苦蕎脂氧合酶基因家族的鑒定及其在鋁脅迫應(yīng)答中的表達(dá)

仲雪婷，徐 鴻，李鑫鑫，孫若嘉，付文英，李佳鵬，楊蓮蓮，吳酬飛，張立欽，王占旗

(1.湖州師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，浙江 湖州 313000；2.湖州師范學(xué)院 浙江省媒介生物學(xué)與病原控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 湖州 313000)

鋁(Al)是地殼中含量最豐富的金屬元素，也是土壤無機(jī)礦物的主要元素[1].在酸性條件下，特別是當(dāng)pH低于5.5時(shí)，鋁會(huì)從化合態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)殡x子態(tài)釋放到土壤溶液中[2].此時(shí)，即使在微摩爾(μM)濃度下，鋁離子(Al3+)也會(huì)對植物造成傷害，抑制植物根的生長，影響植物對水分和養(yǎng)分的吸收，從而增加植物對其它類型脅迫的敏感性[3].因此，鋁脅迫被認(rèn)為是威脅全球作物生產(chǎn)和糧食安全的主要環(huán)境限制因素之一[4-5].

脂氧合酶(LOX，EC 1.13.11.12)是一種非血紅素含鐵雙加氧酶，具有催化多不飽和脂肪酸雙加氧生成相應(yīng)的過氧化物能力[6].LOX結(jié)構(gòu)域是由5個(gè)保守的組氨酸(His)殘基形成的與鐵原子結(jié)合相關(guān)的功能結(jié)構(gòu)[His-(X)4-His-(X)4-His-(X)17-His-(X)8-His].根據(jù)多不飽和脂肪酸碳原子氧化的位置，植物L(fēng)OX可分為2個(gè)亞家族，即9-LOX和13-LOX[7].LOX廣泛參與植物的生長、發(fā)育，以及生物和非生物的脅迫應(yīng)答[8-10].

苦蕎是一種被廣泛種植的藥食同源作物，具有較高的經(jīng)濟(jì)和營養(yǎng)價(jià)值[11].近年來，隨著種植規(guī)模的不斷擴(kuò)大和極端天氣的肆虐，苦蕎受到了寒冷[12]、干旱[13]、高溫[14]等非生物脅迫的嚴(yán)重危害.然而，苦蕎對鋁脅迫的響應(yīng)機(jī)制卻很少受到關(guān)注.本研究通過生物信息學(xué)方法系統(tǒng)地鑒定苦蕎LOX基因家族，分析其染色體定位、進(jìn)化關(guān)系和組織表達(dá)模式，并進(jìn)一步利用熒光定量PCR(qRT-PCR)分析苦蕎FtLOX基因在鋁脅迫條件下的表達(dá)水平，最終鑒定出6個(gè)鋁響應(yīng)的FtLOX基因，其中FtLOX6、FtLOX8和FtLOX9可能在苦蕎鋁脅迫應(yīng)答中起著重要作用.

1 材料與方法

1.1 FtLOX基因的鑒定

苦蕎基因組序列下載自Tartary Buckwheat Genome Project(http:∥mbkbase.org/Pinku1)[11].根據(jù)擬南芥、水稻和番茄LOX的蛋白序列，利用HMMER軟件(v.3.2.1)[15]構(gòu)建LOX蛋白的隱馬爾可夫模型(HMM)，并檢索苦蕎全蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫.通過InterPro數(shù)據(jù)庫(http:∥www.ebi.ac.uk/interpro)進(jìn)一步分析在苦蕎候選LOX蛋白中是否含有保守的結(jié)構(gòu)域PLAT/LH2(IPR001024)和LOX(IPR036226)[16]，去除不包含PLAT/LH2和LOX結(jié)構(gòu)域的候選蛋白，其對應(yīng)的編碼基因即為FtLOX基因家族，并利用pI/Mw工具(https:∥web.expasy.org/compute_pi/)對FtLOX蛋白的等電點(diǎn)(pI)和分子量(MW)進(jìn)行計(jì)算.

1.2 多序列比對和系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

利用MEGA 7.0中的MUSCLE程序進(jìn)行多序列比對，并采用neighbor-joining(NJ)法和MEGA 7.0[17]進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建，每個(gè)分支抽樣1 000次.

