J亞群禽白血病病毒致病機理研究進展

張帆帆，涂凌云，李海琴，曾艷兵，康昭風，譚美芳，譚 佳，方紹培，楊 群*

(1.江西省農(nóng)業(yè)科學院 畜牧獸醫(yī)研究所，江西 南昌 330200；2.南昌市動物疫病預防控制中心，江西 南昌 330008)

禽白血病(avian leukosis，AL)是由禽白血病病毒(avian leukosis virus，ALV)引起的一種呈世界性分布的禽類傳染病，能夠垂直和水平方向傳播，在生產(chǎn)養(yǎng)殖中可導致雞產(chǎn)生腫瘤、免疫抑制、生產(chǎn)性能下降甚至死亡等，被列為國家中長期動物疫病規(guī)劃(2012-2020)的3大禽病之一[1-4]。根據(jù)病毒囊膜蛋白的特性，目前雞的ALV共分為7個亞群(A、B、C、D、E、J和K)，其中ALV-J是當前最為流行、致病性最強的ALV。自1999年在我國發(fā)現(xiàn)以來，我國肉雞、蛋雞及地方品種雞群中普遍存在ALV-J的感染，對我國家禽種質資源的安全構成極大威脅，也給行業(yè)養(yǎng)殖造成巨大經(jīng)濟損失[1,5-6]。迄今為止，ALV-J無有效的疫苗和藥物，控制ALV-J的主要方法是淘汰陽性雞、凈化雞群。本文對ALV的基因組特征、病毒復制、致瘤機制、免疫抑制機制及宿主天然抗病毒過程的分子機制等研究進展進行綜述。

1 ALV-J基因組特征

ALV-J屬于反轉錄病毒科正反轉錄病毒亞科α反轉錄病毒屬成員，為有囊膜單股正鏈線性的RNA二聚體病毒。病毒基因組不能作為mRNA翻譯蛋白質，需反轉錄成前病毒整合到宿主細胞基因組，利用宿主細胞的細胞器及酶系統(tǒng)完成病毒的轉錄、翻譯和組裝[7]。病毒基因組全長約7.2～7.9 kb，兩端包含2個非編碼區(qū)(untranslated region，UTR)，中間包含3個結構蛋白基因gag、pol、env，基因組結構為5′-UTR-gag-pol-env-UTR-3′。病毒基因組由RNA反轉錄到DNA前病毒過程中在基因組兩端分別添加U3和U5，構成長末端重復序列(long terminal repeats，LTR)，形成5′-LTR-gag-pol-env-LTR-3′基因組結構(圖1)[8]。以馬立克氏病病毒(marek’s disease virus，MDV)作為CRISPR/Cas9遞送系統(tǒng)靶向ALV-J基因組的5′LTR，可有效地破壞潛伏整合的病毒基因組，并為細胞提供防御新ALV-J感染的能力[9]。gag基因編碼病毒的多聚前體蛋白Pr76，在病毒天冬氨酸蛋白酶P15的切割下形成6種非糖基化結構蛋白，包括基質蛋白P19、P2、P10、衣殼蛋白P27、核衣殼蛋白P12、蛋白酶P15[10-11]，其中衣殼蛋白P27的氨基酸序列高度保守，為群特異性抗原[12-13]；pol基因編碼病毒的反轉錄酶p68和整合酶p32；env基因編碼病毒的囊膜糖蛋白SU表面蛋白(gp37)和TM跨膜蛋白(gp85)，主要決定病毒的宿主范圍，并與病毒的致瘤性相關[14-16]。

