培的意義

油茶優(yōu)良無(wú)性系再生植株同原無(wú)性系無(wú)明顯差別，用組培快繁獲得組培苗木能夠保持原無(wú)性系的優(yōu)良特性，其遺傳也是穩(wěn)定的。為了盡快解決良種苗木供需矛盾，推進(jìn)良種發(fā)展進(jìn)程，林業(yè)科技人員正在深入研究油茶組培技術(shù)。通過(guò)建立油茶無(wú)性組織培養(yǎng)的快繁體技術(shù)建立規(guī)模化培育技術(shù)，生產(chǎn)整齊一致的高產(chǎn)優(yōu)良無(wú)性系苗木，用于更新造林或新林營(yíng)造。組織培養(yǎng)對(duì)油茶優(yōu)良種質(zhì)資源和性狀的保存有著深遠(yuǎn)而重大的意義，對(duì)油茶產(chǎn)業(yè)的發(fā)展也將產(chǎn)生重要影響。

2.3 油茶組培概況

但是油茶細(xì)胞不易誘導(dǎo)分化，細(xì)胞不易誘導(dǎo)分化成再生植株，組織培養(yǎng)難度較大目前國(guó)內(nèi)外相關(guān)的報(bào)道較少。而且我國(guó)在油茶組織培養(yǎng)在油茶育苗上的研究開(kāi)展較晚，，進(jìn)展緩慢，技術(shù)很不成熟，應(yīng)用也較少。

國(guó)內(nèi)最早關(guān)于油茶組織培養(yǎng)的研究是顏慕勤于1980年報(bào)道的，主要通過(guò)組織培養(yǎng)誘導(dǎo)出了胚狀體，通過(guò)胚狀體形成再生植株。1981年和1982年，隆振雄和盧天玲先后分別利用油茶未成熟子葉幼胚離體培養(yǎng)獲得再生植株，此后，隆振雄對(duì)油茶花藥培養(yǎng)進(jìn)行了研究，通過(guò)組織培養(yǎng)誘導(dǎo)產(chǎn)生了愈傷組織，并獲得了綠色芽點(diǎn)和根，但未獲得再生植株。隨后20年油茶組織培養(yǎng)的研究工作基本處于停滯狀態(tài)。2002-2004年，畢方鋮等對(duì)油茶的莖段、幼胚、子葉在離體條件下進(jìn)行誘導(dǎo)，獲得再生植株，揭示了油茶胚狀體起源于單細(xì)胞原胚或者多細(xì)胞團(tuán)，胚狀體多從表皮細(xì)胞的胚性愈傷組織誘導(dǎo)產(chǎn)生，篩選出了再生叢芽、子葉形成胚性愈傷組織及其不定芽分化的最適培養(yǎng)基配方;還通過(guò)RAPD鑒別分析，在DNA水平上均未發(fā)現(xiàn)變異，說(shuō)明通過(guò)組織培養(yǎng)建立的油茶優(yōu)良無(wú)性系再生植株無(wú)變異，最終獲得的組培苗木能夠保持原無(wú)性系的優(yōu)良特性，其遺傳是穩(wěn)定的，為油茶優(yōu)良無(wú)性系組培擴(kuò)繁和生物技術(shù)育種的再生體系建立打下了基礎(chǔ)。

花藥培養(yǎng)技術(shù)在育種方面有著眾多優(yōu)勢(shì)，如：純合速度快，可以加快育種進(jìn)程；選擇效率高，準(zhǔn)確性高；克服遠(yuǎn)緣雜交不育；能夠創(chuàng)造新種質(zhì)，可與分子標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合等。目前，我國(guó)關(guān)于花藥培養(yǎng)的研究在世界上處于領(lǐng)先水平，該技術(shù)在部分林木物種改良中的成功應(yīng)用為我國(guó)油茶的種質(zhì)改良帶來(lái)了一條新途徑?；ㄋ幣囵B(yǎng)技術(shù)在我國(guó)油茶品種改良中的應(yīng)用研究剛剛開(kāi)始，以花藥培養(yǎng)為主的單倍體育種技術(shù)在植物種質(zhì)改良方面具有重要作用，單倍體育種技術(shù)具有其他種質(zhì)改良方法所不可比擬的優(yōu)良特性，如能將其盡快應(yīng)用到油茶的種質(zhì)改良中，將會(huì)大大促進(jìn)我國(guó)的油茶生產(chǎn)。但目前對(duì)油茶花藥培養(yǎng)的研究?jī)H見(jiàn)少量報(bào)道，且尚未有分化單倍體植株的報(bào)道。

