四十八份青花菜品種SSR指紋圖譜構(gòu)建

林朦婕，溫慧萍，肖建中，鄭 強(qiáng)，*

(1.麗水學(xué)院 生態(tài)學(xué)院，浙江 麗水 323000；2.華南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510631)

青花菜(BrassicaoleraceaL.var.italicPlanch.)是十字花科蕓薹屬甘藍(lán)種中以花球?yàn)楫a(chǎn)品的一個(gè)變種，營養(yǎng)價(jià)值高、具較好的抗癌活性[1]，是國際流行蔬菜，也是中國大宗的重要蔬菜種類之一，在全國各地均有種植[2]。但目前中國蔬菜種子經(jīng)營主體數(shù)量眾多，青花菜種子市場秩序比較混亂，魚龍混雜，大量偽劣套牌種子的出現(xiàn)不僅造成種子質(zhì)量下降，也導(dǎo)致病害頻發(fā)，對種植農(nóng)戶與地方經(jīng)濟(jì)造成巨大的負(fù)面影響。因此，建立一套準(zhǔn)確高效的青花菜品種真實(shí)性鑒定技術(shù)體系，對打擊假冒偽劣種子與規(guī)范我國種子市場尤為重要。

農(nóng)作物的品種鑒定方法主要包括形態(tài)學(xué)鑒定法、物理化學(xué)鑒定法、生化鑒定法和DNA分子標(biāo)記法等[3]。形態(tài)學(xué)鑒定法耗時(shí)長，易受環(huán)境條件的影響，且鑒定結(jié)果具有一定的主觀性；物理化學(xué)鑒定法與生化鑒定法在應(yīng)用范圍上有較大的局限，對于近似品種往往難以區(qū)分；DNA分子標(biāo)記法通過分析DNA水平的差異來進(jìn)行品種鑒定，具有快速、高效、準(zhǔn)確、易實(shí)現(xiàn)自動化等優(yōu)點(diǎn)，越來越受到重視[4]。簡單重復(fù)序列(simple sequence repeat，SSR)標(biāo)記，因其具有多態(tài)性豐富、穩(wěn)定性與重復(fù)性好、技術(shù)簡單易于操作等特點(diǎn)，在指紋圖譜的構(gòu)建與品種真實(shí)性鑒定方面得到廣泛應(yīng)用。段艷鳳等[5]利用篩選到的6對多態(tài)性引物成功構(gòu)建了中國88個(gè)馬鈴薯審定品種的指紋圖譜，并能將其完全區(qū)分；Zhu等[6]用18對多態(tài)性豐富的SSR引物成功構(gòu)建了浙江省主栽的48個(gè)水稻品種的DNA指紋圖譜，并成功用指紋圖譜進(jìn)行品種鑒定；王慶彪等[7]利用20對EST-SSR引物構(gòu)建了中國50個(gè)甘藍(lán)代表品種的指紋圖譜并用于品種鑒定；賴運(yùn)平等[8]從952對SSR引物中篩選得到47對核心引物，構(gòu)建了184份甘藍(lán)型油菜的指紋圖譜；公丹等[9]用14對SSR引物系統(tǒng)構(gòu)建了88份豇豆品種的DNA指紋圖譜。近年來，在SSR分子標(biāo)記技術(shù)的基礎(chǔ)上，國內(nèi)已經(jīng)出臺了一系列重要蔬菜品種的分子鑒定技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)，包括蕓薹屬的白菜與甘藍(lán)等[10]，為解決品種爭議、保護(hù)育種權(quán)益、規(guī)范市場奠定了基礎(chǔ)。盡管目前有利用分子標(biāo)記對青花菜進(jìn)行遺傳多樣性分析或指紋圖譜構(gòu)建相關(guān)的研究，但大多采用的是ISSR(inter-simple sequence repeat)、RAPD(random amplified polymorphic DNA)等分子標(biāo)記對少數(shù)品種樣本進(jìn)行聚類分析或指紋圖譜構(gòu)建[11-12]，或者由于采用的引物不具備核心引物特質(zhì)[13-18]，這些研究尚不能系統(tǒng)地應(yīng)用于青花菜品種的真實(shí)性鑒定。為此，本研究以12份遺傳差異較大的品種為材料，從945對蕓薹屬的SSR引物中篩選到了20對核心SSR引物，并構(gòu)建了48份國內(nèi)市場常見的青花菜栽培品種的DNA指紋圖譜，旨在為開發(fā)青花菜品種真實(shí)性分子鑒定技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)或規(guī)程，以及為促進(jìn)國內(nèi)青花菜DNA指紋圖譜庫的系統(tǒng)構(gòu)建奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

