釀酒酵母高密度增殖酒糟多肽糖蜜培養(yǎng)基優(yōu)化

蘇 昊，梁璋成，林曉姿，何志剛 ，鄧冬蓮，林曉婕

[1. 福建省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究所，福建 福州 350003；2. 福建省農(nóng)產(chǎn)品（食品）加工重點實驗室，福建 福州 350003]

0 引言

【研究意義】釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是酵母菌屬中最重要、應用最廣泛的一類，在食品發(fā)酵、功能性營養(yǎng)源和生物領(lǐng)域等有重要作用[1]。釀酒酵母菌體富含活性多糖[2]、蛋白質(zhì)[3]、活性肽[4]、核酸[5]、氨基酸[6]、維生素[7]等營養(yǎng)功能成分，被不斷研究開發(fā)并應用于醫(yī)藥、功能食品和飼料等多個行業(yè)。釀酒酵母高密度發(fā)酵過程中，培養(yǎng)基的營養(yǎng)控制是關(guān)鍵，其營養(yǎng)成分不均衡會使酵母細胞的生長受到抑制。實現(xiàn)釀酒酵母產(chǎn)業(yè)化應用的前提是獲得高濃度的酵母細胞。酵母工業(yè)化生產(chǎn)培養(yǎng)基主要原料來源于制糖廢料糖蜜，糖蜜長期以來作為發(fā)酵工業(yè)中的碳源用于發(fā)酵生產(chǎn)酵母，是酵母生產(chǎn)中不可缺少及替代的廉價原料[8]。【前人研究進展】已有研究表明小麥、大豆等谷物蛋白酶解物中的多種小分子多肽，包括Leu-Asp、Ala-Leu-Asp、Ala-Gln-Pro、Glu-Asn-Gly、Leu-Leu-Leu-Trp、Pro- Pro-Tyr等，可促進酵母細胞的生長[9?10]，并可提高釀酒酵母的逆環(huán)境耐受性和細胞存活率，促進酵母細胞的增殖[11?13]。前期研究還發(fā)現(xiàn)以紅曲酒糟酶解制備的多肽[14?15]中的天門冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和甘氨酸總質(zhì)量分數(shù)達53.50%，是一種優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)營養(yǎng)資源。作為酵母的增殖培養(yǎng)基，糖蜜存在營養(yǎng)不均衡的缺陷，往往需要添加一種或多種的氮碳源、無機鹽類及其他增殖因子等營養(yǎng)強化劑，以實現(xiàn)有效的高密度培養(yǎng)。如Wang等[16]利用常見的農(nóng)副產(chǎn)物，在糖蜜的基礎(chǔ)上，添加1.56%的麥麩和0.21%的CaCO3，對馬克斯克魯維酵母的增殖培養(yǎng)基進行優(yōu)化，優(yōu)化后的培養(yǎng)基中酵母生長菌量達到了7.8×108cfu·mL?1，是YPD培養(yǎng)基的4.11倍，同時原料成本僅為其1/6。紅曲酒糟作為紅曲黃酒生產(chǎn)中的重要副產(chǎn)物，其中含有大量可被轉(zhuǎn)化的氨基酸和小分子多肽成分，原料來源廣泛且價格低廉，可用于酵母的增殖。【本研究切入點】但目前，使用酒糟中的多肽成分作為酵母增殖因子的相關(guān)報道仍然鮮見?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究以分離于紅曲黃酒中的優(yōu)良釀酒酵母JH301[17]為研究對象，以酵母菌工業(yè)生產(chǎn)常用糖蜜為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，以紅曲酒糟制備的酒糟多肽為天然活性增殖因子，輔以多種碳源、氮源、無機鹽，對培養(yǎng)基的配方加以優(yōu)化，為制備釀酒酵母高活力菌劑提供低成本高密度培養(yǎng)基。

1 材料與方法

1.1 試驗試劑

孟加拉紅培養(yǎng)基：市售，用于釀酒酵母計數(shù)。

紅曲酒糟：由福建寧德黃家酒業(yè)提供，當年生產(chǎn)紅曲酒糟，60 ℃烘干粉碎后備用；蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)38.2%，含水量10.3%。