圖1 ALV-J前病毒基因組結構示意圖

2 病毒的復制

ALV-J的復制過程主要包括吸附、穿入、脫殼、生物合成、組裝成熟和釋放。病毒粒子以囊膜表面蛋白與雞Na+/H+交換Ⅰ型跨膜細胞表面蛋白(chicken Na+/H+exchanger typeⅠ，chNHE1)/雞ANXA2(chicken annexin A2，chANXA2)受體結合介導ALV-J與宿主細胞的吸附(圖2)，在吸附過程中病毒囊膜蛋白構象發(fā)生改變，在輔助受體或內體的幫助下病毒核心粒子進入細胞內，完成脫衣殼[17-18]。研究表明，ALV-J gp85的兩段序列基序(38～131 aa和159～283 aa)是與chNHE1結合所必需的，其2個N-糖基化位點(N6和N11)和2個半胱氨酸(C3和C9)在病毒與受體結合和進入細胞過程起著至關重要的作用[15]。研究人員利用CRISPR/Cas9對雞胚胎原始生殖細胞進行編輯，成功制備了缺失chNHE1基因的基因編輯雞，研究結果表明，同野生型雞相比，chNHE1缺失的雞沒有表現(xiàn)出任何明顯的副作用，并對ALV-J具有較強的抵抗能力[19-20]。脫殼完成后，病毒RNA在自身逆轉錄酶作用下反轉錄為cDNA，與整合酶等多種病毒蛋白及宿主蛋白共同形成整合前復合體(pre-initiation-complex，PIC)，PIC入核后在整合酶的作用下整合進入宿主基因組形成前病毒，經(jīng)宿主細胞RNA聚合酶作用轉錄形成新的RNA，合成各種病毒結構蛋白，組裝后出芽釋放成熟的子代病毒粒子[21]。

3 病毒的致病機理

3.1 ALV-J致瘤機制ALV主要通過癌基因轉導和插入突變兩種機制啟動癌基因的表達而使易感細胞和組織發(fā)生轉化致瘤。其中以啟動病毒癌基因為基礎的機制稱為癌基因轉導機制，病毒感染機體細胞后導入癌基因，幾天或幾周內誘導細胞轉化形成腫瘤，又稱為急性轉化型[22]；以啟動細胞癌基因為基礎的機制稱為插入突變機制，病毒不攜帶癌基因，病毒感染機體細胞后將前病毒插入至宿主細胞原癌基因或其周圍，間接激活染色體基因組中的原癌基因，與癌基因轉導機制相比，這一機制的致瘤潛伏期較長[23]。ALV-J病毒主要通過LTR插入突變機制，當前病毒插入在原癌基因上游，LTR中啟動子誘導原癌基因的非正常表達，稱為啟動子激活；當前病毒插入在原癌基因附近，使增強子激活而誘導原癌基因過表達，稱為增強子激活[24]；前病毒插入在原癌基因中，LTR中的啟動子啟動病毒轉錄，進而啟動原癌基因轉錄稱為轉錄不終止激活。

不同于其他亞群的ALV，ALV-J主要誘發(fā)機體淋巴細胞瘤白血病，其還可誘發(fā)雞只骨髓細胞樣腫瘤、血管瘤、肝細胞癌和其他惡性腫瘤[24-26]。研究者利用ALV-J HB2009毒株感染雞只并觀察至20周齡，發(fā)現(xiàn)骨髓瘤病例最早見于13周齡，并且還出現(xiàn)血管瘤的特征，在腦組織中檢測到瘤細胞，推測瘤細胞可能通過血腦屏障或骨膜浸潤到腦組織[27]。通過對比ALV-J HPRS-103毒株和A亞群RAV-1毒株發(fā)現(xiàn)，ALV-J誘導的髓系白血病與病毒對粒單核細胞的嗜性相關，其感染后誘導粒細胞的原癌基因c-myc激活而轉化成瘤細胞；感染RAV-1毒株的雞只法氏囊內病毒基因表達水平較高，而感染HPRS-103毒株的雞只則沒有表達，這可能是HPRS-103毒株不能誘導淋巴白血病的原因[28]。另外，各種致癌因子的協(xié)同作用失衡也可引起機體形成腫瘤，感染ALV-J NX0101毒株的肉雞延髓、肝臟和肺組織p53相關腫瘤基因的mRNA表達水平顯著升高，促進腫瘤的形成[29-30]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，小分子RNA在腫瘤的形成過程中同樣具有重要的作用。gga-miR-221和gga-miR-222等相關基因能夠促進腫瘤細胞的增殖、周期進程及遷移能力，同時也會抑制細胞凋亡[31]。microRNAs(miRNAs)的異常表達與ALV-J引起的肝癌進展有關。為了探索對相關病理機制及病毒和宿主的相互作用，研究人員選擇了7個先前報道的miRNAs，通過比較分析感染和未感染DF-1 的細胞miRNA表達，發(fā)現(xiàn)6種與腫瘤發(fā)生有關的miRNAs(let-7b/7i、miR-221/222、miR-125b和miR-2127)均出現(xiàn)上調，表明這些miRNA可能在腫瘤發(fā)生和發(fā)展過程中起重要作用[32]。環(huán)狀RNA(circRNA)是一種新型的非編碼RNA，具有高度保守和穩(wěn)定的共價閉環(huán)結構，在多種生物過程和疾病發(fā)生中起著重要作用。試驗分析發(fā)現(xiàn)，感染組和對照組之間circRNA_3079的含量差異顯著，而且circRNA_3079及其預測的靶基因在許多與免疫或腫瘤相關的信號通路中富集，如p53信號通路、JAK-STAT信號通路、NOD樣受體信號通路等，說明circRNA_3079可能通過調控靶基因間接調控ALV-J誘導的腫瘤形成[33]。