48份青花菜材料部分來源于中國青花菜育種單位(北京蔬菜花卉研究所、浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所、臺州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院等)，部分來源于種子經(jīng)銷實(shí)體店或網(wǎng)店，涵蓋了目前中國市場上主要的青花菜品種，具體信息見表1。

表1 四十八份青花菜代表品種特性與來源

1.2 基因組DNA的提取

稱取0.2 g青花菜種子，放入-20 ℃預(yù)冷的研缽，加入液氮研磨至細(xì)粉狀，按照植物基因組DNA提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司，試劑盒型號DP350]的操作說明，提取青花菜種子基因組DNA，用微量核酸蛋白分析儀測定DNA濃度與純度，并稀釋至40 ng·μL-1備用。

1.3 SSR引物

依據(jù)參考文獻(xiàn)[13-18]報(bào)道的序列，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成共合成945對SSR引物，并挑選12份性狀差異較大的品種(炎秀、優(yōu)秀、耐寒優(yōu)秀、陽光、喜鵲、幸運(yùn)、黛蘭諾、B1199、南秀366、萬寶金、TBR-800、曼陀綠)進(jìn)行引物初篩。

1.4 PCR擴(kuò)增

1.4.1 降落式PCR

引物初篩過程采用降落式PCR程序。反應(yīng)體系為20 μL，包括ddH2O 14.4 μL、10× Buffer緩沖液2 μL、Mg2+(25 mmol·L-1)1.2 μL、dNTP Mixture(25 mmol·L-1)0.2 μL、Taq酶(5 U·μL-1)0.2 μL、DNA模板(40 ng·μL-1)1 μL、上下游引物(10 μmol·L-1)各0.5 μL。降落式PCR程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性40 s，62.5 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，每循環(huán)降1 ℃，共10個(gè)循環(huán)；94 ℃變性40 s，52.5 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共28個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。

1.4.2 三引物巢式PCR

引物復(fù)篩過程與指紋圖譜構(gòu)建則采用了三引物巢式PCR。三引物巢式PCR中的3條引物分別是常規(guī)反向引物、5’端帶有M13序列的正向引物和熒光標(biāo)記的M13引物。反應(yīng)體系25 μL，包括ddH2O 18 μL、10×Buffer緩沖液2.5 μL、Mg2+(25 mmol·L-1)1.5 μL、dNTP Mixture(25 mmol·L-1)0.25 μL；Taq酶(5 U·μL-1)0.25 μL、DNA模板(40 ng·μL-1)1 μL、上游引物(16 μmol·L-1)0.5 μL、下游引物(4 μmol·L-1)0.5 μL、FAM或HEX熒光M13引物(16 μmol·L-1)0.5 μL。三引物巢式PCR程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min，1個(gè)循環(huán)；94 ℃變性30 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，共30個(gè)循環(huán)；94 ℃變性30 s，53 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，共8個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

1.5 等位基因檢測

引物初篩采用6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測，恒定功率80 W[19]。三引物嵌套式PCR產(chǎn)物則采用基于熒光標(biāo)記的DNA分析檢測儀，測定PCR產(chǎn)物片段大小[20]。

1.6 核心引物的確定、指紋圖譜的構(gòu)建

在上述凝膠電泳檢測與熒光毛細(xì)管檢測技術(shù)的基礎(chǔ)上，根據(jù)條帶是否清晰可辨、多態(tài)性豐富程度、是否在9對染色體上均勻分布等原則，從945對引物中篩選出核心SSR引物，并在這些核心引物的基礎(chǔ)上構(gòu)建48份青花菜品種構(gòu)建指紋圖譜。指紋圖譜的構(gòu)建采用“0，1”陣列模式[21]。

1.7 數(shù)據(jù)分析

利用Power Marker V3.25軟件計(jì)算多態(tài)性等位基因數(shù)量、基因型數(shù)目、引物多態(tài)性信息含量(PIC)與雜合率。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR核心引物篩選

