杉木內(nèi)生細(xì)菌SM-1的鑒定及其對杉木赤枯病的防治效果

劉雨菁，曾華龍，梁煒康，盧 夢，朱偉垚，張 蕾，宋 漳，張清華 *

（1. 福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院森林保護(hù)研究所，福建 福州 350002；2. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)教育部天然農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510642；3. 四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，四川 成都 610066）

0 引言

【研究意義】杉木（Cunninghamia lanceolata）是我國特有的用材樹種，因其具有生長快，產(chǎn)量高，材質(zhì)好，用途廣的特點(diǎn)而被大量種植，是我國南方最重要的商品用材樹種之一，在我國林業(yè)生產(chǎn)中占十分重要的地位[1]。杉木生長過程中受到多種真菌病害的為害，杉木赤枯病（Copper blight）是為害杉木苗期和幼林的重要病害，病原菌從針葉侵入，針葉漸變?yōu)榧t褐色，后擴(kuò)展到頂梢，頂部枯死或整株枯死，嚴(yán)重威脅杉木種苗生產(chǎn)和幼林的成長，安全有效地防治該病是目前杉木種植業(yè)亟待解決的問題[2]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】現(xiàn)有杉木赤枯病的防治主要依賴化學(xué)農(nóng)藥[2]，農(nóng)藥濫用引發(fā)的病原菌抗藥性、環(huán)境污染等問題越發(fā)引起人們對生態(tài)安全的擔(dān)心[3]。生物防治被認(rèn)為是極具潛力的環(huán)境友好型植物病害防治措施，相對于化學(xué)農(nóng)藥，具有無污染、無殘留、不殺傷天敵、不易產(chǎn)生抗藥性、利于人畜安全、兼防兼治、增產(chǎn)增收等優(yōu)點(diǎn)[4?5]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】眾多生物防治因子容易受環(huán)境因素影響，防病效果不穩(wěn)定，植物內(nèi)生菌因其受寄主內(nèi)環(huán)境的保護(hù)及其可以直接面對侵入植物的病原菌等優(yōu)點(diǎn)，近年來越來越受到人們的關(guān)注，已經(jīng)成為生物防治因子的重要來源[6]。內(nèi)生真菌普遍存在于目前所有已知的植物中[7?9]，杉木內(nèi)生菌亦被證實(shí)存在種類豐富性，并且在促進(jìn)杉木生長及其在低磷脅迫下生長、抵抗病原菌等方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值[10?11]?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究的供試菌株為福建農(nóng)林大學(xué)森林保護(hù)研究所保存的杉木內(nèi)生細(xì)菌SM-1，前期試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該菌株能夠顯著抑制杉木赤枯病菌（Pesalotiopsis apiculatus）的生長。本研究旨在通過形態(tài)學(xué)結(jié)合16S rDNA序列分析和Biolog系統(tǒng)鑒定SM-1的種類；采用含毒平板和牛津杯法探究SM-1無菌發(fā)酵液對杉木赤枯病菌的拮抗性；并對SM-1無菌發(fā)酵液在離體枝條的杉木葉片上的防效進(jìn)行評估，研究結(jié)果將為杉木赤枯病的生物防治提供資源，為從杉木內(nèi)生菌中篩選赤枯病生物防治因子奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

杉木赤枯病病原菌Pesalotiopsis apiculatus及供試生防菌SM-1由福建農(nóng)林大學(xué)森林保護(hù)研究所分離并保存在?80 ℃的甘油（25%,V/V）中。杉木赤枯病病原菌在PDA培養(yǎng)基上25 ℃活化培養(yǎng)3 d，SM-1是杉木葉片內(nèi)生細(xì)菌，在LA培養(yǎng)基上28 ℃活化培養(yǎng)3 d。

1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g·L?1；酵母提取物5 g·L?1；NaCl 10 g·L?1；pH 7.0～7.2。

