極化骨髓巨噬細胞移植對CCl4誘導的肝纖維化大鼠模型的影響

簡 迅， 王丹陽， 許燕楠， 陳佳美， 劉 偉， 陳高峰， 張 華， 劉 平， 慕永平

上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院， 上海中醫(yī)藥大學肝病研究所， 肝腎疾病病證教育部重點實驗室， 上海市中醫(yī)臨床重點實驗室， 上海 201203

肝纖維化是多種慢性肝病所致的以肝臟細胞外基質(ECM)過度增生與異常沉積，導致肝臟組織結構和/或功能發(fā)生異常改變的病理變化。眾所周知，肝星狀細胞(HSC)是肝纖維化發(fā)生的關鍵細胞學基礎，而巨噬細胞在HSC的活化過程中發(fā)揮關鍵的作用[1]。肝臟巨噬細胞主要由肝臟Kupffer細胞和浸潤的單核巨噬細胞構成。在慢性肝損傷過程中，巨噬細胞可通過釋放促炎細胞因子或趨化因子等激活HSC，使其轉化為肌成纖維細胞，分泌大量的ECM，最終導致肝纖維化的發(fā)生與發(fā)展[2]。同時，巨噬細胞具有高度的可塑性，其可根據環(huán)境信號快速地在促炎(M1)和抗炎(M2)之間進行表型轉換，稱之為巨噬細胞極化[3]。M1和M2巨噬細胞具有高度異質性，對纖維化肝臟ECM沉積和組織重建具有雙重調節(jié)作用[4]。如在細菌脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)或炎癥因子等的影響下，巨噬細胞經歷經典活化并分化為M1巨噬細胞，分泌炎性細胞因子如TNFα、IL-6以及活性氧等，使M1巨噬細胞在清除病原體的同時引發(fā)炎癥反應。為了保護宿主免受炎癥損害，巨噬細胞可被IL-4和IL-13等替代激活并分化為M2巨噬細胞，產生抗炎細胞因子(如IL-10)，主要參與凋亡細胞吞噬、炎癥消退、組織修復和重塑等[5]。目前關于M1和M2巨噬細胞在肝纖維化發(fā)生中的作用尚存在分歧，本研究分離大鼠原代骨髓巨噬細胞(bone marrow-derived macrophages, BMDM)，體外誘導分化為M1(M1-BMDM)或M2(M2-BMDM)表型后移植至CCl4誘導的肝纖維化大鼠體內，觀察其對肝纖維化進展的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 生長因子：粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)購于Cyagen公司；巨噬細胞集落刺激因子購于Novus Biologicals公司。L929細胞株購于中國科學院細胞庫。兔多克隆抗體抗CD11b/c[Alexa Fluor?405](NB110-40766AF405)、小鼠單克隆抗體抗CD68[Alexa Fluor?488](NB100-683AF488)購于Novus Biologicals公司；兔多克隆抗體抗α平滑肌肌動蛋白(αSMA，ab5694)、兔多克隆抗體抗CD68 (ab125212)購自Abcam公司；兔多克隆抗體抗CD163 (16646-1-AP)、兔多克隆抗體抗CD206 (18704-1-AP)、兔多克隆抗體Alb(16475-1-AP)以及甘油醛-3-磷酸脫氫酶抗體(GAPDH, 6000-4-1-1)均購自Proteintech公司。qRT-PCR試劑購自Toyobo公司。

1.2 大鼠原代BMDM分離 參考Davis等[6]的方法，雄性SPF級Wistar大鼠，體質量180～200 g，乙醚麻醉下脫頸處死，75%酒精浸泡消毒30 mim，無菌環(huán)境分離大鼠脛骨，高糖培養(yǎng)基沖洗骨髓腔，收集混合液，離心，棄上清。加入10 mL 1×紅細胞裂解液吹打混勻，靜置3 min，同體積高糖培養(yǎng)基吹打混勻，離心，棄上清。加入10 mL 1640細胞培養(yǎng)基重懸細胞，40 μm細胞過濾篩過濾細胞懸液后進行細胞計數，調整細胞濃度為1×106/mL，即可獲得原代BMDM[7]。