引物初篩采用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，按照擴(kuò)增條帶清晰易辨、等位基因數(shù)≥3、品種區(qū)分能力強(qiáng)、在染色體上分布均勻等標(biāo)準(zhǔn)，從945對SSR引物中共挑選出46對多態(tài)性豐富、帶型清晰的引物。按照5號染色體上的擴(kuò)增位點(diǎn)設(shè)計(jì)的8對引物(P C5-1～P C5-8)對12份青花菜品種(依次為B1-B8、B10-B12、B16)進(jìn)行PCR擴(kuò)增的檢測，結(jié)果見圖1。

十二份青花菜品種依次為B1～B8、B10～B12、B16。

對上述篩出的46對引物進(jìn)行三引物嵌套式PCR擴(kuò)增，其擴(kuò)增產(chǎn)物會帶上FAM或HEX熒光標(biāo)記，可通過DNA分析儀對擴(kuò)增產(chǎn)物的峰型和等位基因大小進(jìn)行分析。如圖2所示，用熒光標(biāo)記引物CB10234、Na12A02擴(kuò)增12份青花菜品種，DNA分析結(jié)果表明，所測得12個(gè)品種均出現(xiàn)5種不同類型特征峰。FAM熒光標(biāo)記引物CB10234對應(yīng)第1種類型的峰值分別為140、148，第2種類型的峰值分別為148、154，第3種類型的峰值分別為140、154，第4種類型的峰值為138，第5種類型的峰值分別為138、148。HEX熒光標(biāo)記引物Na12A02對應(yīng)第1種類型的峰值分別為184、196，第2種類型的峰值分別為178、184，第3種類型的峰值分別為178、196，第4種類型的峰值分別為174、196，第5種類型的峰值為184。

圖2 引物CB10234(A)、Na12A02(B)在12份青花菜品種中檢測到的等位基因類型

按照峰型簡單、主峰明顯、主峰與次高峰相對位置穩(wěn)定的篩選標(biāo)準(zhǔn)，最終從46對初篩引物中選擇出了20對核心SSR引物，具體信息見表2。

表2 二十對核心SSR引物多態(tài)性信息

2.2 SSR指紋圖譜的構(gòu)建

根據(jù)20對引物在青花菜品種中的擴(kuò)增情況，結(jié)合聚丙烯酰胺凝膠電泳與熒光標(biāo)記的DNA分析，構(gòu)建了48份青花菜栽培品種的DNA指紋圖譜。凝膠電泳(圖3)能夠較為直觀地顯示不同青花菜品種在某個(gè)擴(kuò)增位點(diǎn)的擴(kuò)增情況，但由于其分辨率較低，難以準(zhǔn)確判斷出擴(kuò)增條帶的大小，同時(shí)也難以區(qū)分條帶差異較小的片段，因而只作為DNA指紋圖譜的補(bǔ)充。圖4為基于20個(gè)擴(kuò)增位點(diǎn)的熒光電泳分型結(jié)果構(gòu)建得到的48份青花菜品種的DNA指紋圖譜。該圖譜以青花菜品種編號、擴(kuò)增位點(diǎn)名稱和“0，1”陣列為基礎(chǔ)制作，其中，“0”代表在相應(yīng)擴(kuò)增位點(diǎn)無擴(kuò)增條帶，“1”代為在相應(yīng)擴(kuò)增位點(diǎn)有擴(kuò)增條帶，每個(gè)青花菜品種均有包含20個(gè)位點(diǎn)信息的指紋代碼，具有唯一性，每一個(gè)指紋代碼可作為一個(gè)品種的標(biāo)識。

圖3 引物Na12A02對39份青花菜品種(依次為B1～B39)擴(kuò)增的凝膠電泳圖

圖4 四十八份青花菜品種的DNA指紋圖譜

20對核心SSR引物構(gòu)建的48份青花菜品種的指紋圖譜顯示：該套核心引物共檢測到等位基因79個(gè)，平均每條染色體上等位基因4.39個(gè)，平均每對引物擴(kuò)增得到等位基因和基因型數(shù)量分別為3.95、5.55個(gè)。除了C3上的MR049B位點(diǎn)與C8上的CB10028位點(diǎn)僅有2個(gè)等位基因外，其余位點(diǎn)等位基因數(shù)量均大于或等于3；其中，等位基因數(shù)量最多的是位于C9染色體上的CB10064，共檢測到6個(gè)，而BRMS071、BoE718、sORF74、CB10288、CB10234、CNU400這6個(gè)位點(diǎn)的等位基因數(shù)均達(dá)到了5個(gè)。PIC介于0.302～0.750，平均為0.547。綜上信息表明，該套核心引物擴(kuò)增效果好、多態(tài)性豐富，符合核心引物要求。