PDA培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂18 g，蒸餾水1000 mL。

以上培養(yǎng)基經(jīng)121 ℃滅菌30 min備用。

1.3 細(xì)菌SM-1的鑒定

1.3.1 形態(tài)學(xué)鑒定 將SM-1在LA培養(yǎng)基上三區(qū)劃線法劃線[12]，培養(yǎng)3 d后，觀察菌落的形態(tài)，挑取培養(yǎng)的SM-1單菌落于100 mL LB培養(yǎng)基中，150 r·min?1，28 ℃搖培1 d，獲得菌懸液，參照文獻(xiàn)[13]的方法進(jìn)行革蘭氏染色，以已知的革蘭氏陰性菌假單胞菌（Pseudomonas）作為參考菌株，然后顯微鏡下觀察其 顏色和細(xì)胞形態(tài)。

1.3.2 生理生化鑒定 對該菌株進(jìn)行氧化酶活性及碳 源利用等幾方面的測定, 按文獻(xiàn)[13]的方法進(jìn)行。

1.3.3 16S rDNA序列分析 采用試劑盒提取菌株SM-1的總DNA。采用細(xì)菌通用引物27F和1492R擴(kuò)增16S rDNA基因序列[14]。凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物并回收，回收的PCR產(chǎn)物連接pMD18-T載體后轉(zhuǎn)化大腸桿菌E. coliDH5α，挑選陽性克隆送至上海生工公司進(jìn)行雙向測序，獲得的序列用DNAMAN軟件進(jìn)行拼接后去除殘留的載體序列并提交至Ezbiocloud（https://www.ezbiocloud.net/）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，下載最為相似的且是模式菌株的序列，使用MEGA7.0利用Neighbor-joining方法構(gòu)建菌株SM-1的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn) 化樹。

1.3.4 Biolog鑒定 菌株SM-1在28 ℃的BUG培養(yǎng)基上生長48 h，挑取少量菌落制備菌懸液。與標(biāo)準(zhǔn)菌懸液進(jìn)行濁度對比，菌懸液含量調(diào)節(jié)至90%～98%T后加入GEN III微孔板，每孔加樣100 μL。準(zhǔn)備好的GEN III微孔板放入培養(yǎng)箱28 ℃培養(yǎng)。在培養(yǎng)24 h時(shí) 讀取數(shù)據(jù)，并通過與數(shù)據(jù)庫比較獲得鑒定結(jié)果。

1.4 SM-1對杉木赤枯病菌的抑制

采用平板對峙方法檢測SM-1對赤枯病菌的拮抗作用[15]。在培養(yǎng)基一側(cè)劃線3 cm長的細(xì)菌生長區(qū)，在間隔SM-1培養(yǎng)0、24、48、72 h后接種杉木赤枯病菌，赤枯病菌菌餅5 mm，距離細(xì)菌生長區(qū)5 cm，25 ℃共培養(yǎng)5 d后，測量病原真菌生長直徑 ，計(jì)算抑菌率。每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)，試驗(yàn)重復(fù)2次。

挑取生長3 d的SM-1單菌落至離心管中，加入適量無菌水制備菌懸液，調(diào)節(jié)菌懸液OD600=0.6。分別吸取200 μL菌懸液接種至7個(gè)100 mL PDB培養(yǎng)基中，置于28 ℃的恒溫?fù)u床中150 r·min?1培養(yǎng)。分別在培養(yǎng)1、2、3、4、5、6、7 d時(shí)取出。將發(fā)酵液12 000 r·min?1，離心10 min棄掉菌體獲得上清液，上清液通過0.22 μm的無菌濾膜抽濾，收集濾液，獲得SM-1無菌發(fā)酵液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

采用牛津杯法進(jìn)行發(fā)酵液抗菌能力的測定[16]。向牛津杯中加入200 μLSM-1無菌發(fā)酵液，在距離牛津杯5 cm的位置接種直徑5 mm的赤枯病菌菌餅，25 ℃恒溫培養(yǎng)，測量菌絲的生長直徑和抑菌圈直徑，對照組牛津杯加入200 μL無菌水代替SM-1無菌發(fā)酵液。每個(gè)處理組重復(fù)3次，試驗(yàn)重復(fù)2次。

