心臟類器官的研究進(jìn)展及其臨床應(yīng)用

許 耿，顧海濤

南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院（江蘇省婦幼保健院）小兒心胸外科，江蘇 南京210009

心血管疾病，如心肌梗死和心力衰竭，已成為全球死亡的主要原因［1］。據(jù)世衛(wèi)組織報告，2016年死于心血管疾病的人數(shù)估計為1 790萬，占全球死亡人數(shù)的31%［2］。隨著人類年齡的增長，心臟功能下降給人類健康帶來了沉重的負(fù)擔(dān)。深入研究心血管疾病的發(fā)病機(jī)制、提高心血管疾病的診療水平以及開發(fā)新型藥物成為學(xué)者們關(guān)注的焦點(diǎn)。長期以來，二維（two dimensional，2D）細(xì)胞模型和動物模型一直被用來研究心血管疾病。然而，這些傳統(tǒng)模型都有著自身局限性并不完全適用于心血管疾病的研究。如2D細(xì)胞模型無法模擬免疫系統(tǒng)、無基質(zhì)成分和器官特異性功能，以及在多次傳代后原始細(xì)胞的遺傳異質(zhì)性逐漸喪失［3］。動物模型具有不同的結(jié)構(gòu)和生理學(xué)，并且具有不同的特異性器官發(fā)育和發(fā)病機(jī)制［4］。

類器官是一種新的體外細(xì)胞模型，具有復(fù)雜三維（three dimensional，3D）細(xì)胞結(jié)構(gòu)，它顯示出與體內(nèi)器官相似的結(jié)構(gòu)和功能，可以在3D培養(yǎng)系統(tǒng)中，從胚胎干細(xì)胞、人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（human induced pluripotent stem cells，hiPSC）、成體干細(xì)胞甚至腫瘤細(xì)胞隨機(jī)或者定向分化為不同細(xì)胞類型并組裝形成［5-6］。到目前為止，已經(jīng)成功地建立各種器官的健康及癌癥類器官模型，如肺、胃、腸、肝、胰腺、腎、前列腺和腦［7-8］。類器官顯示出基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用的巨大潛力。首先，類器官可以用來模擬和研究器官發(fā)育及相關(guān)疾病。其次，在藥物實(shí)驗及疾病治療方面也有著廣泛的應(yīng)用空間。雖然在各種器官中已經(jīng)開發(fā)了相應(yīng)的類器官，但是心臟類器官領(lǐng)域的進(jìn)展明顯滯后，部分原因是早期心臟發(fā)育的復(fù)雜性。最近，一系列詳細(xì)描述心臟類器官構(gòu)建與其應(yīng)用的文獻(xiàn)發(fā)表，顯示了心臟類器官領(lǐng)域的快速發(fā)展。

本文描述了心臟類器官的構(gòu)建方法及其潛在的應(yīng)用，包括疾病建模、藥物實(shí)驗、再生醫(yī)學(xué)和治療，同時對其未來的發(fā)展進(jìn)行了展望。