復合蛋白酶（200000 U·g?1），江蘇銳陽生物科技有限公司。

大米、大蒜等輔料均為市購。

糖蜜、菊粉和大豆多糖等添加劑均為食品級，其他化學試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

SPX-250BS-II生化培養(yǎng)箱（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司），YXQ-CS-50S II全自動立式壓力蒸汽滅菌器（上海博達實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠），SWCJ-1FD型單人單面凈化工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司），UV-1750紫外可見分光光度計（蘇州島津儀器有限公司），F(xiàn)E28型pH酸度計（梅特勒-托利多），HH-8數(shù)顯電熱恒溫水浴鍋（常州億通分析儀器制造有限公司）。

1.3 材料制備

釀酒酵母JH301：分離于紅曲米，由福建省農(nóng)產(chǎn)品（食品）加工重點實驗室選育，保藏號：CCTCC M2015226。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基制備：將糖蜜用蒸餾水攪拌稀釋至可溶性固形物為45%～50%，使用檸檬酸pH值調(diào)節(jié)至3.5～3.8，攪拌加熱至90 ℃保溫10 min，冷卻靜置后取上清液稀釋至可溶性固形物含量為10%，調(diào)節(jié)pH值至4.5±0.2。

酒糟多肽制備：本實驗室自制。將紅曲酒糟和水以固液比為1∶10混勻，加入1%蛋白復合酶，調(diào)節(jié)pH值為8.5，50 ℃下恒溫酶解3 h，121 ℃下滅酶10 min，冷卻靜置收集上清液，備用。其中，可溶性蛋白含量不低于250 g·L?1。

大米糖化液制備：按米飯與水質(zhì)量比1:1混合，添加70 U·g?1的淀粉酶、560 U·g?1糖化酶，60 ℃下酶解2 h，冷卻并調(diào)整糖化液可溶性固形物為30%，備用。

大蒜汁制備：去皮大蒜與水質(zhì)量比1∶2，攪碎，攪拌加熱至微沸。過濾，冷卻，115 ℃滅菌20 min。

1.4 試驗方法

1.4.1 種子液的制備 將釀酒酵母JH301菌種接入基礎(chǔ)培養(yǎng)基，在30 ℃、150 r·min?1的搖床上培養(yǎng)18 h，獲 得種子液。

1.4.2 單因素試驗 將基礎(chǔ)培養(yǎng)基分別添加不同質(zhì)量濃度的碳源、氮源、無機鹽與天然產(chǎn)物促進因子，其中碳源（葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、半乳糖、海藻糖、棉籽糖）的添加量分別為10、30、50、70、90 g·L?1；氮源（胰蛋白胨、硫酸銨、硝酸鉀、銨水、牛肉膏）的添加量分別為5、10、20、30、40、50 g·L?1；無機鹽（硫酸鎂、氯化鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀）的添加量分別為0.5、1.0、3.0、5.0、7.0 g·L?1；天然產(chǎn)物增殖因子（大米糖化液、大豆多糖、酒糟多肽、菊粉、大蒜汁）的添加量分別為10、30、50、70、90 g·L?1。按體積分數(shù)2%的接種量接入活化后的釀酒酵母種子液，分別測定培養(yǎng)時間0 和18 h的培養(yǎng)液OD600值，計算ΔOD600=OD18 h?OD0h，以基礎(chǔ)培養(yǎng)基發(fā)酵18 h的ΔOD600為對照CK，考察 各營養(yǎng)強化劑對釀酒酵母JH301生長的影響。

1.4.3 增殖培養(yǎng)基優(yōu)化 根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選取對釀酒酵母增殖影響顯著的碳源、氮源、無機鹽及天然產(chǎn)物增殖因子作為影響因子，以酵母菌菌體密度為指標，采用均勻試驗對培養(yǎng)基配方進行優(yōu)化。各處理培養(yǎng)基pH均調(diào)節(jié)至4.5±0.2，按體積分數(shù) 2%的接種量接種后于30 ℃培養(yǎng)18 h。

1.4.4 指標測定

（1）釀酒酵母OD值的測定

取發(fā)酵后的菌懸液，稀釋10倍后，使用光密度法測定OD600吸光值[18]。

（2）釀酒酵母生物量

參照GB 4789.15—2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗霉菌和酵母計數(shù)》中的方法測定酵母菌生物量，采用平板計數(shù)法。

