異槲皮苷促進(jìn)犬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(cBMSCs)的成骨分化及機理

汪婭媛，郭 娟，田仰清，嚴(yán) 涵，昂艷芬，閆曉霞，嚴(yán)玉霖*

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，云南 昆明 650201；2.云南西雙版納州動物疫病預(yù)防控制中心，云南 景洪 666100)

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)具有自我更新能力以及向骨和軟骨等多種中胚層組織分化的能力，在骨缺損的修復(fù)中起著關(guān)鍵作用[1]。BMSCs現(xiàn)已應(yīng)用于多種人類與動物疾病模型的基礎(chǔ)研究中，并獲得了較好的效果[2]，以犬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(canine bone mesenchymal stem cells,cBMSCs)為基礎(chǔ)的再生醫(yī)學(xué)是獸醫(yī)學(xué)研究的熱點和前沿領(lǐng)域[3]。

天然類黃酮異槲皮苷，也稱為羅布麻甲素和槲皮素3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷[4],是我國云南特種經(jīng)濟植物辣木中天然黃酮類的主要有效成分之一，具有抗骨質(zhì)疏松、抗氧化、抗炎、抗腫瘤、抗突變、抗菌、抗病毒、降血壓、降血脂、抗動脈粥樣硬化、降血糖、神經(jīng)保護(hù)等作用。近年來，研究人員利用中藥粗提物或其活性成分作用于BMSCs，探討中藥對BMSCs增殖、凋亡和分化的影響。有研究表明，中藥淫羊藿苷、柚皮苷等多種黃酮類化合物對BMSCs向成骨細(xì)胞分化有促進(jìn)作用[5-6]。異槲皮苷可通過調(diào)控RUNT相關(guān)因子2和骨形態(tài)形成蛋白的表達(dá)來影響B(tài)MSCs的增殖與分化[7]，異槲皮苷與BMSCs的成骨分化有著密切的關(guān)系。

c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)參與細(xì)胞增殖和分化、形態(tài)維持、骨骼構(gòu)建、凋亡、惡性轉(zhuǎn)化等的調(diào)節(jié)，在成骨細(xì)胞增殖、分化和應(yīng)激中發(fā)揮重要作用[8]。目前的研究表明，JNK信號通路可能是細(xì)胞成骨分化相關(guān)信號通路之一，且許多中藥及化合物，如淫羊藿、川續(xù)斷皂苷Ⅵ、丙二醇等是通過JNK信號通路實現(xiàn)對BMSCs向成骨細(xì)胞分化的調(diào)控[9]?；谏鲜鲅芯客茰y，異槲皮苷能促進(jìn)cBMSCs的成骨分化，且分化機制可能與JNK信號通路有關(guān)，但目前相關(guān)研究較少，因此深入開展異槲皮苷對cBMSCs成骨分化影響的研究，可為進(jìn)一步開展cBMSCs定向分化以及利用異槲皮苷防治相關(guān)疾病等的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器FITC標(biāo)記的羊抗兔二抗(愛必信(上海)生物科技有限公司);RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa公司);異槲皮苷標(biāo)準(zhǔn)品(四川省維克奇生物科技有限公司);倒置熒光顯微鏡(Olympus公司);BIO-RAD-CFX熒光定量PCR儀(美國BIO-RAD公司)。

1.2 細(xì)胞的培養(yǎng)及分組取云南農(nóng)業(yè)大學(xué)病理實驗室液氮保存的原代cBMSCs進(jìn)行培養(yǎng)傳代，至第3代后用于后續(xù)試驗。通過MTT試驗計算得到異槲皮苷對cBMSCs的最適試驗濃度為10-6mol/L。試驗分為2組，對照組：即普通成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基(以DMEM培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，添加地塞米松 0.25 μmol/L、抗壞血酸 5 mg/L、β-甘油磷酸二鈉水合物10 mmol/L、胎牛血清10% 和青鏈霉素 0.1%)；異槲皮苷組:即添加10-6mol/L 異槲皮苷的普通成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