1.3 基因結(jié)構(gòu)分析

基因結(jié)構(gòu)和啟動(dòng)子數(shù)據(jù)下載自Tartary Buckwheat Genome Project(http:∥mbkbase.org/Pinku1)[11].使用在線工具GSDS 2.0(http:∥gsds.gao-lab.org/)[18]分析基因結(jié)構(gòu).

1.4 基因染色體定位和進(jìn)化分析

基因定位數(shù)據(jù)下載自Tartary Buckwheat Genome Project(http:∥mbkbase.org/Pinku1)[11]，并利用TBtools(v.1.045)[19]進(jìn)行基因定位可視化.串聯(lián)重復(fù)和片段重復(fù)分析按照Yang[20]和Wang[21]等方法進(jìn)行.利用DnaSP 6[22]計(jì)算重復(fù)基因?qū)Φ腒a、Ks和Ka/Ks值.

1.5 基因組織特異性分析

基因組織特異性分析數(shù)據(jù)下載自RNA-Seq數(shù)據(jù)，主要包括SRR5433734、SRR5433731、SRR5433730、SRR5433732、SRR5006770和SRR5433733[11].苦蕎不同組織的選取按照Liu等[23]的研究方法進(jìn)行，主要包括根、莖、葉、花、果實(shí)和種子等，分析結(jié)果利用TBtools(v.1.045)[19]進(jìn)行基因組織表達(dá)可視化.

1.6 鋁脅迫處理

本研究采用苦蕎栽培種“西蕎2號(hào)”為實(shí)驗(yàn)材料，種子購于四川省涼山州喬良種業(yè)有限責(zé)任公司.首先用1% NaCIO(V/V)對苦蕎種子消毒5 min，滅菌水洗滌8次，再用去離子水在25 ℃的黑暗條件下浸種 12 h；將發(fā)芽的種子轉(zhuǎn)移到浮漂上，置于0.5 mM的CaCl2溶液(pH 5.5)中，在25 ℃的黑暗條件下培養(yǎng)3 d后將生長一致的苦蕎幼苗置于0.5 mM的CaCl2溶液(pH 4.5)中培養(yǎng)12 h，再將其隨機(jī)分組分別置于含有0或50 μM AlCl3的0.5 mM的CaCl2溶液(pH 4.5)中處理6 h；收集根尖(0～1 cm)和基本根(1～2 cm)用于RNA提取.每個(gè)處理進(jìn)行3個(gè)生物學(xué)重復(fù).

1.7 RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄和qRT-PCR分析

利用試劑盒Plant RNeasy Kit(Qiagen)，按照說明書對樣品總RNA進(jìn)行提取.利用試劑盒ReverTra Ace qPCR Master Mix(Toyobo)從1 μg總RNA逆轉(zhuǎn)合成cDNA.在CFX96熒光定量PCR儀(Bio-Rad)上進(jìn)行qRT-PCR，采用2-ΔΔCT方法計(jì)算基因相對表達(dá)量，F(xiàn)tH3用作內(nèi)參基因[23].本研究使用的引物見表1.結(jié)果顯示為3個(gè)生物學(xué)重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差.使用統(tǒng)計(jì)軟件(DPS,v15.10)對數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析，P<0.05表示差異具有顯著性[24].