1 心臟類器官構(gòu)建的研究進(jìn)展

類器官保留了細(xì)胞間的接觸，從而促成了它們的相互作用和自我聚集，是一種簡化后的微型器官，可以模擬器官體內(nèi)的微環(huán)境、結(jié)構(gòu)和原始器官的多譜系分化［9］。早期對于心臟類器官的探索開發(fā)中，常利用人類或小鼠的胚胎干細(xì)胞、hiPSC細(xì)胞等，通過懸浮培養(yǎng)成胚胎小體（embryoid body，EB），模擬人類胚胎的早期分化過程，但是其研究重點(diǎn)不在于胚胎發(fā)育形成心臟的機(jī)制，而是將干細(xì)胞誘導(dǎo)分化生成心肌細(xì)胞。Chen等［10］開發(fā)了hiPSC細(xì)胞聚集懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)，通過采用添加小分子物質(zhì)調(diào)節(jié)WNT信號通路及懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的方法來引導(dǎo)hiPSC細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化，可以產(chǎn)生純度90%以上的心肌細(xì)胞。這些體外生產(chǎn)心肌細(xì)胞的方法為心臟類器官的研究奠定了基礎(chǔ)。hiPSC細(xì)胞的出現(xiàn)極大地促進(jìn)了心臟類器官的研究。通過從患者身上獲得血液、皮膚及尿液樣本，對其體細(xì)胞進(jìn)行重新編程，以獲得hiPSC細(xì)胞，隨后將其用于生成類器官［5］。這種方法生成的類器官可以避免胚胎干細(xì)胞所帶來的倫理問題，同時可以獲得患者特異性疾病表型。隨著對心臟類器官的進(jìn)一步研究探索，逐漸出現(xiàn)通過組織工程技術(shù)構(gòu)建的心臟類器官和自組織的心臟類器官，以及3D打印的人工心臟［11-12］。

1.1 組織工程方法構(gòu)建心臟類器官

通過將誘導(dǎo)生成的心肌細(xì)胞與水凝膠或細(xì)胞外基質(zhì)等生物材料結(jié)合，研究者們可以生成一系列基于心肌細(xì)胞的環(huán)、帶、片和補(bǔ)片組織［13-16］，這些心肌組織有著近似于成人心肌的各種結(jié)構(gòu)和收縮特性。Shadrin等［17］將hiPSC細(xì)胞誘導(dǎo)生成的心肌細(xì)胞與水凝膠相結(jié)合，置于模具中，生成了4 cm×4 cm的心臟補(bǔ)片，該心臟補(bǔ)片具有與成人心肌相似的電和機(jī)械特性。將該心臟補(bǔ)片植入大鼠心臟時，其可以與大鼠心臟牢固結(jié)合，維持植入前的電生理功能，并且不增加心律失常的發(fā)生率。Kumatov等［18］通過調(diào)節(jié)細(xì)胞粘附水凝膠的硬度，促進(jìn)EB中血管化心肌樣組織的形成，并形成收縮的心血管器官樣結(jié)構(gòu)。這些生成的心肌組織具有修復(fù)心臟，治療心梗的良好應(yīng)用前景，但是還不能用于研究心臟作為一個泵的壓力和體積之間的基本關(guān)系，也不能用來研究心臟發(fā)育的機(jī)制，同時在作為心臟的疾病模型方面具有一定的局限性。

心室的形成是心臟發(fā)育的關(guān)鍵步驟，一些研究小組通過幾何約束、支架、模具等組織工程技術(shù)生成了帶有腔室的體外心肌模型，這種腔室的出現(xiàn)形成了真正意義上的心臟類器官，它模擬了心臟的心室形成的過程。Lee等［19］將凝膠基質(zhì)與細(xì)胞懸液相互混和，置于硅膠球囊模具中，生成了具有模擬心室形成的腔室心臟類器官。由此產(chǎn)生的心室自發(fā)搏動，將主動壁張力轉(zhuǎn)化為心室壓力，表現(xiàn)出自然心臟生理學(xué)和心室力學(xué)的標(biāo)志性特征，包括殘余應(yīng)力、機(jī)電耦合、正沖程功。這種心臟類器官為心臟泵功能和心臟修復(fù)機(jī)制的高通量體外研究提供了一個較好的模型。Ma等［20］使用聚乙二醇作為底物，通過將hiPSC細(xì)胞幾何限制在微模板中，產(chǎn)生了周邊包含肌成纖維細(xì)胞而中心包含心肌細(xì)胞腔室心臟類器官。Andersen等［21］利用小鼠胚胎干細(xì)胞衍生出具有兩個心臟區(qū)域的“心前類器官”，這兩個心臟區(qū)域的細(xì)胞與體內(nèi)胚胎相應(yīng)發(fā)育階段的對應(yīng)細(xì)胞有高度相似性。Hoang等［22］將生物材料細(xì)胞圖形化技術(shù)與干細(xì)胞類器官工程技術(shù)相結(jié)合，通過引導(dǎo)2D hiPSC細(xì)胞集落形成3D心臟微室，該心臟微室經(jīng)過光刻微加工，可以作為發(fā)現(xiàn)新藥試驗的體外模型。這些微室近似于早期發(fā)育的心臟，具有獨(dú)特的空間組織。