使用發(fā)酵3 d的無菌發(fā)酵液與PDA培養(yǎng)基做成含毒平板，檢測不同含量發(fā)酵液對杉木赤枯病菌的抑制作用。制成含無菌發(fā)酵液1%、5%、10%、15%、20%（V/V）的毒性平板，以加10%無菌水的PDA平板作為對照。在平板中央接種直徑5 mm的杉木赤枯病菌菌餅，25 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。培養(yǎng)7 d后，用十字交叉法測量對照組和處理組致病菌生長直徑（mm），計(jì) 算抑菌率。每個(gè)處理組重復(fù)3次，試驗(yàn)重復(fù)2次。

1.5 SM-1無菌發(fā)酵液防治杉木赤枯病

采用新鮮的杉木枝條，用培養(yǎng)3 d的無菌發(fā)酵液涂抹在健康的杉木葉片上，自然風(fēng)干后每個(gè)葉片接種一個(gè)直徑5 mm的赤枯病菌菌餅，共接種20個(gè)葉片，放置在25 ℃的光照培養(yǎng)箱中保濕培養(yǎng)，每天觀察，記錄發(fā)病葉片的個(gè)數(shù)，測量病斑的長度。試驗(yàn)重 復(fù)2次。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

對試驗(yàn)中獲得的數(shù)據(jù)使用SPSS軟件進(jìn)行方差分析。SM-1發(fā)酵液對杉木赤枯病菌抑菌率，不同含量發(fā)酵液對核赤枯病菌的抑菌率，不同處理油菜葉片發(fā)病率和病斑直徑，均采用鄧肯多重比較法（Duncan’s Multiple Range Test），在a=0.01水平檢測不同處理的 差異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌SM-1的種類

SM-1在LA培養(yǎng)基上菌落呈現(xiàn)灰白色，中間凹陷，邊緣不完整，菌落表面有褶皺（圖1）。經(jīng)革蘭氏染色，菌株SM-1細(xì)胞呈紫色，為革蘭氏陽性菌（G+），菌體細(xì)胞呈桿狀，細(xì)胞大小約2 μm（圖1）。

圖1 菌株SM-1革蘭氏染色及形態(tài)顯微觀察（標(biāo)尺10 μm）Fig. 1 Gram-stained cell and morphology of SM-1 under microscope (bar = 10 μm)

對菌株SM-1利用氧化酶活性、乳糖等其他生理生化特性進(jìn)行測試，結(jié)果均為陰性（表1）。這些特性也與萎縮芽孢桿菌（B. atrophaeus）的特征相一致。

表1 生理生化鑒定結(jié)果Table 1 Physiological and biochemical characteristics of SM-1

純化的PCR產(chǎn)物經(jīng)測序、拼接、去除載體序列后得到長度為1 455 bp的序列，序列提交到NCBI數(shù)據(jù)庫，獲得登記編號MN592638。通過Ezbiocloud比對，與菌株SM-1相似性高于97%的細(xì)菌種類有17種，均屬于芽孢桿菌屬（Bacillus），其中與貝萊斯芽孢桿 菌（B. velezensis）和B. subtilissubsp.stercoris相似性高達(dá)99%以上，與暹羅芽胞桿菌（B. siamensis）、解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens）、萎縮芽孢桿菌（B. atrophaeus）等11個(gè)種類相似性超過98%（表2）。根據(jù)16S rDNA構(gòu)建的SM-1進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)，SM-1與貝萊斯芽孢桿菌、暹羅芽胞桿菌、解淀粉芽孢桿菌和萎縮芽孢桿菌進(jìn)化關(guān)系較近（圖2）。

圖2 菌株SM-1系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig. 2 Phylogenetic tree of SM-1

表2 與菌株SM-1最為相似的細(xì)菌種類Table 2 Bacterial species with closest similarity to SM-1

Biolog鑒定系統(tǒng)輸出的鑒定結(jié)果顯示，SM-1與萎縮芽孢桿菌（B. atrophaeus）相似性值為0.631＞0.50，雖位距值稍大于5，但比另外3個(gè)種類，解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens）、摩加夫芽孢桿菌（B. mojavensis）、簡單芽胞桿菌（B. simplex）的位距小（表3），Biolog鑒定結(jié)果為萎縮芽孢桿菌（B.atrophaeus）。綜合形態(tài)鑒定、16S rDNA分析和Biolog鑒定結(jié)果，鑒定SM-1為萎縮芽孢桿菌（B. atrophaeus）。

