2018—2020年福建省稻瘟病菌無(wú)毒基因型鑒定與分析

鄧 云

（福建省南平市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，福建 南平 354200）

0 引言

【研究意義】由稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae，無(wú)性世代為Pyricularia oryzae）引起的稻瘟病是水稻上最具毀滅性的真菌病害，也是福建省水稻生產(chǎn)中最嚴(yán)重的真菌性病害之一[1?6]。目前，全國(guó)因稻瘟病引起的水稻產(chǎn)量損失已經(jīng)達(dá)到每年10億kg，給我國(guó)糧食安全帶來(lái)了嚴(yán)重隱患[7?8]。培育和種植抗病品種不僅能有效解決因農(nóng)藥造成的殘毒和環(huán)境污染問(wèn)題，同時(shí)能夠遏制稻瘟病流行，是防治稻瘟病最安全、經(jīng)濟(jì)和有效的途徑。然而，稻瘟病菌生理小種的專化性、遺傳復(fù)雜性和頻繁變異，導(dǎo)致抗病水稻品種在連續(xù)推廣3～5年后抗性降低甚至喪失?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】?jī)?yōu)質(zhì)抗原主要來(lái)源于稻瘟病多發(fā)區(qū)域內(nèi)經(jīng)長(zhǎng)時(shí)間自然選擇留下的品種及野生稻和栽培稻等稻種資源中表現(xiàn)出抗稻瘟病的品種[6]。根據(jù)Flor[9]的基因?qū)驅(qū)W說(shuō)，水稻在抵抗稻瘟病菌侵染過(guò)程中，寄主的抗病基因與稻瘟病菌的無(wú)毒基因間編碼產(chǎn)物可互作識(shí)別，引發(fā)過(guò)敏性壞死反應(yīng)（HR），抑制稻瘟病菌在植株中的擴(kuò)展，從而產(chǎn)生抗病效應(yīng)[10]，李宏宇等[11]認(rèn)為水稻與稻瘟病菌之間的特異互作符合“基因?qū)颉奔僬f(shuō)，即水稻品種有一種抗病基因R，稻瘟菌中就會(huì)有一個(gè)與之對(duì)應(yīng)的無(wú)毒基因。福建省是稻瘟病多發(fā)地區(qū)，國(guó)內(nèi)已有不少學(xué)者對(duì)福建省的稻瘟病菌小種組成、分布和消長(zhǎng)動(dòng)態(tài)、稻瘟病菌無(wú)毒基因在地區(qū)和年份間差異情況進(jìn)報(bào)道[12?21]。【本研究切入點(diǎn)】隨著福建省主栽品種的變化，稻瘟病菌的無(wú)毒基因出現(xiàn)頻率也隨之改變，因此有必要分析稻瘟病菌近年來(lái)無(wú)毒基因年份間的動(dòng)態(tài)變化情況。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究通過(guò)采集、分離2018—2020年福建省各主要稻區(qū)的稻瘟病生理小種，篩選出具有抗性頻率高、廣譜抗性的抗瘟基因，為今后根據(jù)不同地區(qū)流行菌株的無(wú)毒基因型和變化趨勢(shì)選擇培育具有相應(yīng)廣譜抗病基因的水稻品種并進(jìn)行合理布局，為提高水稻品種的抗性水平、延長(zhǎng)抗性周期、防治稻瘟病奠定基礎(chǔ)[22?27]。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

24個(gè)近等基因水稻（NILs）和對(duì)照高感品種麗江新團(tuán)黑谷（LTH）由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所田大剛轉(zhuǎn)贈(zèng)。供試的稻瘟病菌單孢分別于2018—2020年采集自福建省南平、三明、龍巖等26個(gè)水稻種植地，每年9月中下旬（中稻黃熟期）隨機(jī)采集稻瘟病發(fā)生區(qū)域的穗頸部樣本，標(biāo)明采集日期和地點(diǎn)，共計(jì)樣本179份（表1）。每年分離的稻瘟病菌單孢培養(yǎng)于濾紙片上并放?20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 2018—2020年福建省稻瘟病菌供試菌株Table 1 M. oryzae sample collection, 2018-2020

