一種CPPs介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化方法的建立及其應(yīng)用

閆可心，閆宗斌，韓金成，薛書江，于龍政，宋建臣，許應(yīng)天

(延邊大學 農(nóng)學院，吉林 延吉 133002)

細胞穿膜肽(cell penetrating peptides，CPPs)也稱為膜穿透肽(membrane penetrating peptide,MPPs)、轉(zhuǎn)運蛋白(membrane transduction peptides，MTPs)、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)域(protein transductions，PTDs)[1]、“特洛伊木馬”肽(Trojan horse peptides) 或轉(zhuǎn)導(dǎo)肽(transduction peptide) 等[2]，是一類氨基酸數(shù)目為5～30 的小分子多肽。由于它可以運載親水分子如核酸、肽、蛋白質(zhì)等生物大分子物質(zhì)進入細胞內(nèi)之后可降解，卻不會引起細胞損傷，而廣泛應(yīng)用于分子生物學、醫(yī)藥學等各個領(lǐng)域[3-7]，但至今尚未有有關(guān)基因轉(zhuǎn)化方面的報道。因此，本研究探討CPPs介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化的可行性，為分子生物學中的基因轉(zhuǎn)化提供一種新的方法。

1 材料與方法

1.1 血液樣本、載體和菌液瑟氏泰勒蟲陽性抗凝血采自吉林省琿春市天一牧場，保存于本實驗室。DH5α菌、BL21(DE3)菌、pET-30a(+)、pMD19-T simple vector均購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 主要試劑DNaseⅠ、ExTaq DNA聚合酶購自TakaRa公司；限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和XhoⅠ、T4 DNA ligase、T4 DNA ligase Buffer、血液DNA提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒(Plasmid Mini Kit Ⅰ)和凝膠回收試劑盒(Gel Extraction Kit)均購自O(shè)MEGA公司；廣譜蛋白marker、IPTG(異丙基硫代-β-D-半乳糖苷)、考馬斯亮藍R-250、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒均購自北京索萊寶公司；其他為分析純試劑。

1.3 CPPs工作液的制備根據(jù)田菊等[8]報道的新型穿膜肽序列，委托北京博奧森公司合成。其細胞穿膜肽序列為：CGRLWMRWYSPWARRYGC。用ddH2O溶解CPPs，最終質(zhì)量濃度為2.35 g/L，分裝凍存于-20℃冰箱備用。

1.4 CPPs-DNA復(fù)合物最適比例將CPPs工作液與5 μL已知濃度的pMD19-T質(zhì)粒按照電荷比為0∶1,1∶1,2∶1,4∶1,8∶1,16∶1,32∶1和64∶1混合[9]，渦旋混勻，在室溫下孵育30 min，得到不同電荷比的CPPs復(fù)合物溶液。將CPPs復(fù)合物與10×loading Buffer混合，用1%的瓊脂糖凝膠電泳初步確定CPPs與質(zhì)粒pMD19-T結(jié)合比例。按上述方法制備不同復(fù)合物，每個樣品加入5 U/μL DNase Ⅰ酶2，5 μL的10×DNase 1 Buffer后補充ddH2O至50 μL，在37℃孵育30 min，加終濃度為1%的SDS，用1%的瓊脂糖凝膠電泳分析CPPs的親和力，最后確定CPPs和pMD19-T的最適比例。

1.5 CPPs-DNA復(fù)合物孵育溫度的優(yōu)化按前期試驗優(yōu)化的條件制備CPPs-DNA復(fù)合物，分別在室溫、37℃、冰水浴條件下孵育30 min，復(fù)合物轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α菌液中，熱激法，即冰水浴30 min，42℃水浴75 s，立即冰水浴2 min，之后分別加入液體LB 400 μL，210 r/min搖菌1 h，留約100 μL的上清液重新吹打菌液，涂在含有氨芐青霉素的固體LB培養(yǎng)基上，37℃過夜培養(yǎng)。每個條件做3個重復(fù)，計算轉(zhuǎn)化率，確定CPPs-DNA復(fù)合物制備條件。

轉(zhuǎn)化率=轉(zhuǎn)化體總數(shù)/質(zhì)粒DNA加入量

轉(zhuǎn)化體總數(shù)=菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×轉(zhuǎn)化反應(yīng)原液總體積/涂板菌液體積,

1.6 CPPs-DNA復(fù)合物孵育時間的優(yōu)化將上述優(yōu)化條件制備的電荷比為16∶1的CPPs-DNA復(fù)合物在室溫下分別孵育15，30，45，60 min，其他同1.5通過熱激法進行轉(zhuǎn)化，每個樣本做3個重復(fù)，并計算轉(zhuǎn)化率。