3.影響油茶組培的因素

3.1 外植體的選擇

主要是取材時(shí)期以及取材部位。

取材時(shí)期對(duì)植物花藥愈傷組織發(fā)生有顯著的影響。一般認(rèn)為一年中的7月是油茶組織培養(yǎng)的最佳外植體采集時(shí)期。普通油茶、小果油茶、浙江紅花油茶、廣寧紅花油茶均是在盛花初期所采樣品的誘導(dǎo)率高于盛花末期所采樣品的誘導(dǎo)率。范曉明等認(rèn)為攸縣油茶花粉四分體時(shí)期為油茶花藥愈傷組織誘導(dǎo)的最佳時(shí)期。

油茶的未成熟果實(shí)、花藥、子葉、幼胚、腋芽、莖尖、節(jié)間、下胚軸都可以作為外植體。丁植磊等認(rèn)為壯齡油茶植株背陰面、枝條下部采摘適合的花蕾進(jìn)行試驗(yàn)?zāi)塬@得較高的油茶愈傷組織誘導(dǎo)率和繼代培養(yǎng)增殖效果。黃莉稚的研究發(fā)現(xiàn)，采用1年生油茶扦插新抽的嫩芽作為外植體比采用3年生新抽嫩芽作為外植體能更有效的提高誘導(dǎo)率，同時(shí)降低污染率和褐化率。

3.2 外植體的預(yù)處理

能否有效地控制微生物污染是油茶無(wú)性系組織培養(yǎng)能否成功的關(guān)鍵技術(shù)之一，外植體的消毒是一個(gè)至關(guān)重要的環(huán)節(jié)。常用的酒精配合升汞對(duì)油茶果表面消毒處理非常有效。外植體消毒時(shí)，消毒藥劑濃度太低，時(shí)間太短，不利于污染的控制; 消毒藥劑濃度太高，時(shí)間太長(zhǎng)，則會(huì)破壞外植體的細(xì)胞，由于細(xì)胞對(duì)自身的保護(hù)，會(huì)不斷產(chǎn)生大量次生物質(zhì)，從而引起細(xì)胞毒害，產(chǎn)生褐化甚至死亡，導(dǎo)致外植體的成活率下降。黃莉雅等的研究發(fā)現(xiàn)，75%酒精消毒30s，0. 1%HgCl2消毒6min左右，基本上能達(dá)到較好的消毒效果。蔡玲等的研究，發(fā)現(xiàn)采用0.2 %的 HgCl2消毒處理油茶種胚外植體10 min 效果較好采用。而畢方鋮等的研究發(fā)現(xiàn)，用2.5%次氯酸鈉、消毒時(shí)間20min對(duì)油茶腋芽消毒效果最好，芽的萌發(fā)誘導(dǎo)率達(dá)85%，而污染率只有10%。龔斌等發(fā)現(xiàn)，外植體采回后放在 6%CaCl2溶液中常壓下浸泡15min，效果較好。

另外，低溫預(yù)處理有利于油茶花藥愈傷組織的誘導(dǎo)，只是不同物種的最佳處理時(shí)間不同。普通油茶和小果油茶的花藥愈傷組織經(jīng)過(guò)低溫預(yù)處理后，誘導(dǎo)效率均達(dá)到了70%以上。而也有研究發(fā)現(xiàn)攸縣油茶不做低溫預(yù)處理其平均誘導(dǎo)率最高( 51. 79 %) ，隨著低溫預(yù)處理天數(shù)的增加，誘導(dǎo)率逐漸減低。