1.2 試驗(yàn)方法

致病性測(cè)定方法參照陳福如等[20]的方法以及稻瘟病苗期鑒定標(biāo)準(zhǔn)，病情調(diào)查方法參照辛威等[5]的方法。單個(gè)稻瘟病菌株的致病力（Pathogenic frequency，PF）、致病力類型劃分等參考楊秀娟等[21]的方法。致病力PF（%）=（感病水稻資源材料數(shù)量/所有供試水稻資源材料總數(shù)）×100。當(dāng)PF≥ 70.0%時(shí)為強(qiáng)致病力，70.0%＞PF≥50.0%時(shí)為較強(qiáng)致病力，50.0%＞PF≥20.0%時(shí)為中等致病力，PF＜20.0%時(shí)為弱致病力。

單個(gè)抗病基因的抗性頻率（Resistance frequency，RF）RF（%）=（對(duì)測(cè)試抗病基因無(wú)致病力的菌株數(shù)/所有菌株數(shù)）×100。

稻瘟病菌培養(yǎng)基為淀粉培養(yǎng)基，配方：可溶性淀粉10 g，酵母膏2 g，CaCo33 g，瓊脂粉16 g，蒸餾水1 000 mL，pH6.5。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

根據(jù)供試菌株對(duì)NILs的致病情況建立0-1數(shù)據(jù)庫(kù)，抗病記為1，感病記為0。用IBM SPSS Statistics19數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，對(duì)供試菌株進(jìn)行分類劃分并綜合衡量其遺傳差異大小，構(gòu)建其遺傳關(guān)系樹狀，參考劉翔[1]的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 福建省稻瘟病菌株對(duì)已知抗病基因水稻品種的致病性

供試的179個(gè)稻瘟病菌株對(duì)24個(gè)含單個(gè)抗病基因水稻品種的致病性顯示，強(qiáng)致病力菌株占比26.81%，較強(qiáng)致病力菌株占比36.31%，中等致病力菌株占比27.37%，弱致病力菌株占比9.51%，較強(qiáng)致病力菌株占優(yōu)勢(shì)，說(shuō)明福建省的大多數(shù)稻瘟病菌株對(duì)供試24個(gè)抗病基因表現(xiàn)較強(qiáng)的致病力。

2.2 單個(gè)抗稻瘟病基因?qū)Ω＝ㄊ〉疚敛【目剐灶l率

表2顯示，24個(gè)含單個(gè)抗病基因的近等基因系對(duì)福建省的稻瘟病菌群體的抗性頻率為19.32%～91.49%，其中Pi-z5和Pi-9（t）兩個(gè)抗病基因的抗性頻率最高，分別為91.49%和91.25%，Pi-kh和Pi-1兩個(gè)抗病基因的抗性頻率也較高，在80%～90%，Pi-7（t）、Pi-5（t）、Pi-k、Pi-12（t）等4個(gè)抗病基因的抗性頻率在70%～80%，Pi-ta和Pi-b的抗性頻率較低，低于20%。

表2 抗稻瘟病基因?qū)Ω＝ㄊ〉疚敛【目剐灶l率Table 2 Effect of blast resistant genes on frequency of resistance to M. oryzae isolated in Fujain

2.3 福建省稻瘟病菌無(wú)毒基因在2018—2020年間的分布

表3中24個(gè)福建稻瘟病菌的無(wú)毒基因在2018—2020年的分布變化情況可以看出，2018—2020年24個(gè)無(wú)毒基因出現(xiàn)的總的平均頻率逐年下降，由2018年的49.57%下降至2020年的38.01%，Avr-Z5，Avr-9（t）這2個(gè)無(wú)毒基因在3個(gè)年度中出現(xiàn)的頻率都在80%以上，平均出現(xiàn)頻率分別為88.95%和87.37%，年度間變化不大且穩(wěn)定；Avr-1、Avr-kh、Avr-k、Avr-12（t）、Avr-7（t）、Avr-5（t）、Avr-3等7個(gè)無(wú)毒基因出現(xiàn)的平均頻率在50%～80%；無(wú)毒基因在2018—2020年出現(xiàn)頻率下降20%的有9個(gè)，分別為Avr-kh、Avr-7（t）、Avr-5（t）、Avr-3、Avr-kp、Avr-19（t）、Avr-km、Avr-z和Avr-ks，無(wú)毒基因在2018—2020年出現(xiàn)頻率上升20%有1個(gè)，Avr-20的頻率由16.67%上升至50.00%。平均出現(xiàn)頻率低于20%的3個(gè)無(wú)毒基 因?yàn)锳vr-ks、Avr-b、Avr-ta，應(yīng)用中應(yīng)謹(jǐn)慎使用。