（3）釀酒酵母菌體密度對數(shù)值

菌體密度對數(shù)值以酵母生物量的log值進行換算得到。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用DPS 7.05軟件中的Duncan法對單因素試驗中，不同質(zhì)量濃度和不同種類的碳源、氮源、無機鹽及天然產(chǎn)物增殖因子對酵母菌增殖量即ΔOD600的差異性進行比較，篩選出對酵母菌增殖有顯著促進作用的營養(yǎng)因子及其質(zhì)量濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 碳源對釀酒酵母JH301生長的影響

由圖1可見，以添加量為0 g·L?1碳源的試驗組為CK，隨著培養(yǎng)基中碳源濃度的增加，添加不同碳源處理的ΔOD600均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，且差異顯著。其中，海藻糖、棉籽糖、葡萄糖的增殖效果較好，在添加30 g·L?1海藻糖、50 g·L?1棉籽糖和30 g·L?1葡萄糖時有最大值，碳源ΔOD600分別比CK提高了1.42、1.46和1.11倍，這3個處理的ΔOD600均顯著高于蔗糖、半乳糖和麥芽糖，表明海藻糖、棉籽 糖和葡萄糖是促進釀酒酵母JH301生長的適宜碳源。

圖1 碳源種類及質(zhì)量濃度對JH301生長的影響Fig. 1 Effects of C sources and concentrations on growth of JH301

2.2 氮源對釀酒酵母JH301生長的影響

由圖2可知，不同氮源對酵母的增殖效果存在差異，以添加量為0 g·L?1氮源的試驗組為CK，隨著培養(yǎng)基中氮源質(zhì)量濃度的增加，添加胰蛋白胨的處理ΔOD600呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在添加30 g·L?1時達到最高，比CK的ΔOD600提高了1.28倍，添加氨水、硝酸鉀、硫酸鎂、牛肉膏的最高ΔOD600增量均顯著低于添加30 g·L?1胰蛋白胨的處理，表明胰蛋白胨是促進釀酒酵母JH301生長的適宜氮源。

圖2 氮源種類及質(zhì)量濃度對JH301生長的影響Fig. 2 Effects of N sources and concentrations on growth of JH301

2.3 無機鹽對釀酒酵母JH301生長的影響

由圖3可知，以添加量為0 g·L?1無機鹽的試驗組為CK，隨著培養(yǎng)基中無機鹽質(zhì)量濃度的增加，添加硫酸鎂、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀的處理ΔOD600均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，分別在添加1 g·L?1硫酸鎂、3 g·L?1磷酸氫二鉀、5 g·L?1磷酸二氫鉀 時 有 最 大 值，其 中 添 加5 g·L?1磷 酸 二 氫 鉀的ΔOD600最大，與前兩個處理差異均達顯著水平，是促 進釀酒酵母JH301生長的適宜無機鹽。

圖3 無機鹽種類及質(zhì)量濃度對JH301生長的影響Fig. 3 Effects of inorganic salts and concentrations on growth of JH301

2.4 天然產(chǎn)物增殖因子對釀酒酵母JH301生長的影響

由圖4可知，以添加量為0 g·L?1天然產(chǎn)物增殖因子的試驗組為CK，隨著培養(yǎng)基中天然產(chǎn)物增殖因子質(zhì)量濃度的增加，添加大米糖化液、大豆多糖、酒糟多肽、菊粉、大蒜汁的處理ΔOD600均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，且差異顯著，分別在添加50 g·L?1大米糖化液、50 g·L?1大豆多糖、50 g·L?1酒糟多肽、30 g·L?1菊粉、10 g·L?1大蒜汁時有最大值。大米糖化液、大豆多糖和酒糟多肽的ΔOD600分別比CK提高了0.82、0.96和1.22倍，均顯著高于菊粉、大蒜汁。因此選擇酒糟多肽、大豆多糖、大米糖化液作為 適宜增殖因子進行后續(xù)試驗。

圖4 天然產(chǎn)物增殖因子及質(zhì)量濃度對JH301生長的影響Fig. 4 Effects of natural growth promoters and concentrations on growth of JH301

2.5 增殖培養(yǎng)基的優(yōu)化

用均勻設(shè)計法考察培養(yǎng)基各成分磷酸二氫鉀（x1）、胰蛋白胨（x2）、海藻糖（x3）、葡萄糖（x4）、棉籽糖（x5）、酒糟多肽（x6）、大豆多糖（x7）、大米糖化液（x8）對釀酒酵母JH301菌體密度的影響 ，結(jié)果見表1。