1.3 MTT 法檢測細(xì)胞增值率MTT法參照GB/T16886.5-2003 《醫(yī)療器械生物學(xué)評價 5 部分：體外細(xì)胞毒性試驗》，在最適藥物濃度下測定對照組和異槲皮苷組的細(xì)胞活性，使用酶聯(lián)免疫檢測儀檢測各孔D490 nm值。

1.4 成骨誘導(dǎo)茜素紅染色cBMSCs傳代至第3代后接種六孔板，培養(yǎng)至 80% 后分別用普通誘導(dǎo)培養(yǎng)基和添加異槲皮苷的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，分別培養(yǎng) 7,14,21 d 后去除培養(yǎng)基進(jìn)行固定，洗滌后加入茜素紅染色，于相差倒置顯微鏡下觀察鈣化結(jié)節(jié)染色情況，染色完成后棄掉染液，拍照。

1.5 mRNA的提取與反轉(zhuǎn)錄收集細(xì)胞后，采用Trizol法提取總RNA。將完整性良好的RNA定量為 1 000 ng后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，按照寶生物反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書步驟操作。

1.6 實時熒光定量PCR根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中堿性磷酸酶(ALP)、特異AT序列結(jié)合蛋白2(SATB2)、SOS1和激活轉(zhuǎn)錄因子2(ATF2)的基因序列，利用在線Primer 6.0、Oligo 6.0等引物設(shè)計軟件設(shè)計熒光定量PCR引物，以GADPH為內(nèi)參基因。利用反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行熒光定量PCR試驗。反應(yīng)液體系：TB Green Premix Ex Taq Ⅱ(Tli RNaseH Plus)(2×)10 μL，PCR Forward primer(10 μmol/L)0.8 μL，PCR Reverse primer(10 μmol/L)0.8 μL，DNA模板2 μL，滅菌水 6.4 μL。反應(yīng)程序：5℃ 3 min；95℃ 1 min，50～60℃ 30 s，72℃ 5 min，擴增 40 個循環(huán)。

1.7 酶聯(lián)免疫分析細(xì)胞上清及細(xì)胞內(nèi)ALP含量酶聯(lián)免疫分析細(xì)胞上清及細(xì)胞內(nèi)ALP含量需在測定時制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，按步驟將標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行處理，并設(shè)置空白孔，測定D值。以標(biāo)準(zhǔn)物濃度為橫坐標(biāo)，D值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法所有數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，應(yīng)用SPSS 19.0 軟件，采用單因素方差分析及Tukey檢驗，P<0.05為差異顯著，使用Graphpad prism 6.0制作圖形。

2 結(jié)果

2.1 MTT檢測結(jié)果各組細(xì)胞增殖率見圖1，在所有時間點異槲皮苷組cBMSCs的增值率均顯著高于對照組(P<0.05)，說明異槲皮苷對cBMSCs無明顯細(xì)胞毒性，且異槲皮苷可促進(jìn)cBMSCs的增殖。

注：與對照組比較，*表示P<0.05差異顯著，**表示P<0.01差異極顯著。下同圖1 各組cBMSCs細(xì)胞增殖率(n=3)

2.2 茜素紅染色成骨誘導(dǎo)后細(xì)胞變?yōu)槎嘟切位虿灰?guī)則狀，體積增大，鈣質(zhì)沉積部分被茜素紅著色為紅褐色。誘導(dǎo)7 d時，用茜素紅染色，2組cBMSCs均未出現(xiàn)明顯的鈣化結(jié)節(jié)(圖2 A,D)；誘導(dǎo)14 d時，相較于對照組，異槲皮苷組有更多的紅褐色的鈣化結(jié)節(jié)(圖2 B,E)；誘導(dǎo)21 d時，異槲皮苷組的鈣化結(jié)節(jié)面積明顯增大(圖2 C,F)。

注：→指示為 cBMSCs 鈣質(zhì)沉積圖2 成骨誘導(dǎo)茜素紅染色(400×)

2.3 成骨相關(guān)基因熒光定量 PCR 檢測結(jié)果

2.3.1cBMSCs中ALP mRNA的表達(dá) 從圖3可得知，異槲皮苷組ALP mRNA表達(dá)水平在培養(yǎng)7，14 d時極顯著高于對照組，而在培養(yǎng)21 d時則極顯著低于對照組(P<0.01)。