表3 Biolog系統(tǒng)對細(xì)菌菌株SM-1的鑒定Table 3 Identification of bacterial strain SM-1 by Biolog system

2.2 細(xì)菌SM-1對杉木赤枯病菌的抑制

對峙試驗(yàn)結(jié)果顯示，在間隔菌株SM-1培養(yǎng)時(shí)間越長，SM-1對赤枯病菌的抑菌率越高，培養(yǎng)72 h的SM-1對赤枯病菌的抑制效果最強(qiáng)，抑制帶寬度25.05 mm，抑菌率為46.83%，顯著高于其他測試的抑菌率（圖3）。說明SM-1向培養(yǎng)基中分泌抗菌物質(zhì)。菌株SM-1的無菌發(fā)酵液對杉木赤枯病菌有顯著的抑制作用，培養(yǎng)前3 d，隨著發(fā)酵時(shí)間延長，抑菌效果增強(qiáng)；3 d后，隨著時(shí)間延長，抑菌效果再無提升（圖4）。

圖3 菌株SM-1對杉木赤枯病菌的抑制率Fig. 3 Inhibitory rate of SM-1 against P. apiculatus

圖4 不同發(fā)酵時(shí)間發(fā)酵液對杉木赤枯病菌的抑制效果Fig. 4 Inhibitory effect on P. apiculatus by fermentation broth cultured for different length of time (Oxford cup method)

含毒平板抑菌試驗(yàn)表明PDA平板中含有1%菌株SM-1的發(fā)酵液，對杉木赤枯病菌生長幾乎沒有抑制作用，抑制率僅有0.7%，無明顯抑制作用（P=0.75＞0.05）；當(dāng)發(fā)酵液含量達(dá)到5%時(shí)，發(fā)酵液抑菌率達(dá)到21.90%，杉木赤枯病菌的生長受到極顯著抑制（P＜0.01），而且隨著發(fā)酵液含量增加，抑菌效果更加顯著，當(dāng)含毒平板SM-1發(fā)酵液含量為20%時(shí)，抑菌率為58.80%（圖5）。

圖5 不同含量發(fā)酵液的PDA平板對致杉木赤枯病菌的抑制效果Fig. 5 Inhibition effect on P. apiculatus by varied concentrations of fermentation broth in PDA plate test

2.3 SM-1對赤枯病菌菌絲的影響

顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，對照組赤枯病的菌絲生長形態(tài)正常，原生質(zhì)菌液，菌絲分枝正常。而經(jīng)SM-1處理的赤枯病菌菌絲分枝明顯減少而且分枝的菌絲生長 受到抑制，菌絲細(xì)胞大量膨大，呈圓球狀（圖6）。

圖6 菌株SM-1對杉木赤枯病菌菌絲影響Fig. 6 Effect of SM-1 on P. apiculatus mycelial growthobserved under optical microscope

2.4 發(fā)酵液生物防治效果評估

接種后3 d，對照組的20個(gè)杉木葉片全發(fā)病，發(fā)病率為100%，平均病斑長度21.53 mm，而用SM-1發(fā)酵液處理的杉木葉片，只有1個(gè)葉片發(fā)病，發(fā)病率為5%，防治效率為95%；對照組病斑長度平均為21.53 mm，處理組病斑長度平均為0.25 mm，SM-1無菌發(fā)酵液處理的杉木葉片赤枯病發(fā)病率和嚴(yán)重程度極顯著低于對照組（P＜0.01）（圖7）。這表明菌株SM-1的發(fā)酵液對杉木赤枯病具有良好的防治效 果。

圖7 菌株SM-1無菌發(fā)酵液對杉木赤枯病的防治效果Fig. 7 Biocontrol efficacy of SM-1 fermentation broth on copper blight of Chinese fir