1.2 自組織心臟類器官

心臟發(fā)生是胚胎形成中心臟發(fā)育的過程，涉及不同細(xì)胞類型的分化，包括稱為心肌細(xì)胞的心房和心室肌細(xì)胞，構(gòu)成傳導(dǎo)組織的特定肌細(xì)胞，如浦肯野纖維和平滑肌細(xì)胞，以及非肌細(xì)胞（內(nèi)皮細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞）。心臟發(fā)生的過程還包括形成成熟心臟所需的形態(tài)變化，包括心管的形成、心管環(huán)化以及具有心房和心室細(xì)胞的心臟形成［23-25］。以組織工程技術(shù)為基礎(chǔ)的3D類器官技術(shù)可以幫助人類建立心臟類器官模型，但是在自然過程中，器官的生成并不是人為控制的，而是細(xì)胞自發(fā)組織形成的。在這一過程中，各個細(xì)胞之間會相互作用，隨著器官結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)而生長移動并改變形狀。外界的干擾并不能真正反映心臟的發(fā)育形成過程［11］。最近一些研究通過添加一些心臟發(fā)育必備的生長因子，促使干細(xì)胞自組織形成心臟類器官，并展示了心臟的發(fā)育過程。Lee等［26］開發(fā)了一種從小鼠胚胎干細(xì)胞衍生的胚狀體產(chǎn)生心臟類器官的方法。在層粘連蛋白-內(nèi)皮抑素復(fù)合物和成纖維細(xì)胞生長因子4（fibroblast growth factor 4，F(xiàn)GF4）的刺激下，形成的類器官通過自組織的方式，展示了連續(xù)的形態(tài)學(xué)變化，包括心臟新月形結(jié)構(gòu)、心管形成、心管環(huán)化與腔室形成等過程，所產(chǎn)生的體外心臟類器官具有心房和心室部分，包含心肌、傳導(dǎo)組織、平滑肌和內(nèi)皮細(xì)胞，該類器官的心肌可以自主收縮和產(chǎn)生動作電位。這種自組織的心臟類器官在超微結(jié)構(gòu)、組織化學(xué)和基因表達(dá)特征上與體內(nèi)發(fā)育心臟非常相似。Drakhlis等［27］通過在基質(zhì)膠中嵌入hiPSC細(xì)胞聚集體，使用小分子調(diào)控WNT通路來定向分化出心肌，產(chǎn)生復(fù)雜和高度結(jié)構(gòu)化的心臟類器官。這種心臟類器官由心內(nèi)膜樣細(xì)胞排列的心肌層組成，被原始橫隔樣間葉原基包圍，并包含前腸內(nèi)胚層組織和血管網(wǎng)，結(jié)構(gòu)上非常類似于心管形成前的心原基，而心原基與前腸內(nèi)胚層的發(fā)育密切相關(guān)，該類器官的形成展示了人類心臟早期發(fā)育的過程。Hofbauer等［11］則進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)了在沒有非心臟組織和外源性細(xì)胞外基質(zhì)的情況下，成功開發(fā)了完全自組織的心臟類器官。通過加入6種心臟發(fā)育的關(guān)鍵信號通路因子（Activin、BMP、FGF、retinoic acid和WNT），使hiPSC細(xì)胞來源的心臟類器官經(jīng)歷圖形化和形態(tài)發(fā)生以形成空腔，這種類器官分化出單獨(dú)的心肌層和內(nèi)皮層，并與遷移和分化的心外膜相互作用，從而模擬早期的心腔發(fā)育。自組織心臟類器官可以展示心肌、內(nèi)皮和心外膜等部位形態(tài)發(fā)生及細(xì)胞分化的過程，為研究人類心臟發(fā)生和先天性心臟病的發(fā)生機(jī)制提供了一個強(qiáng)有力的系統(tǒng)。