表3 福建省稻瘟病菌無(wú)毒基因在2018-2020年間的分布Table 3 Distribution of avirulent genes of M. oryzae in Fujian, 2018-2020

2.4 2018—2020年福建省稻瘟病菌的無(wú)毒基因的數(shù)量

表4的結(jié)果顯示，檢測(cè)的179個(gè)稻瘟病菌株分別含有0～22個(gè)數(shù)目不等的無(wú)毒基因，在數(shù)目上共出現(xiàn)了23種類型，含有6、7、8、9、11個(gè)無(wú)毒基因的病菌最多，在群體中的頻率分別為10.06%、8.94%、8.94%、7.82%和8.38%，其中含有6個(gè)無(wú)毒基因的頻率 最高。

表4 2018—2020年福建省稻瘟病菌的不同數(shù)量無(wú)毒基因出現(xiàn)頻率Table 4 Occurrence frequency of avirulent gene combinations of M. oryzae in Fujian, 2018-2020

2.5 稻瘟病菌無(wú)毒基因在福建省9個(gè)地區(qū)的分布

表5的結(jié)果顯示，武夷山、松溪、邵武、浦城、光澤、建陽(yáng)、寧化、將樂(lè)和上杭等9個(gè)地區(qū)都分布有24個(gè)無(wú)毒基因，無(wú)毒基因分布數(shù)量和出現(xiàn)頻率較高為上杭（49.19%），光澤次之（48.18 %），武夷山最低（41.23%）。在各地區(qū)中出現(xiàn)頻率達(dá)到90%以上的無(wú)毒基因有6個(gè)，分別為Avr-1、Avr-5、Avr-7、Avr-Z5和Avr-9、Avr-kh，其中Avr-1出現(xiàn)頻率最高的地區(qū)為寧化（94.74%），Avr-5出現(xiàn)頻率最高的地區(qū)為浦城（95.66%），Avr-Z5在武夷山、松溪、邵武、光澤、建陽(yáng)和寧化等出現(xiàn)頻率都達(dá)到了90%以上，Avr-7出現(xiàn)頻率最高的地區(qū)為邵武（98.50%），Avr-9在武夷山、邵武和上杭的出現(xiàn)頻率都達(dá)到了90%以 上，Avr-kh出現(xiàn)頻率最高的地區(qū)為將樂(lè)（90.91%）。

表5 稻瘟病菌無(wú)毒基因在福建省9個(gè)地區(qū)的分布Table 5 Distribution of M. oryzae avirulent genes in 9 regions in Fujian

2.6 179個(gè)菌株的抗性鑒定數(shù)據(jù)聚類分析

利用IBM SPSS Statistics19軟件聚類分析179個(gè)菌株對(duì)24個(gè)含單個(gè)抗病基因近等基因系的鑒定結(jié)果（圖1）表明，歐式距離（Euclidean distance）越小，菌株的遺傳距離越近，在歐式距離20遺傳相似水平處，不同抗病基因?qū)Σ煌甑目垢胁町惪梢园?79個(gè)菌株劃分為7個(gè)遺傳譜系（遺傳相似組）。在7個(gè)遺傳譜系中，第Ⅰ譜系為優(yōu)勢(shì)譜系，含有124個(gè)菌株，占總數(shù)的69.27%；第Ⅱ譜系含有3個(gè)菌株；第Ⅲ譜系含有2個(gè)菌株，第Ⅳ譜系含有5個(gè)菌株，第Ⅴ譜系含有2個(gè)菌株，第Ⅵ譜系含有20個(gè)菌株，第Ⅶ譜系含有23個(gè)菌株。不同地區(qū)不同年份的菌株存在一定的遺傳相似性，但是大多數(shù)的遺傳相似程度并不與地區(qū)和年份的變化而呈現(xiàn)出很大的關(guān)聯(lián)性，例如歐式距離為1的相似菌株為4組，圖中由上至下依次為：第一組25號(hào)和75號(hào)菌株分別為2018年和2019年采集的光澤地區(qū)的稻瘟病菌單孢，第二組的57號(hào)和69號(hào)菌株分別為2018年采集的上杭地區(qū)的稻瘟病菌單孢和2018年松溪地區(qū)采集的稻瘟病菌單孢，第三組的2號(hào)和112號(hào)菌株分別為2018年采集的光澤地區(qū)的稻瘟病菌單孢和2019年建陽(yáng)地區(qū)采集的稻瘟病菌單孢，第四組的84號(hào)和99號(hào)菌株都為2019年采集的將樂(lè)地區(qū)的稻瘟病菌單孢。從譜系的結(jié)果看稻瘟病菌的無(wú)毒基因在同一地區(qū)的種群豐富，在演變上隨機(jī)性較強(qiáng)且演變速度較快。