表1 研究中的引物Tab.1 List of primers used in this study

2 結(jié) 果

2.1 FtLOX基因家族的鑒定

本研究共鑒定10個(gè)FtLOX基因家族成員，根據(jù)染色體位置，將其命名為FtLOX1～FtLOX10(表2).鑒定出FtLOX基因的基因組DNA大小為3 711～8 621 bp，其編碼的FtLOX蛋白大小為732～906 aa，它們的等電點(diǎn)和分子量分別為5.6～7.9和83.1～102.3 kDa(表2).多序列比對分析表明：在FtLOX蛋白中存在一個(gè)典型的由38個(gè)氨基酸組成的基序[His-(X)4-His-(X)4-His-(X)17-His-(X)8-His][6]，該基序在所有的FtLOX蛋白中是嚴(yán)格保守的(圖1A).對這10個(gè)苦蕎FtLOXs、6個(gè)擬南芥AtLOXs、14個(gè)水稻OsLOXs和14個(gè)番茄SlLOXs進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，結(jié)果表明：FtLOXs可分為9-LOX和Ⅱ型13-LOX兩個(gè)亞家族，其中9-LOX包括FtLOX5、-8和-9，Ⅱ型13-LOX包括FtLOX1、-2、-3、-4、-6、-7和-10(圖1B).分析結(jié)果還表明：苦蕎FtLOXs與番茄SlLOXs的親緣關(guān)系比與擬南芥和水稻LOXs的親緣關(guān)系更相近，這與目前建立的高等植物L(fēng)OX基因間的進(jìn)化關(guān)系一致[8,10,25].

圖1 苦蕎FtLOXs多序列比對和系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.1 Multiple sequence alignment and phylogenetic analyses of FtLOXs in tartary buckwheat

表2 苦蕎脂氧合酶(FtLOX)基因家族的基因結(jié)構(gòu)和理化特性Tab.2 Structural and physicochemical features of lipoxygenase (LOX)gene family in tartary buckwheat

2.2 FtLOX基因的結(jié)構(gòu)分析

基因家族中基因結(jié)構(gòu)的差異性通常在該基因家族的進(jìn)化中起著重要作用[26].為進(jìn)一步獲得FtLOX基因結(jié)構(gòu)與進(jìn)化的關(guān)系，本研究用鄰接法(NJ)構(gòu)建FtLOX基因家族的系統(tǒng)進(jìn)化樹，并利用在線工具GSDS 2.0[18]分析FtLOX基因家族的基因結(jié)構(gòu).如圖2所示，F(xiàn)tLOX家族含有7～10個(gè)外顯子，其中FtLOX3的外顯子最少(7個(gè))，F(xiàn)tLOX7的外顯子最多(10個(gè))，且無論它們屬于哪個(gè)亞家族，大多數(shù)FtLOX基因的外顯子數(shù)量和大小都是相似的.這表明苦蕎FtLOX的兩個(gè)亞家族之間存在相似的進(jìn)化和擴(kuò)展進(jìn)程.

圖2 苦蕎FtLOXs的基因結(jié)構(gòu)和分子進(jìn)化的關(guān)系Fig.2 Molecular phylogenetic and gene structure relationship of FtLOXs in tartary buckwheat

2.3 FtLOX基因的染色體定位和復(fù)制分析

為進(jìn)一步了解FtLOX基因家族在苦蕎基因組上的分布，本研究利用從苦蕎基因組中提取的位置信息對FtLOX基因進(jìn)行染色體定位分析.如圖3所示，10個(gè)FtLOXs可定位到苦蕎的6條染色體上，其中染色體Ft3、Ft5、Ft6、Ft7和Ft8各定位一個(gè)FtLOX基因，染色體Ft1定位5個(gè)FtLOXs.

本研究還分析了苦蕎FtLOXs的基因復(fù)制模式，在苦蕎基因組中共檢測到4個(gè)片段重復(fù)的FtLOX基因?qū)?80%)和1個(gè)串聯(lián)重復(fù)的FtLOX基因?qū)?20%)(圖3、表3).這說明片段重復(fù)可能是苦蕎FtLOXs進(jìn)化的主要驅(qū)動(dòng)力.為進(jìn)一步估算進(jìn)化日期和隨后的選擇對基因復(fù)制的影響，使用DnaSP 6[22]計(jì)算其基因?qū)Φ姆峭x替換率(Ka)和同義替換率(Ks).前期研究表明：在植物中，Ka/Ks的比值小于0.5，表示片段重復(fù)和串聯(lián)重復(fù)事件的凈化選擇[25].本研究中4個(gè)片段重復(fù)(FtLOX1/FtLOX7、FtLOX2/FtLOX3、FtLOX2/FtLOX10、FtLOX3/FtLOX10)和1個(gè)串聯(lián)重復(fù)(FtLOX3/FtLOX4)的Ka/Ks比值都小于0.5(表3)，說明凈化選擇在苦蕎FtLOX基因進(jìn)化中起著主導(dǎo)作用.按照Koch、Haubold等[27]的研究方法對這些重復(fù)事件的進(jìn)化時(shí)間推算表明，4個(gè)片段重復(fù)可能發(fā)生在約4 290萬年至9 250萬年前，1個(gè)串聯(lián)重復(fù)發(fā)生在約4 720 萬年前(表3).

