TLC-SERS 同時檢測銀黃軟膠囊中3 種非法添加成分

宋衛(wèi)國，陸永輝，張中湖，張會敏 （.山東省中醫(yī)藥研究院，濟(jì)南 5004；.山東省食品藥品檢驗研究院，濟(jì)南500）

銀黃軟膠囊是一種清熱、解毒、消炎作用的中成藥。因中藥起效慢、副作用少，一些不良商家為了尋求暴利，在中成藥中添加西藥成分，短時間內(nèi)提高中成藥的療效，誤導(dǎo)消費者以尋求高利潤。因雙氯芬酸鈉有消炎鎮(zhèn)痛作用、芬布芬有抗炎作用、鹽酸羅通定有鎮(zhèn)痛作用，就成了不良商家非法添加的成分之列，據(jù)報道有30%的抗風(fēng)濕類健康產(chǎn)品中非法添加了雙氯芬酸鈉[1]，多種抗風(fēng)濕鎮(zhèn)痛類中藥制劑中非法添加雙氯芬酸鈉、芬布芬等此類化學(xué)藥物[2]。因此，建立一種快速有效的檢測方法，對可能非法添加了西藥成分的中成藥進(jìn)行現(xiàn)場檢測具有重要的意義。

近幾年，薄層色譜-表面增強(qiáng)拉曼光譜（TLCSERS）聯(lián)用技術(shù)廣泛地應(yīng)用于各種領(lǐng)域[3-4]，尤其是在藥物非法添加研究領(lǐng)域被逐漸認(rèn)可[5-8]。本研究應(yīng)用TLC-SERS 聯(lián)用技術(shù)，探索雙氯芬酸鈉、芬布芬、鹽酸羅通定在中成藥銀黃軟膠囊中非法添加的鑒別方法，以期為進(jìn)一步的中成藥快速檢驗提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

便攜式拉曼光譜儀（BWS415，B&W Tek Inc.,U.S.A），激光發(fā)射波長785 nm，分辨率5 cm-1；WFH-203B型三用紫外分析儀（上海精科實業(yè)有限公司）；離心機(jī)（TG16-WS，上海盧湘儀離心機(jī)有限公司）；KQ-250DB 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司）；薄層板HSGF254（煙臺市化學(xué)工業(yè)研究所）。

雙氯芬酸鈉（批號：100334-200302，供含量測定用）、芬布芬（批號：100415-201102，純度99.4%）、鹽酸羅通定（批號：100222-200702，供鑒別用）均購自中國食品藥品檢定研究院。實驗所用陰性樣品由山東省食品藥品檢驗所提供，銀黃軟膠囊（批號：359161004，石藥集團(tuán)歐意藥業(yè)有限公司）。乙酸乙酯（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號：20150410）、石油醚（天津市富宇精細(xì)化工有限公司，批號：12589-2007）；硝酸銀（批號：20140320，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），檸檬酸鈉（分析純，批號：20120429，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；實驗用水為蒸餾水。

1.2 實驗方法

1.2.1 溶液的制備

對照品溶液：精密稱取對照品雙氯芬酸鈉、芬布芬、鹽酸羅通定對照品2 mg，置EP 管中，加入甲醇2 ml 溶解，制成濃度為1 mg/ml 的溶液，作為對照品溶液，冷藏保存，備用。

模擬假陽性樣品溶液：取中成藥銀黃軟膠囊（經(jīng)山東省食品藥品檢驗院薄層色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法檢測，不含以上3 種對照品，可作為陰性樣品）一次劑量，置EP 管中，并精密量取雙氯芬酸鈉、芬布芬、鹽酸羅通定對照品溶液加入EP 管中，與銀黃軟膠囊樣品溶液混勻，甲醇溶解，振蕩，超聲（40 kHz，250 W）30 min，10 000 r/min 離心10 min，收集上清液，微孔濾膜濾過，作為假陽性樣品，冷藏保存，備用。

陰性樣品溶液：取中成藥銀黃軟膠囊一次劑量，置EP 管中，加入甲醇2 ml 溶解，振蕩，超聲（40 kHz，250 W）30 min，10 000 r/min 離心10 min，取上清液，微孔濾膜濾過，作為陰性樣品，冷藏保存，備用。

1.2.2 納米銀膠溶液的制備

精密稱取45 mg 的硝酸銀，加入少量去離子水使其溶解。溶解后移至250 ml 的容量瓶中，用去離子水定容。用電磁攪拌加熱器不斷攪拌并將其加熱至微沸，逐滴加入5 ml 濃度為1 %檸檬酸鈉溶液并繼續(xù)加熱，保持微沸60 min，繼續(xù)攪拌至溶液冷卻，得灰綠色銀溶膠，避光保存[8]。

1.2.3 最佳光譜條件的優(yōu)選

分別取1 mg/ml 雙氯芬酸鈉、芬布芬、鹽酸羅通定對照品溶液，以點樣點膠比為變量，激光功率，積分時間為定值，檢測出峰效果，篩選3 種成分的最佳點樣點膠比；同理篩選3 種成分的最佳激光功率、積分時間。

1.2.4 檢測限的考察

以對照品溶液與陰性樣品溶液作為對照，將配制的添加不同濃度對照品的模擬陽性樣品點在同一塊硅膠薄層板上，按優(yōu)選的最佳光譜條件設(shè)置點樣點膠比、激光功率、積分時間，根據(jù)信噪比（S/N=3）評價出峰效果，確定各個對照品的檢測限。