圖1 179個(gè)稻瘟病菌菌株對(duì)24個(gè)NILs親和反應(yīng)型的聚類分析結(jié)果Fig. 1 Dendrogram on compatible response of 179 M. oryzae isolates to 24 NILs

3 討論與結(jié)論

目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)于無(wú)毒基因與寄主之間的作用原理提出了以下幾點(diǎn)假說(shuō)：Hammone-kosack K E等認(rèn)為病原物侵染寄主時(shí)，無(wú)毒基因（Avr）編碼蛋白會(huì)被寄主細(xì)胞內(nèi)對(duì)應(yīng)的抗病基因產(chǎn)物識(shí)別，信號(hào)分子將局部性侵染反應(yīng)迅速傳遞到整個(gè)植株，從而激活被侵入點(diǎn)細(xì)胞發(fā)生過(guò)敏性反應(yīng)（hypersensitive response，HR）即防衛(wèi)抗性機(jī)制，最終導(dǎo)致寄主細(xì)胞程序性死亡（PCD），病原物也因失去寄生繁殖生長(zhǎng)受到抑制[27]從而獲得系統(tǒng)性抗性（systemic acquired resistance，SAR）。Mayank等[28]提 出 保 衛(wèi) 假 說(shuō)（guard hypothesis），該假說(shuō)認(rèn)為病原物的無(wú)毒基因的毒性因子Avr蛋白先與寄主體內(nèi)相應(yīng)的毒性靶向物接觸,并結(jié)合一起形成感受信號(hào)復(fù)合體，從而啟動(dòng)防衛(wèi)基因的表達(dá)激發(fā)植株產(chǎn)生抗性。Flor[9]提出“基因?qū)颉奔僬f(shuō)（gene-for-gene hypothesis），該假說(shuō)認(rèn)為病原的無(wú)毒基因編碼特異的激發(fā)子，引起細(xì)胞程序性死亡即過(guò)敏性反應(yīng)；本試驗(yàn)開展的理論基礎(chǔ)就是基于基因?qū)蚣僬f(shuō)以及稻瘟病菌與寄主水稻之間的互作效應(yīng)。