圖3 cBMSCs ALP mRNA表達(dá)水平的比較(n=3)

2.3.2cBMSCs中SATB 2 mRNA的表達(dá) 從圖4可得知，相較于對照組，異槲皮苷組在所有時間點均可極顯著促進(jìn)cBMACs中SATB2 mRNA的表達(dá)(P<0.01)。

圖4 cBMSCs SATB2 mRNA表達(dá)水平的比較(n=3)

2.4 細(xì)胞及上清中 ALP 含量檢測

2.4.1ALP的標(biāo)準(zhǔn)曲線 由ALP的標(biāo)準(zhǔn)品得到其標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為y= 0.034 6x-0.012 1，相關(guān)系數(shù)為R2= 0.998 9，符合標(biāo)準(zhǔn)曲線要求(圖5)。

圖5 ALP的ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4.2ALP的含量變化 從圖6可得知，與對照組比較，異槲皮苷組cBMSCs在所有時間點ALP含量均極顯著高于對照組(P<0.01)。

圖6 cBMSCs 培養(yǎng)基上清中 ALP 含量(n=3)

2.5 JNK信號通路相關(guān)基因熒光定量PCR檢測結(jié)果

2.5.1cBMSCs中SOS1 mRNA的表達(dá) 從圖7可得知，異槲皮苷組SOS1 mRNA表達(dá)水平在培養(yǎng)7 d顯著低于對照組(P<0.05)，培養(yǎng)14，21 d時極顯著低于對照組(P<0.01)。

圖7 cBMSCs SOS1 mRNA表達(dá)水平的比較(n=3)

2.5.2cBMSCs中ATF2 mRNA的表達(dá) 從圖8可知，異槲皮苷組ATF2 mRNA表達(dá)水平在所有時間點均極顯著低于對照組(P<0.01)。

圖8 cBMSCs ATF2 mRNA表達(dá)水平的比較(n=3)

3 討論

近年來中藥對成骨細(xì)胞成骨分化影響的研究逐漸增多，多種黃酮類的化合物被證實參與成骨細(xì)胞的鈣質(zhì)沉積[10-12]。本研究在了解辣木的有效成分后，選擇將α-托可醌、異槲皮苷、綠原酯等辣木有效成分添加入cBMSCs培養(yǎng)基中，發(fā)現(xiàn)異槲皮苷對cBMSCs的活性影響顯著，最終選擇異槲皮苷進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

3.1 異槲皮苷在cBMSCs成骨分化過程中促進(jìn)細(xì)胞增殖經(jīng)異槲皮苷培養(yǎng)1，2，5 d 后，MTT法檢測發(fā)現(xiàn)對照組在前期會出現(xiàn)少部分cBMSCs死亡的現(xiàn)象，其增殖率明顯低于添加異槲皮苷的cBMSCs。JNK信號通路磷酸化可介導(dǎo)細(xì)胞凋亡[13]，而本研究中的黃酮類化合物異槲皮苷可使SOS1 mRNA的表達(dá)量下降，對JNK信號通路上的相關(guān)因子有負(fù)調(diào)控作用，因此促進(jìn)了cBMSCs的增殖，與齊鵬飛等[14]的研究結(jié)果相近。

在干細(xì)胞移植治療中，由于干細(xì)胞的特性，在其移植治療疾病過程中的異常增殖所導(dǎo)致的癌變也是再生醫(yī)學(xué)研究的一大難題。SOS1作為細(xì)胞癌變的指示因子之一，在癌癥發(fā)生時對細(xì)胞轉(zhuǎn)移、形態(tài)改變、黏附動力學(xué)等起重要作用，因此SOS1可指示在骨肉瘤中癌細(xì)胞的增殖擴散情況[15]。蔣國君等[16]報道，異槲皮苷通過MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)下調(diào)RAS、RAF、MEK、ERK mRNA及相關(guān)蛋白的表達(dá)，誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡。JNK信號通路中的SOS1是組織癌變的指標(biāo)之一，而本研究發(fā)現(xiàn)異槲皮苷可減少SOS1在cBMSCs中的表達(dá)水平，這提示異槲皮苷可能會降低cBMSCs移植治療時癌變的風(fēng)險，但其中的機制以及作用需做進(jìn)一步的研究。