離心預(yù)處理同樣可以提高誘導(dǎo)率。

3.3 培養(yǎng)基的選擇及激素配比

選擇合適的培養(yǎng)基和適當(dāng)?shù)募に嘏浔仁怯筒杞M織培養(yǎng)成功的關(guān)鍵因素之一。不同培養(yǎng)基對(duì)油茶苗生根的影響存在明顯差異。在油茶組培中，培養(yǎng)基一般有N6、MS、White、改良ER，MS培養(yǎng)基有利于愈傷組織生長(zhǎng)增殖，是最常用的培養(yǎng)基，尤其在花藥培養(yǎng)方面。材料不同，對(duì)激素種類、濃度的反應(yīng)也不同；不同培養(yǎng)階段對(duì)激素的要求也不同，生長(zhǎng)素與細(xì)胞分裂素以適當(dāng)?shù)谋壤褂脮r(shí)，對(duì)于愈傷組織的誘導(dǎo)是有利的。最常用的激素有NAA和6-BA，2，4-D有利于細(xì)胞迅速增殖和愈傷組織形成，細(xì)胞分裂素KT、ZT和6-BA可促進(jìn)花粉胚的形成。誘導(dǎo)分化培養(yǎng)在 6- BA 與 ZT、CH 按一定的濃度配比使用， 對(duì)叢生芽的分化有顯著的促進(jìn)作用。

油茶花藥培養(yǎng)中培養(yǎng)基組分和激素的作用比較復(fù)雜，改良的誘導(dǎo)培養(yǎng)基在繼代過(guò)程中仍作用良好，而6-BA與NAA組合對(duì)小果油茶增殖表現(xiàn)良好，與誘導(dǎo)培養(yǎng)基相當(dāng)；KT與NAA組合對(duì)多齒紅花油茶增殖明顯優(yōu)于改良過(guò)的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，且綠色芽點(diǎn)增多，褐化狀況好轉(zhuǎn)；這兩種激素組合均為進(jìn)行油茶花藥愈傷組織誘導(dǎo)試驗(yàn)的適宜組合。

吳幼媚等的研究發(fā)現(xiàn)，1/2ER 為油茶組織培養(yǎng)最適基本培養(yǎng)基；ABT60. 5mg / L + IAA 2. 0 mg / L + NAA0. 8 mg /L為最優(yōu)的激素濃度組合，組培單芽培養(yǎng)40天生根率達(dá)93. 7 %，每個(gè)單芽長(zhǎng)根3～4條。

彭秋發(fā)等[的研究發(fā)現(xiàn)，攸縣油茶誘導(dǎo)胚性愈傷組織分化為胚狀體的最佳培養(yǎng)基為 MS+2.0 mg/L6！BA+ 0.6 mg/LNAA。

范曉明等的研究發(fā)現(xiàn)，油茶幼胚再生植株誘導(dǎo)最適培養(yǎng)基的理論值為WPM＋2.0 mg/L 6-BA＋1.5mg/L NAA；子葉胚性愈傷組織誘導(dǎo)的最適培養(yǎng)基為WPM＋1.0 mg/L 6-BA＋0.5 mg/L NAA；子葉胚性愈傷組織的最適分化培養(yǎng)基為MS＋2.0 mg/L 6-BA＋0.01 mg/L NAA。

楊育紅等發(fā)現(xiàn)，在愈傷組織誘導(dǎo)中2，4-D是主要影響因素，其次為NAA和BA。當(dāng)NAA0.5mg/L、BA2.0mg/L時(shí)，愈傷組織的分化率達(dá)到84.9%。，隨著2，4-D濃度的升高，愈傷組織的分化率有所上升，當(dāng)把子葉接到MS+2，4-D0.5+NAA0.5+BA0.5+3%蔗糖的培養(yǎng)基時(shí)，材料在20d內(nèi)全部愈傷化，且整塊愈傷組織極度膨大，結(jié)構(gòu)疏松。