本試驗(yàn)于2018—2020年收集并分離福建省9個(gè)水稻主產(chǎn)區(qū)的中稻穗頸瘟單孢菌株179份，分別接菌鑒定24份含單個(gè)抗病基因的近等基因系。結(jié)果表明福建省較強(qiáng)致病力菌株占優(yōu)勢(shì)?？共』虻目剐灶l率較高的有4個(gè)，其中Pi-z5和Pi-9（t）兩個(gè)抗病基因的抗性頻率最高，分別為91.49%和91.25%，Pi-kh和Pi-1兩個(gè)抗病基因的抗性頻率在80%-90%，Pi-7（t）、Pi-5（t）、Pi-k、Pi-12（t）等4個(gè)抗病基因的抗性頻率在70%-80%，這些抗病基因在育種中可以重點(diǎn)采用。出現(xiàn)頻率低于20%的3個(gè)無(wú)毒基因Avr-ks、Avr-b、Avr-ta應(yīng)用中需注意觀察，謹(jǐn)慎使用。楊秀娟等[21]利用41個(gè)已知抗病基因水稻品種測(cè)定2003-2006年從福建省主要稻區(qū)采集分離的87個(gè)稻瘟病單胞菌株的致病性，結(jié)果表明：病菌群體對(duì)水稻抗病基因Pi-d2、Pi-k（1）、Pi-km、Pi-kh、Pi-1（1）、Pi-z5（1）、Pi-z5（2）、Pi-1（2）的毒力頻率均低于10%，提示這些抗病基因在福建省可作抗原使用；阮宏椿等[3]利用CO39近等基因系來(lái)鑒定2012-2015年間從福建省各稻區(qū)種植的普感品種麗江新團(tuán)黑谷上采集的347株稻瘟病菌單孢菌株，結(jié)果表明：Pi-km、Pi-7（t）、Pi-9（t）、Pi-kp、Pi-k、Pi-kh、Pi-z5、Pi-ta等8個(gè)抗病基因的抗病性較強(qiáng)，抗譜均高于70%；本試驗(yàn)的鑒定結(jié)果與前人成果大致相同，主要區(qū)別為本研究結(jié)果中的抗病基因Pi-ta和Pi-km的抗性頻率較前人研究結(jié)果下降幅度較大，應(yīng)用時(shí)需謹(jǐn)慎，Pi-12（t）的抗性頻率有所上升，可以考慮采用，這也同時(shí)說(shuō)明隨著福建省水稻主栽品種的布局變化，稻瘟病菌的無(wú)毒基因優(yōu)勢(shì)基因型也隨之改變。因此，持續(xù)監(jiān)測(cè)近年來(lái)的稻瘟病菌無(wú)毒基因型的組成和變化是抗病育種和抗病品種布局的關(guān)鍵依據(jù)。

Pi-z5和Pi-9（t）這兩個(gè)抗病基因是本研究結(jié)果中對(duì)福建省的稻瘟病菌抗性頻率最高的。Pi9基因定位于第6號(hào)染色體上，是一個(gè)廣譜的稻瘟病抗病基因。Qu等[29]研究發(fā)現(xiàn)Pi9的cDNA全長(zhǎng)為4 009 bp，包括一段3 099 bp的編碼區(qū)和910 bp非編碼區(qū)，Pi9編碼一個(gè)羧基端含有富亮氨酸重復(fù)域（LRRs）的1 032個(gè)氨基酸組成的蛋白產(chǎn)物。在水稻中，Pi9基因是組成型表達(dá)，不受病原菌的誘導(dǎo)。Piz5基因也是定位在水稻第6號(hào)染色體上（又名Pi2），與Pi9基因復(fù)等位，也是一個(gè)廣譜的稻瘟病抗病基因。其最先被定位在標(biāo)記RG64和RZ612之間[30?31]。而后被精細(xì)定位在分子標(biāo)記RG64和AP22之間[32]，Zhou等采用與克隆Pi9基因相同的方法克隆了Piz5基因，證明Piz5基因也屬于NBS-LRR類基因，與Pi9相同也含有2個(gè)內(nèi)含子，其cDNA全長(zhǎng)3332 bp，Piz5編碼由1個(gè)核苷酸結(jié)合位點(diǎn)（NBS）和3個(gè)富亮氨酸重復(fù)區(qū)（LRR）組成的包含1032個(gè)氨基酸的蛋白產(chǎn)物[33?37]。

本研究菌株的采樣方式為每年福建省中稻生產(chǎn)中稻瘟病發(fā)生地隨機(jī)采樣，不同于前人研究中的從單一的感病品種上采樣，隨機(jī)采樣存在如遇某地某年稻瘟病不發(fā)生則缺少樣本的情況，存在連續(xù)性不強(qiáng)的缺點(diǎn)，但是隨機(jī)采樣的樣本更能反映生產(chǎn)中主栽品種上正在流行的菌株，筆者認(rèn)為隨機(jī)采樣更具有代表性。另外，稻瘟病菌群體的聚類分析結(jié)果顯示，同一地區(qū)的稻瘟病菌的菌群豐富且具有多樣性，今后應(yīng)擴(kuò)大采樣群體，加大分離稻瘟病菌單孢的數(shù)量，擴(kuò)大群體進(jìn)行研究以便得到更加完善的結(jié)論。