圖3 苦蕎FtLOXs的染色體定位和復(fù)制情況Fig.3 Localization and duplication events of FtLOXs in tartary buckwheat

表3 苦蕎FtLOXs重復(fù)基因?qū)Σ町怲ab.3 Divergence between duplicated FtLOXs gene pairs in tartary buckwheat

a:Ka/Ks ratio<0.5認(rèn)為是凈化選擇.

2.4 FtLOX基因的組織表達(dá)模式

本研究進(jìn)一步使用公開的RNA-Seq數(shù)據(jù)[11]分析FtLOXs在苦蕎不同組織(根、莖、葉、花、果實(shí)和種子)中的表達(dá)模式，結(jié)果表明(表4、圖4)：所有的FtLOXs至少在一個(gè)組織中表達(dá)；6個(gè)FtLOX基因(FtLOX3和FtLOX5-9)均能在所有的受試組織中檢測到(FPKM ≥ 1.0)，在莖和葉中能檢測到所有FtLOX基因中有8個(gè)基因(FtLOX1、FtLOX3、FtLOX5-10)在根中高水平表達(dá)，其中表達(dá)水平最高的兩個(gè)基因是FtLOX6(FPKM ≥ 92.0)和FtLOX5(FPKM ≥ 68.0);串聯(lián)重復(fù)的基因(FtLOX3和FtLOX4)在受試組織中呈現(xiàn)出顯著的不同表達(dá)模式，說明它們在功能上是不同的.這些結(jié)果符合植物L(fēng)OX串聯(lián)重復(fù)基因的功能進(jìn)化特性[10].

表4 苦蕎FtLOXs的組織表達(dá)模式Tab.4 Tissue expression profiles of FtLOXs

圖4 苦蕎FtLOXs在不同組織中的表達(dá)模式Fig.4 Expression patterns of FtLOXs in different tissues of tartary buckwheat

2.5 鋁脅迫下FtLOX基因的表達(dá)分析

已有研究表明，LOX基因可能參與植物鋁脅迫的應(yīng)答[28].本研究利用qRT-PCR技術(shù)研究在鋁脅迫下苦蕎根尖和基本根中FtLOX基因的表達(dá)譜，結(jié)果表明：FtLOX1和FtLOX10在基本根中的表達(dá)不受鋁的影響，F(xiàn)tLOX10在根尖中的表達(dá)略有增加(圖5中(a)(h)).相反，F(xiàn)tLOX5和FtLOX7在根尖中的表達(dá)不受鋁的影響，但在基本根中的表達(dá)受到鋁的抑制(圖5中(c)(e)).此外，鋁能夠顯著地誘導(dǎo)FtLOX3、FtLOX6、FtLOX8和FtLOX9在苦蕎根尖和基本根中的表達(dá)(圖5中(b)(d)(f)(g))，說明這些FtLOX基因可能在鋁脅迫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用.考慮到FtLOXs在根中的表達(dá)模式(表4、圖4)，推測FtLOX8、FtLOX9特別是FtLOX6可能在苦蕎鋁脅迫應(yīng)答中起著關(guān)鍵作用.

注：“*”表示P<0.05，“**”表示P<0.01，n.s.表示不具有顯著性差異.圖5 qRT-PCR分析鋁脅迫下苦蕎FtLOX基因的表達(dá)水平Fig.5 qRT-PCR analysis of FtLOX genes expression of tartary buckwheat under aluminum stress