1.3 3D打印人工心臟

3D生物打印作為一種新興的技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞和生物材料的精準(zhǔn)空間排列，易于快速構(gòu)建大尺寸（厘米級）含細(xì)胞外基質(zhì)的仿生組織結(jié)構(gòu)，近年來取得了重要的突破，比如打印圖案化的組織，可灌注的血管樣網(wǎng)絡(luò)以及可植入支架等［28］。Noor等［29］報道了一種3D打印的血管化的心臟補(bǔ)片，該補(bǔ)片完全匹配患者心臟的免疫、細(xì)胞、生化和解剖特性。首先，把患者的網(wǎng)膜組織細(xì)胞重新編程為hiPSC細(xì)胞，然后把產(chǎn)生的hiPSC細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，再把細(xì)胞外基質(zhì)加工成個性化的水凝膠，然后將這兩種細(xì)胞分別與水凝膠結(jié)合，形成心臟實(shí)質(zhì)組織和血管的生物墨水，運(yùn)用3D生物打印技術(shù)打印出帶有血管的塊狀心臟組織。Lee等［30］采用人類胚胎干細(xì)胞來源的心肌細(xì)胞及膠原蛋白作為生物墨水3D打印心臟，打印的心臟具有瓣膜、小梁、大靜脈和動脈，微小血管等完整的解剖結(jié)構(gòu)。并且心室組織顯示同步收縮、定向動作電位傳播和收縮高峰期高達(dá)14%的壁增厚等特性。這種工程化的心臟具有人類心臟的機(jī)械與電生理特性，但存在成本高、需要耗費(fèi)的心臟細(xì)胞數(shù)目多以及倫理等問題。

2 臨床應(yīng)用

2.1 疾病模型構(gòu)建

類器官保留了體內(nèi)器官的表型及其體外的可操作性，可以幫助我們以傳統(tǒng)細(xì)胞培養(yǎng)方法和動物模型所不允許的方式更好地研究人類疾病的發(fā)生機(jī)制。

心肌梗死是由于阻塞的冠狀動脈限制了含氧血液向下游心肌的輸送，導(dǎo)致大量細(xì)胞死亡，并使血液泵入體內(nèi)的能力降低，從而觸發(fā)神經(jīng)系統(tǒng)恢復(fù)心輸出量的代償活動［31］。心肌梗死或損傷的類器官模型是最早建立的心臟類器官疾病模型。Lee等［19］在建立腔室類器官模型時，采用冷凍損傷方法，建立心臟梗死類器官模型，發(fā)現(xiàn)心臟類器官整體功能受到抑制，損傷區(qū)的局部雙軸縮短變?yōu)檠娱L，反映了由于鄰近肌細(xì)胞收縮導(dǎo)致壓力增加，受損組織被動拉伸，這種心臟類器官的形態(tài)改變類似于心肌梗死動物模型中的心臟室壁變形。Richards等［12］使用不同濃度的去甲腎上腺素刺激心臟類器官，在心臟類器官中建立了一個“凋亡中心-功能失調(diào)內(nèi)部邊緣”的結(jié)構(gòu)，來模擬梗死心臟的“梗死邊緣-遠(yuǎn)端區(qū)域”的結(jié)構(gòu)。對該心肌梗死類器官的轉(zhuǎn)錄組分析顯示，其與人類心肌梗死和急性心肌梗死動物模型的心臟組織基因變化高度相似。目前的心肌梗死類器官模型缺乏炎癥細(xì)胞并使用了不成熟的心肌細(xì)胞，不能突出免疫系統(tǒng)在心肌梗死中的作用。