表1 U16（88）均勻試驗結(jié)果Table 1 Results of U16(88) uniform test

2.5.1 多因子及平方項逐步回歸分析 以菌體密度對數(shù)值為目標值進行多因子及平方項逐步回歸分析，得到回歸方程：

回歸方程系數(shù)R2=0.9996，P＜0.01。由回歸方程可知，釀酒酵母JH301的增殖與胰蛋白胨（x2）、葡萄糖（x4）、棉籽糖（x5）、酒糟多肽（x6）、大豆多糖（x7）、大米糖化液（x8）呈開口向下的拋物線關(guān)系，與海藻糖（x3）呈負相關(guān)關(guān)系。模型1尋優(yōu)后得到最優(yōu)培養(yǎng)基組合見表2，預測釀酒酵母JH301培養(yǎng)的最高菌體密度對數(shù)值為8.19。

表2 模型1優(yōu)選培養(yǎng)基組合Table 2 Medium formulation optimization by stepwise regression of multiple factors and square terms

2.5.2 多因子及互作項逐步回歸分析 以菌體密度對數(shù)值為目標值通過偏最小二乘法考慮互作項的回歸方法，建立回歸模型：

回歸模型R2=1.0000，P＜0.01。模型2尋優(yōu)后得到最優(yōu)培養(yǎng)基組合見表3，模型預測釀酒酵母JH301培 養(yǎng)的最高菌體密度對數(shù)值為9.51。

表3 模型2優(yōu)選培養(yǎng)基組合Table 3 Medium formulation optimization by stepwise regression of multiple factors and interaction

2.5.3 二次多項式逐步回歸分析 以菌體密度對數(shù)值為目標值，進行二次多項式逐步回歸分析，建立回歸模型：

回歸模型R2=1.0000，P＜0.01。模型3尋優(yōu)后得到最優(yōu)培養(yǎng)基組合見表4，模型預測釀酒酵母JH301培 養(yǎng)的最高菌體密度對數(shù)值為8.79。

表4 模型3優(yōu)選培養(yǎng)基組合Table 4 Medium formulation optimization by quadratic polynomial stepwise regression analysis

2.5.4 驗證試驗 根據(jù)各模型的優(yōu)選培養(yǎng)基成分組合配制培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)pH為4.5±0.2，測定酵母菌生物量。根據(jù)模型2和模型3的培養(yǎng)基最優(yōu)組合進行驗證培養(yǎng)，18 h后菌體密度對數(shù)值分別為7.23和7.65，與對應模型預測結(jié)果差異均達極顯著水平（P＜0.01）；而模型1的培養(yǎng)基最優(yōu)組合培養(yǎng)釀酒酵母的菌體密度對數(shù)值可達8.17（生物量為1.48×108cfu·mL?1），與該模型預測結(jié)果差異不顯著（P＞0.05），顯著高于對照組基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)18 h后活菌密度7.08（生物量為1.23×107cfu·mL?1），生物量提高1個數(shù)量級以上。因此，選擇模型1的數(shù)學模型：Y=5.93+0.18x2?0.010x3+0.06x4+0.21x5+0.21x6+0.18x7+0.16x8?0.021x22?0.009x42?0.023x52?0.022x62?0.016x72?0.021x82為 酵 母 增 殖 數(shù) 學模型，尋優(yōu)的培養(yǎng)基組合即為釀酒酵母增殖培養(yǎng)基配 方。

