復方首烏藤合劑的總多糖含量測定及單糖組分分析

葉財發(fā)，蔡躍輝，曾棋平，曹毅祥，陳錦珊 （中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九〇九醫(yī)院制劑科/廈門大學附屬東南醫(yī)院制劑科，福建 漳州 363000）

復方首烏藤合劑是我院研制的特色制劑，主要由首烏藤、合歡皮、菟絲子、五味子、續(xù)斷、蔓荊子、川芎、煅牡蠣八味藥材配制而成，方中首烏藤為君藥，合歡皮為臣藥，菟絲子、五味子、續(xù)斷為佐藥，川芎、蔓荊子、煅牡蠣為使藥，諸藥合用，具有養(yǎng)心安神解郁、滋陰養(yǎng)肝、行血活氣之功效，臨床應用于神經(jīng)衰弱性失眠、眩暈及腦外傷引起的頭痛、頭暈等癥[1]。目前，該制劑的質量標準中主要控制其總黃酮、二苯乙烯苷含量[2]，未包含多糖含量控制，相關研究表明，多糖具有預防、改善、治療失眠的作用，且滋陰養(yǎng)肝效果明顯[3-6]。因此，探究復方首烏藤合劑總多糖含量及多糖組成很有必要，本文在前期研究的基礎上 對該制劑粗多糖的組成及總多糖含量進行了分析，現(xiàn)報道如下。

1 材料與儀器

1.1 材料

復方首烏藤合劑為本院自制（規(guī)格：40 ml，批號：201906132，201906133，201906211，20190624）；D-甘 露 糖 (批 號：140651-201504，質 量 分 數(shù)99.4%)、D-鹽酸氨基葡萄糖(批號：140649-201606，質量分數(shù)100%)、半乳糖(批號：160226-201506，質量分數(shù)100%)、D-葡萄糖(批號：110833-201707，質量分數(shù)99.9%)、D-半乳糖醛酸(批號：111646-201702，質量分數(shù)95.1%)，L-阿拉伯糖(批號：111506-200202，質量分數(shù)100%)、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）、三氟乙酸（TFA）均購自中國食品藥品檢定研究院；氫氧化鈉、鹽酸、甲醇、三氯甲烷、正丁醇、濃硫酸、苯酚、無水乙醇均為分析純;水為本院自制純化水。

1.2 儀器

紫外可見分光光度計（UNIC UV-2102 PCS，日本島津）；Agilent 1200 高效液相色譜系統(tǒng)(DAD 檢測器，美國Agilent 公司)；電子分析天平(AUX220，日本島津)；磁力加熱攪拌器(KQY78-1，金壇市科析儀器有限公司)；數(shù)顯恒溫水浴鍋(HH 系列，金壇市科析儀器有限公司)；電動離心機(LD5-2A，北京醫(yī)用離心機廠)；電熱鼓風干燥箱(101A-1E，上海實驗儀器有限公司)；超聲清洗器(KQ-500B，昆山市超聲儀器有限公司)；真空干燥箱(DZF-6050，上海醫(yī)用恒溫設備廠)。

2 方法

2.1 提取多糖組分

精密吸取25 ml 復方首烏藤合劑，加入氯仿-正丁醇混合液(氯仿：正丁醇=5：1）20 ml，在磁力攪拌器上攪拌30 min，離心20 min(50 Hz，4000 r/min)，回收上清液，去除蛋白質及有機溶劑；乙醇沉淀：向上清液中加入3 倍體積的95%的乙醇，保持乙醇濃度在70%以上，靜置過夜。離心15 min，收集沉淀物，80 ℃真空干燥3 h，得到相應批號的復方首烏藤合劑多糖粉末。

2.2 總多糖含量的測定[7-8]

2.2.1 對照品溶液配制

精密稱取105 ℃干燥至恒重的D-無水葡萄糖0.1 g，置于100 ml 容量瓶中，加水定容至刻度，備用。

2.2.2 供試品溶液配制

精密稱取復方首烏藤合劑多糖粉末0.1 g，置于250 ml 容量瓶中，加水定容至刻度，得供試品原液；再精密吸取3 ml 供試品原液至10 ml 容量瓶中，加水定容，即為供試品溶液。