3.2 ALV-J免疫抑制機制ALV-J誘導的免疫抑制能夠影響雞的生長和疫苗免疫應答水平，并造成其他病原的繼發(fā)感染。目前已知ALV-J引起的免疫抑制主要包括：引起骨髓組織發(fā)生病變進而導致T、B淋巴細胞減少；引起胸腺、法氏囊等淋巴細胞凋亡或壞死，使得T、B淋巴細胞的分化成熟受阻；引起外周免疫器官(如脾臟)發(fā)生病變，致使成熟淋巴細胞減少，使機體體液和細胞免疫及非特異性免疫水平下降。在感染過程中，ALV-J使淋巴濾泡中淋巴細胞發(fā)生轉化，轉化的B細胞喪失了產(chǎn)生IgG的能力，僅能產(chǎn)生IgM，而抗原特異性體液反應的產(chǎn)生需要B細胞和T細胞相互協(xié)調。研究者用ALV-J先天感染模型，從形態(tài)和功能兩個方面研究ALV-J先天感染B細胞及其前體細胞的發(fā)育、分化和免疫功能，發(fā)現(xiàn)與早期感染雞只相比，先天性ALV-J感染導致了嚴重的免疫耐受，免疫器官特別是法氏囊發(fā)育不良，雞的IgM和IgG陽性細胞和總免疫球蛋白水平顯著降低，通過流式細胞分析證實，ALV-J阻斷了法氏囊CD117chB6 B細胞前體細胞的分化，B細胞及其祖細胞的體液免疫和免疫能力都受到了顯著地抑制[34]。朱麗君等[35]將ALV-J接種1日齡和7日齡SPF雛雞，研究不同感染時間對機體的免疫器官、CD4+和CD8+T淋巴細胞等的影響，發(fā)現(xiàn)1日齡感染組中樞器官等免疫器官抑制程度顯著高于7日齡感染組，CD4+細胞數(shù)量明顯下降，而CD8+細胞數(shù)量明顯升高；而通過不同途徑接種SPF雛雞，除生長性能和免疫器官指數(shù)下降外，淋巴細胞轉化率和細胞因子的分泌量(IL-2、IL-4、IFN-γ)顯著降低，腹腔和肌肉注射組降低的最明顯。

ALV-J的TM區(qū)是引起機體誘發(fā)免疫抑制的主要因素。ALV-J的TM中存在一段高度保守的免疫抑制序列，亦稱為免疫抑制區(qū)(ISU)。該區(qū)域合成的多肽可在體內外抑制淋巴細胞的活性，通過比較不同毒株發(fā)現(xiàn)，保守序列編碼的多肽的抑制活性與毒株種類無關。通過對ISU進行氨基酸三級結構分析，發(fā)現(xiàn)該區(qū)域可形成一個獨特的α螺旋，可與胞外片段內的抗體反應區(qū)(ARD)產(chǎn)生強烈的相互作用，而ISU和ARD之間相互協(xié)調的平衡關系可能就是免疫抑制發(fā)生的關鍵[36-38]。臨床上ALV-J常和其他病原混合感染引發(fā)機體更為明顯的免疫抑制。在ALV與禽網(wǎng)狀內皮組織增殖病毒(REV)共感染的蛋雞病例中發(fā)現(xiàn)一種少見的細胞類型，介于原淋巴細胞和巨噬細胞之間(稱為淋巴-巨噬細胞)，這可能是ALV-J與REV相互促進、協(xié)同作用的結果。通過對ALV-J和REV感染CEF細胞的轉錄組進行分析，發(fā)現(xiàn)TRIM62調控微絲細胞骨架在共感染機制中起重要作用[39]。目前，對ALV-J引起的免疫抑制的防治雖取得了一定的進步，但是仍無有效藥物或疫苗，其根本原因在于病毒靶向機體免疫系統(tǒng)并導致其損傷或無能。為此，需要在明確ALV-J誘導免疫抑制機制的同時，尋找減輕或消除機體免疫抑制的方法，是有效防治其危害的根本途徑。