3 討論與結(jié)論

培養(yǎng)基中添加額外營養(yǎng)成分在酵母發(fā)酵生產(chǎn)研究和應用中已經(jīng)很常見，如在啤酒高濃釀造中補充營養(yǎng)物質(zhì)可以促進酵母的生長代謝和發(fā)酵性能，補充適量的氮源不僅可供酵母繁殖同化之用，而且有助于酵母抵抗高滲透壓和乙醇濃度[19]。應用于酵母發(fā)酵中的氮源主要是氨基酸、蛋白胨、銨鹽以及植物蛋白水解物等，而近年來的很多研究發(fā)現(xiàn)，植物蛋白水解物中能分離出各種生物活性肽。奚寬鵬等[20]發(fā)現(xiàn)小麥面筋蛋白水解物中的小分子肽可以調(diào)節(jié)酵母生長、改善酵母的滲透壓耐受性，其中促進酵母的生長和發(fā)酵的主要是小于3 kDa的活性肽；劉夢蘭等[21?22]明確了大豆多肽能夠促進酵母細胞增殖、增強酵母細胞的耐凍性、提高面團的發(fā)酵效果；Kitagawa等[23]發(fā)現(xiàn)添加0.5%的大豆肽能夠有效促進酵母生長，提髙發(fā)酵速率，而且同時也證明酵母對小分子肽的代謝優(yōu)于游離氨基酸。前期研究發(fā)現(xiàn)酒糟經(jīng)復合酶分解得到的多肽成分多達18種氨基酸，其構(gòu)成的多肽成分種類組成上要高于已有報道其他植物蛋白酶解物，其中天門冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸等構(gòu)成的有助于酵母生長的小分子多肽含量達到了53.5%[14]，這些活性肽成分在酵母增殖過程中可被優(yōu)先吸收利用，為釀酒酵母快速增殖奠定基礎(chǔ)，除此之外還含有精氨酸、亮氨酸等作為調(diào)節(jié)因子，增強酵母細胞對小分子肽的感應能力，促進細胞對小分子肽的吸收[20]，因而酒糟多肽可作為釀酒酵母增殖的優(yōu)良復合營養(yǎng)劑。

目前，對釀酒酵母培養(yǎng)基的優(yōu)化研究多集中于實驗室培養(yǎng)模式的優(yōu)化，如王穎等[24]優(yōu)化葡萄糖組成后可提高菌量22%；汪芳等[25]優(yōu)化碳源、氮源用量使細胞干重達到30.62 g·L?1；陳雪等[26]將酵母浸粉作為活性增殖因子加入培養(yǎng)基，使酵母菌干質(zhì)量較優(yōu)化前提高了23.3%，等等。采用糖蜜進行酵母培養(yǎng)時，往往需要額外添加碳源、氮源、無機鹽等對其進行營養(yǎng)強化，同時添加植物源多肽等增殖因子以達到促進酵母菌增殖的作用。相比其他已有的對酵母增殖培養(yǎng)的研究，本文采用酒糟多肽作為釀酒酵母天然增殖因子，其與常規(guī)的葡萄糖、海藻糖、胰蛋白胨等營養(yǎng)物質(zhì)進行培養(yǎng)基的優(yōu)化，經(jīng)優(yōu)化后配方培養(yǎng)，可使釀酒酵母菌量提高了91.6%，酵母菌干質(zhì)量提高了30%，增菌效果顯著，達到了高密度培養(yǎng)的目的。紅曲酒糟是紅曲黃酒生產(chǎn)的主要副產(chǎn)物，生產(chǎn)1 t紅曲黃酒可產(chǎn)生200 kg左右的酒糟，目前其主要作為普通的飼料出售，附加值低[27]。紅曲酒糟中含有30%～40%的粗蛋白[28]，經(jīng)酶解處理成為酒糟多肽，酒糟多肽含有豐富的小分子肽成分，可作為釀酒酵母的生長營養(yǎng)因子及優(yōu)良的增殖營養(yǎng)劑。將紅曲酒糟經(jīng)酶解后制備為酒糟多肽，作為酵母增殖培養(yǎng)的營養(yǎng)劑，原料來源豐富，又提高其附加值，實現(xiàn)了酒糟廢棄資源的高值化利用。

本研究以釀酒酵母JH301為對象，在糖蜜基礎(chǔ)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，通過均勻試驗，獲得釀酒酵母高密度增殖培養(yǎng)基最優(yōu)組合為：在可溶性固形物10%的糖蜜中分別添加酒糟多肽23.72 g·L?1、大米糖化液44.15 g·L?1、大豆 多 糖31.88 g·L?1、棉 籽糖22.45 g·L?1、葡萄糖13.97 g·L?1、海藻糖15.00 g·L?1、胰蛋白胨27.25 g·L?1、磷酸二氫鉀3.00 g·L?1，調(diào)節(jié)pH為4.5±0.2。菌體增殖密度對數(shù)值可達8.17（生物量為1.48×108cfu·mL?1）。據(jù)測算，糖蜜基礎(chǔ)培養(yǎng)基經(jīng)優(yōu)化后，使得酵母菌的菌量提高了1個數(shù)量級以上，生產(chǎn)每kg菌量達1.0×1010cfu·g?1的鮮酵母可降低成本84.25%，具有低成本高密度增殖特點。