2.2.3 最大吸收波長測定

精密吸取對照品儲備液6.0 ml，置于100 ml 量瓶中，加水定容至刻度，即得對照品溶液。精密吸取對照品溶液1.0 ml，置于10 ml 量瓶中，加入4%的苯酚溶液1.0 ml，振蕩搖勻，然后加入7 ml 濃硫酸，立即搖勻，100 ℃水浴15 min，然后冰浴15 min，冷卻至室溫。以相應試劑為空白，在400～550 nm 范圍內掃描光譜。結果發(fā)現(xiàn)，對照品溶液在486nm 處有最大吸收，故選擇486 nm。

2.3 方法學考察

2.3.1 標準曲線的制備及線性關系考察

精密吸取葡萄糖對照品儲備液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 ml，分別置10 ml 量瓶中，用水定容至刻度。然后各精密吸取1.0 ml，分別置于10 ml 量瓶中，加入4%的苯酚溶液1.0 ml，振蕩搖勻，然后加入7 ml 濃硫酸，立即搖勻，100 ℃水浴15 min，然后冰浴15 min，冷卻至室溫，在486 nm 波長處測定吸光度(Y)。以Y 為縱坐標，濃度(X)為橫坐標，繪制標準曲線，得到標準曲線方程：Y= 0.007X +0.0105，r = 0.9982。

2.3.2 精密度試驗

精密量取“2.2.1”項下的對照品溶液1.0 ml，按“2.3.1”項下方法測定吸光度，連續(xù)測定6 次，根據(jù)標準曲線方程計算多糖含量，求RSD。結果得到RSD 為0.24% (n=6)，表明儀器精密度良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗

精密量取供試品溶液（批號：20190624）1.0 ml，置10 ml 量瓶中，按“2.3.1”項下方法測定吸光度。在顯色后0、10、20、40、60、80、100、120 min 分別測定吸光度，求RSD。結果得到RSD 為3.54% (n=7)，表明該制劑多糖提取液在顯色后120 min 內穩(wěn)定性良好。

2.3.4 重復性試驗

取復方首烏藤合劑（批號：20190624）6 份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.3.1”項下方法測定吸光度，計算多糖含量。結果測得6 份供試品溶液中多糖的平均含量為18.23 mg/ml，RSD為0.33%(n=6)，表明該方法重復性良好。

2.3.5 加樣回收率試驗

精密量取已知濃度為61 μg/ml 的供試品溶液（批號：20190624）6 份，每份0.5 ml，各加入0.5 ml濃度為63 μg/ml 的葡萄糖對照品溶液，按“2.3.1”項下方法操作，于486 nm 波長處測定吸光度，計算加樣回收率。結果顯示該方法的平均加樣回收率為100.45%,RSD 為1.57% （見表1）。

表 1 復方首烏藤合劑加樣回收率試驗結果（n=6)

2.4 總多糖含量測定

按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.3.1”項下方法測定吸光度，計算多糖含量。用外標法計算總多糖含量(以葡萄糖計)，結果見表2。

表 2 復方首烏藤合劑含量測定結果（n=3）

2.5 單糖分析

2.5.1 對照品溶液的制備

稱取各單糖對照品： D-甘露糖、D-鹽酸氨基葡萄糖、D-半乳糖醛酸、D-無水葡萄糖、半乳糖、L-阿拉伯糖等各約10 mg，精密稱定，分別置于5 ml量瓶中，加水至刻度，搖勻，即得。

2.5.2 供試品溶液的制備

取多糖粉末（批號：20190624）150 mg，精密稱定，置于10 ml 具塞試管中，加水 3 ml，再加TFA3 ml，封管于110 ℃烘箱中水解1 h，取出，放冷，水浴蒸干，用甲醇1 ml 溶解，蒸干，重復處理 3 次以除去殘留的 TFA，殘渣加水溶解[9]，轉移至 5 ml 量瓶中，放冷，加水至刻度，搖勻，即得。