4 抗ALV-J天然免疫及其病毒靶點

病毒感染后，宿主細胞通過宿主不同類型的模式識別受體(pattern recognition receptor,PRR)感知具有病原體相關分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMP)的病毒以及病毒產(chǎn)物的存在，觸發(fā)不同的信號傳導途徑，誘導機體產(chǎn)生IFN或免疫相關因子抵抗病毒感染，激活相關免疫途徑，抑制病毒復制(圖2)。病毒與機體之間的進化導致了細胞先天性免疫蛋白和抗病毒因子的出現(xiàn)。通過研究發(fā)現(xiàn)，許多被確定為抑制特定逆轉錄病毒的限制因子對其他逆轉錄病毒也具有廣泛的抗病毒活性，并且在多種病毒與宿主的相互作用下適應性進化，構成了抵御病毒攻擊的先天免疫系統(tǒng)[21]。一方面，限制因子通過干擾病毒復制所需的細胞過程實現(xiàn)抗病毒。不育-α-基序結構域(SAM域)和組氨酸/天冬氨酸殘基雙聯(lián)體結構域(HD域)包涵蛋白1(sterile alpha motif and histidine-aspartic acid domain-containing protein 1，SAMHD1)通過其水解酶功能調節(jié)細胞內脫氧核苷三磷酸(dNTPs)水平，抑制髓系和樹突狀細胞中病毒的復制，并限制CD4+T細胞對病毒的抑制作用[40]。當骨髓細胞或樹突狀細胞缺失SAMHD1時，病毒逆轉錄產(chǎn)物增加，并觀察到的SAMHD1在殘基T592處的磷酸化狀態(tài)與細胞周期調控有關。BST2是一種Ⅱ型單程跨膜蛋白，具有獨特的拓撲結構，充當細胞膜和出芽病毒粒子之間的橋梁，將出芽病毒粒子限制在細胞膜上，阻礙其感染其他正常細胞。另一方面，限制因子通過與病毒核酸相互作用限制病毒復制，APOBEC3酶催化病毒單鏈DNA的脫氨反應，產(chǎn)生對病毒致死的G→A高突變現(xiàn)象，產(chǎn)生缺陷病毒蛋白和非傳染性病毒顆粒阻斷反轉錄[41-42]。CCCH型鋅指抗病毒蛋白(CCCH-zinc finger antiviral protein，CCCH-ZAP)作為宿主天然防御因子，可以通過識別并結合病毒蛋白發(fā)揮抗病毒作用，還可通過競爭結合的方式使ALV-J囊膜蛋白中ISU從類Norbin蛋白(NLP)上脫離，解除病毒造成的免疫抑制，恢復T細胞對外來病原體的免疫反應能力[43]。通過研究不同宿主限制因子與病毒生命周期階段的相互作用，有助于了解ALV-J傳播復制的機制，并利用這些限制因子的抗病毒作用開發(fā)新的治療方法。

圖2 限制因子阻斷逆轉錄病毒生命周期的特定階段[21]

5 展望

除了ALV-J外，其他亞群的ALV如A、B、C、D、E和K亞群等均可通過水平傳播和垂直傳播感染雞只，進而導致雞只發(fā)生腫瘤和免疫抑制。而ALV與其他反錄病毒的部分基因同源，產(chǎn)生腫瘤或免疫抑制的分子機制也部分相似，因此，可為解析宿主抗病毒的天然免疫機制互相提供參考。例如Mx蛋白是一類由干擾素誘導產(chǎn)生具有抗病毒活性的動力蛋白樣GTP酶，可以抑制人體免疫缺損病毒(human immunodeficiency virus，HIV)、馬傳染性貧血病毒(equine infectious anemia virus，EIAV)、貓免疫缺陷病毒(feline immunodeficiency virus，F(xiàn)IV)等反轉錄病毒的復制，但其對于ALV-J的抗病毒活性卻還未研究。研究顯示，ALV-J感染SPF雛雞后，在ALV-J感染的外周血淋巴細胞(PBL)中Mx1表達顯著增加，而其是否發(fā)揮抗病毒作用還未可知。到目前為止，雖然人們對于ALV-J的感染、復制、致瘤、免疫抑制及其天然抗病毒免疫的分子致病機制進行了研究，但是相對于人源反轉錄病毒分子機制研究的深入程度而言，還需要更深入的研究，從而為臨床上ALV-J新型藥物及疫苗的研制提供基礎。