3 討 論

本研究鑒定了苦蕎的LOX基因家族，該家族由10個(gè)FtLOX成員組成.根據(jù)擬南芥、水稻和番茄LOX蛋白的氨基酸序列與系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，這10個(gè)FtLOXs可以分為兩個(gè)亞家族，即9-LOX和13-LOX(圖1B).這一結(jié)果與之前對其它植物中LOXs的研究結(jié)果一致[8,10,25].此外，基因結(jié)構(gòu)分析也支持FtLOXs的這一分類，每個(gè)亞家族成員間都有相似的結(jié)構(gòu)域和基因結(jié)構(gòu)(圖2).序列分析表明：所有的FtLOXs都具有保守的植物L(fēng)OX蛋白結(jié)構(gòu)域和典型的基序，包括一個(gè)由38個(gè)氨基酸組成的基序[His-(X)4-His-(X)4-His-(X)17-His-(X)8-His](圖1中A)，這個(gè)保守基序?qū)Ω叩戎参風(fēng)OX的穩(wěn)定性和酶活性至關(guān)重要[8,25].

基因復(fù)制事件包括片段重復(fù)和串聯(lián)重復(fù)，在基因組重排和基因家族的擴(kuò)增中起著重要作用[21].本研究鑒定到4個(gè)片段重復(fù)基因?qū)?個(gè)串聯(lián)重復(fù)基因?qū)⑴cFtLOX基因的復(fù)制(圖3、表3)，表明片段重復(fù)可能是FtLOX基因家族擴(kuò)增的主要基因復(fù)制事件.這一發(fā)現(xiàn)與之前的研究結(jié)果一致[11].此外，本研究中片段重復(fù)基因?qū)痛?lián)重復(fù)基因?qū)Φ腒a/Ks比值都小于0.5，表明凈化選擇在FtLOX基因家族的進(jìn)化中起主導(dǎo)作用.

研究表明，LOX基因在植物生長、發(fā)育和果實(shí)成熟中發(fā)揮著重要作用[9-10]，基因表達(dá)模式往往可以提供基因潛在功能的關(guān)鍵信息[4].本研究使用公開的RNA-Seq數(shù)據(jù)分析FtLOXs在根、莖、葉、花、果實(shí)和種子中的表達(dá)水平，結(jié)果表明：大多數(shù)FtLOXs在所有受試組織中均有表達(dá)(表4、圖4)，說明它們可能在苦蕎的生長和發(fā)育中起重要作用.這一結(jié)果證實(shí)了先前的報(bào)道，LOXs在植物生長和發(fā)育中具有重要功能[8,10].研究還發(fā)現(xiàn)，某些FtLOX基因在特定組織中的表達(dá)水平明顯較高，如葉中的FtLOX3和FtLOX4、根中的FtLOX5、根和莖中的FtLOX6，以及葉和花中的FtLOX7(表4、圖4)，說明這些基因在這些組織中可能具有重要功能.

鋁脅迫是威脅全球農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的一個(gè)主要問題.盡管苦蕎是一種耐鋁作物，但在生長和發(fā)育過程中也常常受到鋁脅迫的影響[11,29].qRT-PCR分析表明，鋁能夠顯著地誘導(dǎo)FtLOX6、FtLOX8和FtLOX9在苦蕎根尖和基本根中的表達(dá)(圖5中(d)(f)(g))，說明這些基因在鋁脅迫應(yīng)答中可能發(fā)揮了作用.因此，本研究結(jié)果有助于闡明LOX基因家族的擴(kuò)增和進(jìn)一步分析其在苦蕎鋁抗性中的功能.

4 結(jié) 論

本研究在苦蕎全基因組范圍內(nèi)鑒定了10個(gè)FtLOX基因，為苦蕎FtLOX基因家族的功能分析提供了重要信息.組織特異性表達(dá)分析表明，F(xiàn)tLOX基因可能參與苦蕎營養(yǎng)器官和生殖器官的發(fā)育.qRT-PCR分析表明，鋁脅迫可以顯著地誘導(dǎo)FtLOX3、FtLOX6、FtLOX8和FtLOX9基因的表達(dá)，抑制FtLOX5和FtLOX7基因的表達(dá).這些結(jié)果有助于進(jìn)一步探索FtLOX基因介導(dǎo)的鋁脅迫響應(yīng)過程和分子機(jī)制，能為系統(tǒng)地研究苦蕎FtLOX基因家族的功能提供重要依據(jù).