1.2.5 表面增強(qiáng)拉曼光譜檢測

將配置好的各種樣品、對照品溶液置于薄曼聯(lián)用儀內(nèi)對應(yīng)位置，高效硅膠薄層板置于儀器平臺上，設(shè)置點樣量與點樣位置，由聯(lián)用儀完成點樣操作。取出點樣后的薄層板，以選定的石油醚-乙酸乙酯（3：5）展開系統(tǒng)，室溫下展開80 mm，取出晾干，放回聯(lián)用儀，于內(nèi)置254 nm 紫外燈下檢視定位以確定點膠位置，設(shè)置合適的點膠量、激光強(qiáng)度與積分時間，由聯(lián)用儀完成點膠操作后，隨即進(jìn)行拉曼檢測。

2 結(jié)果

2.1 最佳出峰條件的篩選結(jié)果

對照品雙氯芬酸鈉、芬布芬、鹽酸羅通定最佳出峰條件分別是：雙氯芬酸鈉點樣點膠比2：3，激光功率30%，積分時間30 s；芬布芬點樣點膠比2：2，激光功率40%，積分時間30 s；鹽酸羅通定點樣點膠比1：2，激光功率50%，積分時間30 s。拉曼圖譜如圖1 所示。

2.2 檢測限的考察結(jié)果

從圖2、圖3、圖4 中可以看出，3 種對照品在薄層色譜中分離程度高，雙氯芬酸鈉的比移植（Rf）值為0.75，芬布芬Rf 值為0.54，鹽酸羅通定Rf 值為0.21。由“2.1”項可知，雙氯芬酸鈉、芬布芬、鹽酸羅通定最佳點樣點膠比分別為2：3、2：2、1：2（即點樣量分別為2 μl、2 μl、1 μl，故銀黃軟膠囊中添加的雙氯芬酸鈉、芬布芬、鹽酸羅通定最低檢測限對應(yīng)的點樣沉積量分別為0.2 μg、0.2 μg、0.1 μg。

2.3 模擬的假陽性樣品考察結(jié)果

圖1 3 種成分最佳出峰條件下的SERS 圖譜

圖2 雙氯芬酸鈉薄層及各斑點拉曼光譜

圖3 芬布芬薄層及各斑點拉曼光譜

從圖5 薄層板中可以看出，同時添加了3 種對照品的銀黃軟膠囊模擬的假陽性樣品溶液4、5、6、7 號中出現(xiàn)了與雙氯芬酸鈉、芬布芬、鹽酸羅通定相同Rf 值的斑點，可初步確定4、5、6、7 中添加了雙氯芬酸鈉、芬布芬、鹽酸羅通定。為進(jìn)一步確證，對各斑點進(jìn)行SERS 檢測，在拉曼儀數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)中與相應(yīng)對照品色譜斑點的SERS 光譜進(jìn)行比對，結(jié)果表明4、5、6、7 號中對應(yīng)斑點的SERS圖譜與雙氯芬酸鈉、芬布芬、鹽酸羅通定對照品的SERS 圖譜相同，見圖5 中SERS 圖譜。

圖4 鹽酸羅通定薄層及各斑點拉曼光譜

2.4 3 種成分的拉曼光譜分析

由圖6 可知，雙氯芬酸鈉、芬布芬、鹽酸羅通定3 種成分的分子結(jié)構(gòu)中均含有苯環(huán)、C—C、C=O 基團(tuán)，故3 種成分的拉曼光譜特征峰有9 個共有峰，在576、712、1 004、1 130、1 240、1 316、1 394、1 454、1 564 cm-1左右，同一共有峰的強(qiáng)度有所不同，取代基不同拉曼位移略有變化（見表1）。此外，由于3 種成分的分子結(jié)構(gòu)含有不同的基團(tuán)，也有相應(yīng)的差異峰，如740 cm-1為鹽酸羅通定特有峰。共有峰、差異峰以及峰強(qiáng)度共同組成了區(qū)別于其他成分的特征峰群，這為TLC-SERS 專屬性鑒別提供了依據(jù)。

圖5 模擬假陽性樣品薄層及拉曼光譜

圖6 3 種成分的分子結(jié)構(gòu)

表1 3 種成分的拉曼光譜特征峰(cm-1)

3 討論

本研究通過反復(fù)試驗，確定了TLC 展開劑為石油醚-乙酸乙酯（3：5），得到了較好的展開效果。在展開的TLC 薄層板上，3 種對照品對應(yīng)的斑點處，模擬假陽性樣品與3 種對照品有相同斑點；經(jīng)過進(jìn)一步的SERS 檢測，模擬假陽性樣品的斑點拉曼光譜特征峰與對照品斑點拉曼光譜特征峰一致，且重復(fù)性良好，說明TLC-SERS 聯(lián)用技術(shù)簡便、準(zhǔn)確、可靠，可同時檢測銀黃軟膠囊中非法添加的雙氯芬酸鈉、芬布芬、鹽酸羅通定3 種成分。

本研究采用TLC-SERS 聯(lián)用技術(shù)所建立的檢測方法，對中成藥銀黃軟膠囊中非法添加西藥雙氯芬酸鈉、芬布芬、鹽酸羅通定3 種成分的，能滿足同時、快速檢測的要求。該方法實用性強(qiáng)，對人員技術(shù)要求低，尤其適合現(xiàn)場快速檢測。