也有研究發(fā)現(xiàn)，油茶幼胚和子葉對(duì)培養(yǎng)基要求不是很嚴(yán)格。

3.4 培養(yǎng)條件

培養(yǎng)溫度、濕度、光照、培養(yǎng)時(shí)間等都對(duì)褐變有很大影響，同樣影響著油茶花藥培養(yǎng)誘導(dǎo)率的高低。

溫度對(duì)花藥培養(yǎng)的影響很大。一般花藥培養(yǎng)溫度采用24-28℃。研究表明，變溫處理即在高溫下處理一段時(shí)間之后再轉(zhuǎn)至低溫培養(yǎng)有利于提高胚狀體的誘導(dǎo)率。

在黑暗條件下培養(yǎng)油茶花藥有利于愈傷組織的發(fā)生，雖生長(zhǎng)緩慢，但經(jīng)暗培養(yǎng)的愈傷組織綜合評(píng)價(jià)指數(shù)最高，黑暗培養(yǎng)是油茶花藥愈傷組織誘導(dǎo)階段的重要條件。一般來(lái)說(shuō)，接種后先暗培養(yǎng)5-10d后再進(jìn)行光照處理對(duì)愈傷組織和芽的萌動(dòng)和分化有利，而黃莉雅等得到的結(jié)果有所不同。

接種后暗處理，可在一定程度上減輕褐化反應(yīng)。

在早期誘導(dǎo)花藥脫分化產(chǎn)生愈傷組織時(shí)，需要在黑暗條件下培養(yǎng)，而誘導(dǎo)胚狀體和芽的分化培養(yǎng)，需要一定時(shí)間的最低光強(qiáng)的光照處理；光質(zhì)對(duì)植株的再生有不同的影響，往往光合的作用光譜對(duì)再生作用最有效。

3.5 添加劑

培養(yǎng)基高壓滅菌后或培養(yǎng)過(guò)程中會(huì)積累一些有毒物質(zhì)，對(duì)外植體或愈傷組織有一定的毒害作用。油茶組織中酚類物質(zhì)含量較高，酚類的糖苷化合物是木質(zhì)素、單寧和色素的合成前體；因此，當(dāng)酚類化合物含量高時(shí)，木質(zhì)素、單寧或色素形成就多，易導(dǎo)致褐變的發(fā)生。嚴(yán)重的褐化現(xiàn)象會(huì)抑制誘導(dǎo)愈傷組織產(chǎn)生，甚至出現(xiàn)死亡。能否有效地控制褐變也是油茶花藥培養(yǎng)能否成功的關(guān)鍵。

在培養(yǎng)基中添加活性炭、VC等物質(zhì)，吸附或去除培養(yǎng)基中的某些毒性物質(zhì)從而促進(jìn)愈傷組織的分化和再生綠苗的生長(zhǎng)?；钚蕴?、VC 和AgNO33 種添加劑能顯著降低花藥愈傷組織誘導(dǎo)過(guò)程中的褐化率。但是，活性炭的吸附作用是沒(méi)有選擇性的，在吸附褐變物質(zhì)的同時(shí)，也會(huì)吸附培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)，而使其失去作用；因而對(duì)外植體的誘導(dǎo)愈傷組織會(huì)產(chǎn)生一定的負(fù)面影響。聞麗等的研究也發(fā)現(xiàn)，添加5g / L活性炭后，普通油茶、小果油茶、浙江紅花油茶、廣寧紅花油茶愈傷組織的誘導(dǎo)率全部下降。

附加有機(jī)物、重金屬類等在花藥培養(yǎng)中也有一定促進(jìn)作用。據(jù)報(bào)道，在培養(yǎng)基中附加多種氨基酸，如谷氨酞胺、絲氨酸、脯氨酸、精氨酸、天門冬氨酸和丙氨酸，可以顯著提高花粉胚及植株的獲得率。水解乳蛋白在柑橘花藥培養(yǎng)中對(duì)花粉胚的發(fā)育有利。