2.5.3 柱前衍生方法

取上述 6 種單糖對照品溶液各50 μl 置于同一10 ml EP 管中，供試品溶液1.0 ml 置于10 ml EP 管中，分別加入 1.0 ml 0.5 mol/L 的PMP/甲醇溶液和1.0 ml 0.3 mol/L 的氫氧化鈉溶液，混合均勻，70 ℃水浴50 min，取出后冷卻至室溫，分別加入1.0 ml 0.3 mol/L 的鹽酸溶液中和，再加入2 ml 氯仿萃取，取上清液，重復處理 3 次，除去未反應的PMP，0.22 μm 濾膜濾過[9]，即得。

2.5.4 色譜條件

色譜柱：Agilent Exted-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；柱溫：30 ℃；流動相：乙腈(A) - 0.1 mol/L 的磷酸鹽緩沖液(pH =6.8)(B)等度洗脫(A：B=16：84)；流速：1.0 ml/min；檢測波長250 nm；進樣量：20 μl。

2.5.5 結果

精密吸取適量“2.5.2”項下供試品溶液及“2.5.1”項下對照品溶液，按照“2.5.3”項下衍生方法進行衍生，按照“2.5.4”項下色譜條件進樣，分別得到供試品溶液色譜圖(圖1），從復方首烏藤合劑多糖中識別出甘露糖、鹽酸氨基葡萄糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖等6 種單糖。

根據(jù)5 次各單糖的峰面積比測定結果進行計算，甘露糖：鹽酸氨基葡萄糖：半乳糖醛酸：葡萄糖：半乳糖：阿拉伯糖=9.10：0.26：1.00：3.02：4.14：2.12，可見甘露糖的峰面積占比接近50%，提示甘露糖可能是復方首烏藤合劑發(fā)揮特殊藥效的原因之一。

圖 1 復方首烏藤合劑多糖色譜圖

3 討論

3.1 苯酚-硫酸法的樣品處理

采用苯酚-硫酸法預實驗時，發(fā)現(xiàn)供試品和對照品溶液如無水浴和冰浴處理，可能造成供試品過熱且結果不穩(wěn)定；若冰浴后無冷卻至室溫操作，吸光度結果偏小，故本實驗選擇先水浴，再冰浴，冷卻至室溫來避免以上情況出現(xiàn)。

3.2 單糖組分洗脫方法的選擇

在考察流動相時，發(fā)現(xiàn)乙腈比例大于25%時，各個色譜峰之間的分離度達不到要求；另外，如采用梯度洗脫方法，色譜峰6（半乳糖）與7（阿拉伯糖）之間分離度達不到要求，故選擇等度洗脫。綜合考慮，選擇0.1 mol/L 的磷酸鹽緩沖液(pH=6.8)等度洗脫作為本實驗流動相。

3.3 制劑中總多糖含量及單糖組分的探討

復方首烏藤合劑是由首烏藤、合歡皮、菟絲子、五味子、續(xù)斷、蔓荊子、川芎、煅牡蠣八味藥材配制而成的中藥復方制劑，甘露糖的峰面積占比接近50%。根據(jù)相關研究發(fā)現(xiàn)，首烏藤中單糖成分以阿拉伯糖及半乳糖為主[10]；合歡皮多糖較高，但未對單糖組分進行分析[11]；菟絲子多糖的主要組成是甘露糖，且含量最高[12]；五味子以葡萄糖為主，甘露糖含量低[13]；蔓荊子多糖含量較低[14]；川芎多糖以葡萄糖及半乳糖為主[15]。綜上可知，甘露糖可能主要來源于菟絲子，葡萄糖可能主要來源于五味子、川芎，阿拉伯糖可能主要來源于首烏藤。

4 結論

綜上所述，采用苯酚硫酸法結合紫外分光光度法可以較為準確測定復方首烏藤合劑總多糖含量，柱前衍生化法結合高效液相色譜適用于分析該制劑多糖水解產(chǎn)物中的單糖組分，上述方法可為復方首烏藤合劑多糖質量控制提供參考。