1.7 大腸桿菌不同保存條件對轉(zhuǎn)化率的影響培養(yǎng)3 h(D600約為0.6)的大腸桿菌菌液保存在4℃冰箱1，3，5，7 d和-20℃冰箱中保存7 d及3，6，12月，保存時加有終濃度為30 %的甘油，分別取菌液100 μL，加入電荷比為16∶1的CPPs-DNA復(fù)合物，其他同1.5通過熱激法進行轉(zhuǎn)化，每組3個平行，計算轉(zhuǎn)化率。

1.8 不同轉(zhuǎn)化條件對轉(zhuǎn)化率的影響-20℃保存的大腸桿菌DH5α菌液冰水浴解凍，加入電荷比為16∶1的CPPs-DNA復(fù)合物混勻后，分別在37℃下孵育15，30 min和室溫孵育15，30 min，分別加入液體LB 400 μL，210 r/min搖菌1 h，留約100 μL的上清液重新吹打菌液，涂在含有氨芐的固體LB培養(yǎng)基上，37℃過夜培養(yǎng)。每組3個平行，計算轉(zhuǎn)化率。

1.9 CPPs基因轉(zhuǎn)化法的應(yīng)用按照常規(guī)方法構(gòu)建牛瑟氏泰勒蟲p33基因的克隆質(zhì)粒和表達質(zhì)粒，其中2次轉(zhuǎn)化過程采用CPPs法進行。

1.10 數(shù)據(jù)處理應(yīng)用Excel和SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理及平均數(shù)差異檢驗,結(jié)果以平均值±標準差表示,以P<0.05為差異顯著性判斷標準。

2 結(jié)果

2.1 CPPs-DNA復(fù)合物的最適電荷比例CPPs 與質(zhì)粒pMD19-T按不同電荷比混合后孵育30 min再進行瓊脂凝膠電泳。結(jié)果顯示，當CPPs 與質(zhì)粒pMD19-T的電荷比大于8∶1時，未見 DNA 遷移條帶(圖1)，表明 CPPs 與質(zhì)粒pMD19-T 的最適電荷比8∶1。將上述復(fù)合物與DNaseⅠ酶孵育后，再加 1% SDS 溶液使 DNA 從復(fù)合物中釋放，進行瓊脂凝膠分析CPPs的親和力。結(jié)果顯示，CPPs 與質(zhì)粒pMD19-T 的電荷比為≥8∶1時可見完整的 DNA 遷移條帶(圖2) ，并且在16∶1最為明顯。綜合2種結(jié)果 CPPs 與質(zhì)粒pMD19-T最適電荷比為16∶1，且具有一定的保護作用。

M.DL 5000 DNA Marker;1～8.分別是CPPs與 DNA 按電荷比為 0,1∶1,2∶1,4∶1,8∶1,16∶1,32∶1和64∶1混合孵育 30 min圖1 CPPs-DNA復(fù)合物的結(jié)合比例

M.DL 5000 DNA Marker;1～8.分別是CPPs與 DNA 按電荷比為0,1∶1,2∶1,4∶1,8∶1,16∶1,32∶1和64∶1混合孵育30 min后，再經(jīng)DNaseⅠ及1% SDS 處理；9.未經(jīng)DNaseⅠ處理的單純的質(zhì)粒 DNA圖2 CPPs-DNA復(fù)合物的親和力

2.2 CPPs-DNA復(fù)合物孵育溫度對轉(zhuǎn)化率的影響將CPPs與質(zhì)粒pMD19-T按照電荷比為16∶1的比例混合后，分別在室溫、37℃、冰水浴3個條件下孵育30 min，直接進行熱激法轉(zhuǎn)化，并計算轉(zhuǎn)化率。結(jié)果顯示，CPPs-DNA復(fù)合物的孵育溫度對質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化的影響較大，室溫孵育時的轉(zhuǎn)化率最高，可達(6.81±0.68)×105CFU/μg，與37℃和冰水浴孵育時的轉(zhuǎn)化率有顯著性差異(P<0.01)。

表1 CPPs-DNA復(fù)合物不同孵育溫度的轉(zhuǎn)化率 ×105 CFU/μg

2.3 CPPs-DNA復(fù)合物的孵育時間對轉(zhuǎn)化率影響將CPPs-DNA復(fù)合物在室溫下分別孵育15，30，45和60 min，加到DH5α菌液中，熱激法，計算出平均轉(zhuǎn)化率，空白對照組沒有長菌。由圖3可見，當復(fù)合物在室溫下孵育15min時轉(zhuǎn)化率很低，但孵育30 min 時轉(zhuǎn)化率可以達到(8.87±0.40)×105CFU/μg，不同孵育時間有差異統(tǒng)計學意義，且差異極顯著(P<0.01)。