3.6 糖源

蔗糖是主要的碳源，且具有滲透壓調(diào)節(jié)作用，在培養(yǎng)基中蔗糖用量對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)率、綠苗和白苗分化率均有影響，一般愈傷組織誘導(dǎo)反應(yīng)出低濃度有利于綠苗分化，濃度過(guò)高促進(jìn)白苗分化的傾向。聞麗等的研究表明，30g /L和40g / L蔗糖質(zhì)量濃度培養(yǎng)基的花藥愈傷組織的誘導(dǎo)率顯著高于蔗糖質(zhì)量濃度為20g / L和50g / L的處理，其誘導(dǎo)率均值分別為47.89%、51.19%，蔗糖質(zhì)量濃度過(guò)高或過(guò)低，花藥愈傷組織的誘導(dǎo)率均呈明顯下降趨勢(shì)。

用麥芽糖代替蔗糖可提高花培綠苗率。

4.油茶組培存在的問(wèn)題

4.1 褐化問(wèn)題

油茶組織中酚類物質(zhì)含量較高，酚類的糖苷化合物是木質(zhì)素、單寧和色素合成的前體。因此，當(dāng)酚類化合物含量高時(shí)，木質(zhì)素、單寧或色素形成就多，易導(dǎo)致褐變的發(fā)生，有些細(xì)胞會(huì)因褐變而死亡。通過(guò)對(duì)油茶帶腋芽莖段培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)油茶組織培養(yǎng)褐變發(fā)生程度與培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基中激素濃度和無(wú)機(jī)鹽含量等因素有關(guān)；較高的培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基中較高濃度的無(wú)機(jī)鹽、較高濃度的激素及木質(zhì)化程度高的外植體都會(huì)促進(jìn)褐化的發(fā)生。

4.2 污染問(wèn)題

能否有效地控制微生物污染是油茶無(wú)性系組織培養(yǎng)能否成功的關(guān)鍵技術(shù)之一。在油茶無(wú)性系組織培養(yǎng)中污染可分為外植體、培養(yǎng)基和無(wú)菌操作3個(gè)方面，其中以外植體方面的污染最復(fù)雜，也最難控制。

4.3 生根難

油茶生根有相當(dāng)大的難度，在油茶幼苗的生根培養(yǎng)中，用NAA和IBA產(chǎn)生的生根效果均較好，且出根快，但獲得的再生苗大多只有一條主根，須根很少。在空氣中未接觸培養(yǎng)基所形成的不定根，卻有很多白色絨毛狀的須根出現(xiàn)，但很細(xì)弱，在繼代培養(yǎng)中易折斷，這可能與油茶的遺傳特性(主根性明顯)有關(guān)。

5.展望

油茶所具有的增產(chǎn)潛力一直為眾多專家看好，我國(guó)在油茶品種改良方面的研究工作也做了許多，但是一直未能取得顯著的效果?，F(xiàn)代組培技術(shù)的發(fā)展，尤其是花藥培養(yǎng)技術(shù)在其他作物育種方面的應(yīng)用所表現(xiàn)出來(lái)的優(yōu)良特性，使我們看到了油茶育種改良的新的希望。關(guān)于油茶花藥培養(yǎng)的研究仍處于初級(jí)階段，如果能夠篩選出合適的花藥培養(yǎng)橋梁親本組配雜交組合，找到最佳的油茶花藥培養(yǎng)技術(shù)，再結(jié)合常規(guī)的育種方法，在油茶育種改良中運(yùn)用，無(wú)疑將會(huì)為我國(guó)的油茶改良工作帶來(lái)振奮人心的喜訊。目前有關(guān)這方面的研究工作幾乎還沒(méi)有開(kāi)展，但是這將是一個(gè)很有前景的研究方向。