肥厚型心肌?。╤ypertrophic cardiomyopathy，HCM）是一組影響患者心臟收縮功能的疾病，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，難以研發(fā)普遍有效的治療方法，給社會及醫(yī)保帶來巨大的成本負(fù)擔(dān)［32］。Lan等［33］的研究表明，從HCM患者的hiPSC細(xì)胞分化而來的心肌細(xì)胞含有肌球蛋白重鏈7（myosin heavy chain 7，MYH7）的突變基因，并具有細(xì)胞肥大和異常鈣處理活性的特征，可以產(chǎn)生不規(guī)則搏動和心律失常。Filippo等［34］使用攜帶MYH7突變的HCM患者來源的hiPSC細(xì)胞誘導(dǎo)分化出心臟類器官，發(fā)現(xiàn)與正常人群來源的心臟類器官相比，HCM患者來源的心臟類器官具有心律失常、搏動時間較短等心肌病的特點(diǎn)。這種HCM類器官疾病模型可能成為高通量檢測和驗證治療HCM的新型治療藥物的平臺。

據(jù)報道，心臟類器官既能產(chǎn)生自發(fā)的動作電位，又能產(chǎn)生誘發(fā)的動作電位，并且與二維細(xì)胞模型相比具有更快的傳導(dǎo)速度［35］。相比正常心臟組織，類器官的整體電生理學(xué)顯得不成熟，但該技術(shù)提供了對節(jié)律激活和致心律失常過程可視化和記錄的機(jī)會。此外，心臟類器官可從遺傳性心律失?；颊叩奶禺愋詇iPSC細(xì)胞產(chǎn)生。Shinnawi等［36］使用hiPSC細(xì)胞誘導(dǎo)分化出短QT綜合征（short QT intervalsyndrome，SQTS）的心臟類器官疾病模型，誘導(dǎo)的hiPSC細(xì)胞來自家族遺傳性的短QT綜合征患者，患者的亞家族型電壓門控鉀通道（potassium voltagegated channel subfamily H member 2，KCNH2）基因有1個雜合錯義突變，該心臟類器官的動作電位持續(xù)時間明顯短于正常hiPSC細(xì)胞誘導(dǎo)分化的心臟類器官。這證實(shí)了類器官技術(shù)具有體外模擬SQTS的能力，并為病理性QT間期縮短提供了新的機(jī)制見解。

2.2 藥物試驗

人類藥物開發(fā)的主要挑戰(zhàn)之一是臨床藥物試驗在后期的失敗風(fēng)險，這與巨大的成本負(fù)擔(dān)有關(guān)。心律失常等心臟不良反應(yīng)是66種藥物停藥的最常見原因［37］。據(jù)估計，約45%的停藥和約30%的藥物應(yīng)用限制是由于不必要的心血管效應(yīng)［38］。這些藥物不良事件通常僅發(fā)生在臨床階段，因為藥物反應(yīng)和不良反應(yīng)的臨床前評估是在常規(guī)2D細(xì)胞或非轉(zhuǎn)化動物模型中進(jìn)行的［39］。傳統(tǒng)的體外2D培養(yǎng)是無數(shù)科學(xué)發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)，但并不能準(zhǔn)確地概括體內(nèi)3D細(xì)胞微環(huán)境。與3D系統(tǒng)相比，在2D生長的細(xì)胞經(jīng)歷了培養(yǎng)基表面形態(tài)、培養(yǎng)基質(zhì)硬度、細(xì)胞-細(xì)胞/細(xì)胞-基質(zhì)相互作用以及可溶性生物調(diào)節(jié)因子的作用。因此，2D條件下培養(yǎng)的細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組可以發(fā)生顯著改變，可能產(chǎn)生不代表體內(nèi)細(xì)胞生理學(xué)的實(shí)驗結(jié)果［40］。用于臨床前藥物研究的動物模型有很大的局限性，動物模型與人體具有物種差異性，可能會帶來倫理問題，同時這些模型成本較高，難以控制，并且通常無法準(zhǔn)確模擬人體代謝、藥物療效和免疫功能［41］。生物工程3D細(xì)胞平臺，如由人類原代細(xì)胞和干細(xì)胞衍生細(xì)胞組成的組織器官，模擬了許多存在于天然人類組織中的微環(huán)境條件，也有助于減少心臟研究中實(shí)驗動物的使用，因此可能是臨床前研究和轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)的優(yōu)秀工具。Skardal等［42］對一些美國食品和藥物管理局召回的藥物進(jìn)行毒性檢測，心臟類器官表現(xiàn)出心率下降、不同部位的細(xì)胞死亡等毒性反應(yīng)，同時心臟類器官與2D細(xì)胞耐受藥物毒性的劑量有明顯差異。Milis等［43］通過建立高通量生物工程心臟類器官平臺，對105個具有促增殖潛力的小分子物質(zhì)進(jìn)行了功能篩選，發(fā)現(xiàn)了兩種對心臟功能無明顯影響的促增殖小分子物質(zhì)。