3 討論

杉木是我國重要經(jīng)濟(jì)林，其在生長過程中受多種病蟲害的影響，由頂枯擬多毛孢（P. apiculatus）引起的杉木赤枯病是杉木的主要葉部病害之一，多發(fā)生于苗期和幼樹期，目前主要靠化學(xué)農(nóng)藥手段來防治杉木赤枯病[2]。而且現(xiàn)在受環(huán)境友好型與可持續(xù)發(fā)展理念的影響，生物防治越來越受到人們的關(guān)注，而植物內(nèi)生菌與宿主之間互生惠利的奇特關(guān)系，使內(nèi)生菌成為篩選生防因子的天然候選者[17]，因此，挖掘一株能夠有效防治杉木赤枯病的生物藥劑，具有巨大的生態(tài)效益和經(jīng)濟(jì)效益。本研究發(fā)現(xiàn)杉木內(nèi)生細(xì)菌菌株SM-1對杉木焦枯病菌表現(xiàn)出的抑菌率雖然僅有58.8%，但是其離體枝條防病效果達(dá)到95%，是杉木赤枯病生物防治的優(yōu)良菌種資源。雖然SM-1對杉木赤枯病的離體防病試驗(yàn)效果良好，但是自然環(huán)境下的防病試驗(yàn)還需進(jìn)一步研究，以檢測受不同環(huán)境因素影響下SM-1發(fā)酵產(chǎn)物的防病能力。

經(jīng)過多相鑒定，確定菌株SM-1是萎縮假單胞菌（B. atrophaeus）。芽孢桿菌屬細(xì)菌廣泛分布于土壤、植物體內(nèi)、空氣等多種自然環(huán)境中，加之芽孢桿菌產(chǎn)生多種活性代謝產(chǎn)物，具有耐熱性，對環(huán)境營養(yǎng)要求簡單，繁殖定殖能力強(qiáng)，對環(huán)境的抗逆性強(qiáng)，易生產(chǎn)與加工等特點(diǎn)，使得芽孢桿菌制劑在植物病害防治中得到了廣泛應(yīng)用[18]?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)有23個(gè)種的芽孢桿菌具有生物防治的功能，其作用機(jī)制主要包括誘導(dǎo)競爭作用、分泌抗菌物質(zhì)和誘導(dǎo)抗性等幾個(gè)方面[19?20]。萎縮芽孢桿菌（B. atrophaeus）是重要的植物病害生防菌，從土壤中分離到的萎縮芽孢桿菌已經(jīng)證實(shí)對棉花黃萎病、枸杞葉枯病等植物病害有防治潛力[21,22]。萎縮芽孢桿菌能夠產(chǎn)生蛋白質(zhì)類、肽類等不同類型的抗菌物質(zhì)。平板抑菌試驗(yàn)證實(shí)SM-1產(chǎn)生抗菌類代謝物質(zhì)，其代謝物質(zhì)的種類目前還在鑒定當(dāng)中。平板抑菌試驗(yàn)顯示20%（V/V）的SM-1無菌發(fā)酵液抑菌率僅為58.8%，但其防病效果能達(dá)到95%，推斷SM-1次級代謝物質(zhì)不僅能夠影響病原菌的致病能力，或許還能夠誘導(dǎo)杉木對病原菌的抵抗力，對SM-1無菌濾液處理后杉木葉片的生理生化及基因轉(zhuǎn)錄水平的差異研究可為SM-1防病作用機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。

本研究供試菌株SM-1，是從杉木葉片內(nèi)生細(xì)菌中篩選出的，其無菌發(fā)酵液對杉木赤枯病良好的防治效果說明該菌是具潛力的杉木赤枯病生物防治資源。抑菌成分的鑒定及抑菌機(jī)理的研究將為該菌的開發(fā)和利用奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

經(jīng)形態(tài)觀察、16S rRNA測序及Biolog系統(tǒng)檢測，鑒定SM-1為萎縮芽孢桿菌（Bacillus atrophaeus）；含毒平板及牛津杯法檢測到SM-1無菌發(fā)酵液對赤枯病菌的抑制率可達(dá)58.80%，顯微觀察顯示SM-1能夠使赤枯病菌菌絲生長受到抑制，細(xì)胞膨大成球形；離體枝條的葉片接種試驗(yàn)揭示SM-1的無菌發(fā)酵液對杉木赤枯病的發(fā)病率的抑制效率達(dá)95%，并且極顯著減輕葉片發(fā)病程度（P＜0.01）。