3 討論

DNA指紋技術(shù)在農(nóng)作物品種鑒定領(lǐng)域具有無可替代的優(yōu)勢與潛力，逐漸取代傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定法而成為品種鑒定方法的主流[22]。在眾多不同類型的分子標(biāo)記中，SSR分子標(biāo)記具有穩(wěn)定性好、多態(tài)性高、共顯性遺傳等優(yōu)勢，被國際植物品種權(quán)保護(hù)組織(International Union for the Protection of New Varieties of Plants，UPOV)分子測試指南推薦為品種鑒定與數(shù)據(jù)庫構(gòu)建的兩種優(yōu)選標(biāo)記之一。SSR標(biāo)記進(jìn)行品種鑒定一般采用一套固定的核心位點(diǎn)組合[22]，通過該套核心位點(diǎn)組合的擴(kuò)增差異進(jìn)行農(nóng)作物品種的真實(shí)性或身份鑒定。核心引物的篩選和確定是構(gòu)建指紋圖譜的重要環(huán)節(jié)，本研究借助凝膠電泳檢測平臺與熒光毛細(xì)管檢測平臺，篩選出的20對引物擴(kuò)增條帶清晰、多態(tài)性豐富、在染色體上分布較均勻，通過特異標(biāo)記及其組合可以有效鑒別市面上大多數(shù)青花菜品種的真實(shí)性。

優(yōu)良的種子是保證優(yōu)良品種遺傳特性得以穩(wěn)定發(fā)揮的基礎(chǔ)，因此明確品種的真實(shí)性是確保優(yōu)良品種的關(guān)鍵，該圖譜可作為青花菜品種鑒定和分類的依據(jù)，對青花菜品種真實(shí)性的快速、高效、準(zhǔn)確鑒定具有重要意義。在構(gòu)建指紋圖譜的方法中，采用“0，1”格式的DNA指紋圖譜[21]：以青花菜品種編號、擴(kuò)增位點(diǎn)名稱，以及“0”“1”陣列為基礎(chǔ)制得。該方式構(gòu)建的指紋圖譜不僅清晰直觀，更重要的是可以利用存儲軟件(如Excel)的搜索功能對圖譜庫中的指紋數(shù)據(jù)進(jìn)行快速搜索，能夠在短時(shí)間內(nèi)從大量的指紋數(shù)據(jù)中找到目標(biāo)數(shù)據(jù)或?qū)δ繕?biāo)數(shù)據(jù)進(jìn)行對比。

青花菜品種的真實(shí)性鑒定可采用2種方法：DNA指紋圖譜法或?qū)φ掌贩N比對法[22]。DNA指紋圖譜法是將待鑒定品種的DNA指紋信息數(shù)據(jù)與48份青花菜品種的DNA指紋圖譜進(jìn)行比對，若待鑒定品種的DNA指紋信息數(shù)據(jù)與青花菜DNA指紋圖譜庫中的某個(gè)品種信息一致，則可判斷待鑒定品種與指紋圖譜庫中的該品種為同一品種；若待鑒定品種的DNA指紋信息數(shù)據(jù)與青花菜DNA指紋圖譜庫中的48份指紋信息均不一致，則可判斷待鑒定品種不屬于48份青花菜品種中的任一品種。而對照品種比對法則是利用核心SSR引物組合分別擴(kuò)增待鑒定品種與對照品種，獲得相應(yīng)的DNA指紋信息數(shù)據(jù)，并將兩者的DNA指紋信息數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，若兩者的指紋信息數(shù)據(jù)相同，則可判定待鑒定品種與對照品種為相同品種；若兩者的指紋信息數(shù)據(jù)不同，則判定待鑒定品種與對照品種為不同品種。基于SSR分子標(biāo)記技術(shù)的真實(shí)性鑒定法在48 h內(nèi)即可完成青花菜品種鑒定工作，與傳統(tǒng)的田間種植鑒定法相比有極大的技術(shù)優(yōu)勢。此外，基于此指紋圖譜的遺傳分析，可以為青花菜品種的譜系研究、分子育種等提供參考信息。