2.4 大腸桿菌保存條件對轉(zhuǎn)化率的影響新鮮培養(yǎng)的大腸桿菌DH5α菌液分別保存在4℃冰箱1,3,5和7 d；-20℃冰箱中保存7 d及3,6,12月，之后取出放在冰水中，各加入現(xiàn)制備的CPPs-DNA復(fù)合物，熱激法轉(zhuǎn)化計算轉(zhuǎn)化率。從圖4可以看出，大腸桿菌菌在4℃冰箱只能保存1 d，而在-20℃冰箱保存3月的轉(zhuǎn)化率可達(5.58±0.19)×105CFU/μg，仍達到常規(guī)轉(zhuǎn)化要求。

圖4 大腸桿菌保存在-20℃時的轉(zhuǎn)化率

2.5 大腸桿菌解凍溫度對轉(zhuǎn)化率的影響-20℃冰箱取出的大腸桿菌菌液，分別在室溫、冰水浴、37℃溫度下解凍，之后將室溫下孵育30 min現(xiàn)制備的CPPs-DNA復(fù)合物加到DH5α菌液中，進行轉(zhuǎn)化，并計算轉(zhuǎn)化率。結(jié)果如表2所示，-20℃冰箱取出的大腸桿菌菌液通過冰水浴解凍后平均轉(zhuǎn)化率可以達到(10.71±1.99)×105CFU/μg，DH5α菌液在不同溫度下解凍有差異統(tǒng)計學意義，且差異極顯著(P<0.01)。

表2 大腸桿菌解凍溫度對轉(zhuǎn)化率的影響 ×105 CFU/μg

2.6 轉(zhuǎn)化條件對轉(zhuǎn)化率的影響復(fù)合物在室溫下孵育30 min后分別轉(zhuǎn)到冰水浴解凍的-20℃保存的大腸桿菌DH5α菌液中，混勻后，不再用熱激法，而是分別在37℃下孵育15,30min和室溫孵育15,30 min，之后計算轉(zhuǎn)化率。如表3顯示，復(fù)合物加入到菌液后在37℃下孵育15,30 min，其轉(zhuǎn)化率均未達到常規(guī)轉(zhuǎn)化要求，而在室溫孵育15 min 其轉(zhuǎn)化率已達到常規(guī)轉(zhuǎn)化要求，30 min時的轉(zhuǎn)化率高達(7.85±0.51)×105CFU/μg，與其他組差異顯著(P<0.05)。

表3 轉(zhuǎn)化條件對轉(zhuǎn)化率的影響 ×105 CFU/μg

2.7 CPPs基因轉(zhuǎn)化法的應(yīng)用按照所優(yōu)化的CPPs基因轉(zhuǎn)化法將常規(guī)PCR擴增出的目的片段(圖5)克隆到pMD19-T載體，獲得的重組克隆質(zhì)粒pMD19-T-p33經(jīng)PCR擴增和EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切出預(yù)期大小的片段(圖6)，說明目的基因成功擴增并插入到pMD19-T中。測序結(jié)果表明，克隆得到的牛瑟氏泰勒蟲p33基因片段長786 bp，與GenBank上序列同源性為99.0%。

按常規(guī)法構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pET-30a-p33，經(jīng)EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切得到預(yù)期大小的條帶，證明目的基因已經(jīng)定向插入表達載體pET-30a中。

M.DL2000 DNA Marker；1.水對照；2.p33基因的擴增產(chǎn)物圖5 p33基因的PCR擴增

M.DL2000 DNA Marker；1.pMD19-T-p33的酶切產(chǎn)物；2.未經(jīng)酶切的pMD19-T-p33圖6 重組質(zhì)粒pMD19-T-p33的雙酶切鑒定圖

3 討論

在分子生物學實驗中DNA 重組技術(shù)和基因表達是最常用的研究方法，這些研究中DNA連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化是關(guān)鍵步驟[10]。而常規(guī)基因轉(zhuǎn)化需要制備大量的感受態(tài)細胞，CaCl2法是目前實驗室最常用的制備方法。其原理是Ca2+與細胞膜上的多聚無機磷酸和多聚羥基丁酸化合物結(jié)合形成復(fù)合物，進一步破壞細胞膜上的脂質(zhì)雙分子層，使得外源DNA更易滲入[10]，CaCl2法轉(zhuǎn)化率較高，但是存在繁瑣的大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備、超低溫保存和轉(zhuǎn)化率不穩(wěn)定等問題[11]。為了彌補這些不足點，本研究探討了CPPs在常規(guī)基因轉(zhuǎn)化方面應(yīng)用的可行性。