2.3 再生醫(yī)學(xué)與治療

現(xiàn)代再生醫(yī)學(xué)旨在通過同種異體移植，用相應(yīng)的健康組織替代病變組織，然而，健康供體組織供應(yīng)的不足和固有的免疫排斥對受體患者體內(nèi)移植組織的長期存活和功能提出了挑戰(zhàn)。hiPSC細(xì)胞和類器官技術(shù)賦予研究人員從少量的患者體細(xì)胞或容易獲得的組織中開發(fā)同基因或與人類淋巴細(xì)胞抗原匹配的類器官的能力。許多研究已經(jīng)證明了類器官技術(shù)具有替代器官的潛力。Nie等［44］發(fā)現(xiàn)當(dāng)肝臟類器官移植到急性肝衰竭小鼠中時，可以恢復(fù)小鼠的肝功能并提高小鼠的存活率。Gao等［45］將hiPSC細(xì)胞誘導(dǎo)生成的心肌細(xì)胞制造成人類心肌補(bǔ)片，將其植入患有心肌梗死的豬體內(nèi)，可以顯著改善豬的心臟功能，減少心臟梗死面積，提高心肌細(xì)胞的存活率。類器官技術(shù)也可能成為遺傳基因缺陷疾病的一種治療措施。Shinnawi等［36］通過CRISPR技術(shù)糾正SQTS患者心臟類器官細(xì)胞中的KCNH2基因的突變，產(chǎn)生了正常的心臟類器官。

3 總結(jié)與展望

心臟類器官作為新一代的研究模型，在過去10年迅速發(fā)展，具有傳統(tǒng)細(xì)胞和動物模型不具備的優(yōu)勢，極大地促進(jìn)了心血管疾病的相關(guān)研究，在疾病建模、機(jī)制研究、藥物試驗、再生醫(yī)療和治療等方面有著廣泛的應(yīng)用前景，但目前心臟類器官的研究仍然存在一些問題。第一，心臟類器官大多數(shù)只含有單一的細(xì)胞，沒有組織微環(huán)境，如免疫系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)［46］；第二，目前心臟類器官的生成需要添加外在生長因子或分子抑制劑，可能會影響到其藥物實(shí)驗的結(jié)果；第三，目前的心臟類器官構(gòu)建方案眾多，標(biāo)準(zhǔn)不一，高效、高質(zhì)量、標(biāo)準(zhǔn)化的心臟類器官的生成較為困難；第四，現(xiàn)有的心臟類器官仍不成熟，形成的心肌細(xì)胞處于胎兒或新生兒的狀態(tài)［47］。盡管目前這項技術(shù)仍存在一些缺陷，但其在疾病機(jī)制研究及相應(yīng)藥物試驗等方面有著巨大潛力。隨著類器官技術(shù)的進(jìn)一步完善與發(fā)展，將加快心臟藥物的研發(fā)和實(shí)現(xiàn)心臟疾病的個性化治療，類器官技術(shù)也可能成為器官移植的一個新的發(fā)展方向。