3.2 異槲皮苷促進(jìn)cBMSCs的成骨分化轉(zhuǎn)錄因子SATB2可以影響成骨細(xì)胞分化和頭骨發(fā)育，SATB2基因過表達(dá)可促進(jìn) MSC的成骨分化，當(dāng)BMSCs向成骨細(xì)胞分化時，SATB2的表達(dá)量也會上調(diào)，其表達(dá)水平與成骨細(xì)胞分化程度呈正相關(guān)[17]，而ALP是BMSCs成骨分化程度的指示性因子[18]。本研究中異槲皮苷組相較于對照組明顯促進(jìn)了cBMSCs的SATB 2和ALP的mRNA表達(dá)水平及ALP蛋白的表達(dá)，并使鈣質(zhì)結(jié)節(jié)面積增加，表明異槲皮苷對cBMSCs的成骨分化有促進(jìn)作用。多種黃酮類的化合物被證實具有促進(jìn)成骨細(xì)胞鈣質(zhì)沉積的作用，且有研究發(fā)現(xiàn)，絕經(jīng)期婦女常發(fā)的骨質(zhì)疏松癥，可通過食用與雌激素結(jié)構(gòu)相似的異槲皮苷使病情得到改善[19]，上述觀點進(jìn)一步證實異槲皮苷對成骨分化有促進(jìn)作用。

3.3 異槲皮苷通過下調(diào)JNK信號通路促進(jìn)cBMSCs成骨分化SOS1和ATF2是JNK信號通路的上下游因子。WANG等[20]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)JNK信號通路受阻時，SOS1的表達(dá)量會下降。且有研究表明通過實驗處理細(xì)胞，促使細(xì)胞SOS1的表達(dá)量上升后再抑制細(xì)胞 JNK 信號通路，SOS1的表達(dá)量會下降。ATF2是轉(zhuǎn)錄因子ATF/CREB家族的一員，細(xì)胞受到應(yīng)激后通過MAPKs/p38/JNK磷酸化而被激活誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[21-22]。JNK介導(dǎo)ATF2磷酸化增強了其轉(zhuǎn)錄活性，c-Jun磷酸化的誘導(dǎo)對于許多細(xì)胞的增殖和凋亡非常重要[21]。本研究中，異槲皮苷組SOS1和ATF2 mRNA表達(dá)水平顯著降低，提示JNK信號通路受到抑制，而異槲皮苷促進(jìn)cBMSCs成骨分化，這一過程可能是通過下調(diào)SOS1和ATF2從而抑制JNK信號通路實現(xiàn)的。有研究表明，JNK信號通路磷酸化有降低成骨細(xì)胞ALP沉積的作用，與異槲皮苷結(jié)構(gòu)相近的化合物骨碎補可促進(jìn)成骨細(xì)胞ALP的沉積，并下調(diào)JNK信號通路因子。本研究與劉立萍[23]的研究報道不一致，抑制JNK信號通路后，會顯著抑制中藥左歸丸對小鼠成骨細(xì)胞系MC3T3-E 1細(xì)胞的ALP活性。分析原因發(fā)現(xiàn)可能是由于所使用的細(xì)胞種類來源不同，cBMSCs相對于小鼠成骨細(xì)胞系是更為原始的細(xì)胞，而且藥物的處理濃度也不同，這有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述，異槲皮苷具有促進(jìn)cBMSCs增殖及成骨分化的能力，這一過程可能是通過抑制JNK信號通路來實現(xiàn)的，且可能存在抑制細(xì)胞癌化的作用，提示異槲皮苷可能是一種在cBMSCs的研究和臨床治療中可考慮使用的細(xì)胞添加劑，但具體的添加劑量、作用時間及機制需要做進(jìn)一步的研究。