細胞穿膜肽是一種具有穿膜活性的非病毒載體，可以攜帶各種大分子物質(zhì)進入細胞內(nèi)，并保持其生物活性，是一種具有廣闊前景的運輸載體[2]。雖然CPPs如何作用于細胞質(zhì)膜，以及如何穿透質(zhì)量膜的機制目前還不是十分清楚，但其在分子生物學和醫(yī)藥領(lǐng)域誘人的應(yīng)用前景卻是毋庸置疑的。研究發(fā)現(xiàn)，將CPPs與一些DNA混合后，CPPs作為有效的基因靶腦載體介導(dǎo)核酸進入細胞后，從溶酶體逃逸，完成輸送物質(zhì)的生物學效應(yīng)[7]。細胞穿膜肽有天然的，也有人工合成的。根據(jù)KAMIDE等[12]報道細胞穿膜肽序列中的精氨酸取代第一個賴氨酸時其穿膜能力會增加，將 2 個蘇氨酸更換成色氨酸和丙氨酸有利于穿膜作用。因此，本研究參考田菊等[8]報道的穿膜肽序列人工合成穿膜肽開展了本研究。

質(zhì)粒 DNA 從CPPs-/DNA 復(fù)合物中有效、適時地釋放出來是其基因轉(zhuǎn)化的一個關(guān)鍵因素，兩者的親和力太低就會導(dǎo)致 DNA 提前釋放或被 DNA 酶等水解[13]。本研究用瓊脂糖凝膠電泳和DNaseⅠ酶探討了CPPs-DNA復(fù)合物最適電荷比例。結(jié)果表明，CPPs-DNA最適電荷比為16∶1。在最適制備條件的優(yōu)化中發(fā)現(xiàn)，室溫、37℃和冰水浴3個條件中只有室溫孵育30 min時其轉(zhuǎn)化率達到常規(guī)轉(zhuǎn)化要求，說明孵育溫度對轉(zhuǎn)化率有顯著影響，該結(jié)果與田菊等[8]報道一致。在大腸桿菌保存條件的優(yōu)化中發(fā)現(xiàn)，-4℃冰箱保存時只能保存1 d，而-20℃冰箱保存3月時的其轉(zhuǎn)化率仍達到常規(guī)轉(zhuǎn)化要求。在轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化中發(fā)現(xiàn)，37℃孵育的轉(zhuǎn)化率仍未達到常規(guī)轉(zhuǎn)化要求，而室溫孵育15 min的轉(zhuǎn)化率也達到常規(guī)轉(zhuǎn)化要求，30 min時的轉(zhuǎn)化率更好，為(7.85±0.51)×105CFU/μg，該結(jié)果與CPPs-DNA最適制備條件優(yōu)化結(jié)果一致。本研究首次成功將CPPs基因轉(zhuǎn)化法應(yīng)用到牛瑟氏泰勒蟲p33基因可質(zhì)粒和表達質(zhì)粒的構(gòu)建。目前公認的細胞穿膜肽的穿膜細胞機制有多種。一種是穿膜肽與小分子結(jié)合后通過靜電作用和形成氫鍵的易位或轉(zhuǎn)導(dǎo)作用進入細胞；另一種是穿膜肽與大分子結(jié)合后通過能量依賴的內(nèi)吞作用，特別是巨胞飲作用內(nèi)化進入細胞[14]。認為，本研究中CPPs基因轉(zhuǎn)化法的可能是第一種機制。因為大部分CPPs由堿性氨基酸組成，帶正電荷的CPPs可以和帶負電荷的DNA在一定電荷比條件下混合，靜電相互作用而形成CPPs-DNA 復(fù)合物，形成的復(fù)合物便可進入細胞內(nèi)，表達所攜帶的目的基因[15]。雖然本研究探討了CPPs-DNA復(fù)合物的制備條件以及轉(zhuǎn)化條件，但由于至今其確切的作用機制尚不十分清楚，其影響因素有待進一步深入探討。

總之，CPPs介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化的最佳條件為現(xiàn)制備的CPPs-DNA復(fù)合物電荷比為16∶1，室溫孵育30 min，熱激法加入到-20℃保存用冰水浴解凍的的大腸桿菌菌液中，無需制備感受態(tài)細胞。本研究首次成功將CPPs基因轉(zhuǎn)化法應(yīng)用到牛瑟氏泰勒蟲p33基因克隆質(zhì)粒和表達質(zhì)粒的構(gòu)建。該結(jié)果將分子生物學基因轉(zhuǎn)化提供了一種新方法，也為CPPs的應(yīng)用開辟了新的思路。