1.3 原代BMDM極化 參考Pineda-Torra等[8]的方法。M1極化：在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)條件下，采用10%FBS+50 ng/mL GM-CSF+1640培養(yǎng)基培養(yǎng)原代BMDM，72 h換液，第6天加入5 ng/mL LPS培養(yǎng)12 h，第7天即可獲得成熟的M1-BMDM。M2極化：在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)條件下，采用10% FBS+20% L929細胞培養(yǎng)上清+1640培養(yǎng)基培養(yǎng)原代BMDM，72 h換液，第7 d即可獲得成熟的M2-BMDM。

1.4 M1-BMDM和M2-BMDM的免疫熒光鑒定 多聚甲醛固定細胞過夜，0.5% Triton X-100孵育透膜。加入一抗(M1-BMDM：CD11b/c 1∶150，CD68 1∶500；M2-BMDM：CD206 1∶500，CD163 1∶50)37 ℃避光孵育1 h，PBS清洗。免疫熒光標記二抗室溫下避光孵育1 h，PBS清洗。DAPI染核，PBS清洗，封片，Olympus FV10i激光共聚焦顯微鏡獲取圖像。

1.5 M1-BMDM和M2-BMDM流式細胞鑒定 參考Mily等[9]的方法。使用FACS流式細胞檢測術檢測M1-BMDM和M2-BMDM純度，使用細胞刮板將極化后的細胞收集至1.5 mL離心管中，1500 r/min離心5 min，加入1 mL的1% FBS/PBS混合液(洗滌液)重懸細胞，臺盼藍染色后計數，每管加入1×106個細胞、0.5 μL純化的小鼠抗大鼠CD32封閉Fc段，4 ℃冰箱孵育15 min后加入1 mL洗滌液，1500 r/min離心5 min，棄上清；每管加入29.5 μL洗滌液后分別加入0.5 μL PE抗大鼠CD45、0.5 μL FITC抗大鼠CD11b/c、5 μL CD68-PE-Vio770(TM)rat、1 μL CD206(15-2)，吹打混勻，4 ℃避光靜置30 min；CD68與CD206同型對照樣本分別加入5 μL PE-Vio 770 130-113-452、1 μL正常小鼠IgG1 Alexa Fluor?647，4 ℃避光靜置30 min。BECKMAN DxFLEX流式細胞儀檢測樣本，Flow Jo軟件分析檢測結果。

1.6 實驗動物 雄性Wistar大鼠24只，SPF級，體質量160～180 g，購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，生產許可證編號SCXK(滬)2018-0006，上海中醫(yī)藥大學實驗動物中心飼養(yǎng)，使用許可證編號SYXK(滬)2014-0008。

1.7 模型制備與分組干預 大鼠隨機分為正常組(N,n=6)和模型組(n=18)。模型組以30% CCl4-橄欖油溶液2 mL/kg皮下注射，2次/周，共9周。于第7周開始，模型大鼠隨機分為模型對照組(M，n=6)，M1-BMDM組(n=6)，M2-BMDM組(n=6)，各組大鼠在繼續(xù)CCl4造模的同時，M1-BMDM組和M2-BMDM組予以相應巨噬細胞尾靜脈注射，每只細胞注射量為1×106/mL[7]；N組和M組予以等體積生理鹽水尾靜脈注射。第9周末取材。

1.8 血清生化學檢測 血清ALT、AST由上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院臨床醫(yī)學檢驗中心檢測。

1.9 肝組織Hyp含量測定 使用堿水解法測定肝組織羥脯氨酸(Hyp)含量，稱取50 mg肝組織后水解，檢測步驟按照試劑盒說明書操作[10]。

1.10 肝組織病理和免疫組織化學 石蠟固定組織切片厚4 μm，采用HE、天狼猩紅染色。并采用圖像分析軟件Leica LAS Image Analysis對天狼猩紅陽性染色面積進行分析。陽性染色面積百分比=陽性染色面積/圖片總面積×100%。免疫組織化學方法參考文獻[11]。組織切片脫蠟至水，采用αSMA(1∶1000)、CD68(1∶500)、CD163(1∶1000) 等一抗孵育1 h，HRP標記的二抗(1∶1000) 孵育30 min，洗滌，DAB顯色，蘇木精-伊紅(HE)染色，Leica SCN 400掃描儀掃描。

1.11 實時熒光定量PCR (qPCR) αSMA、TGFβ、TNFα、IL-4、IL-6、IL-10、Col1a1、Col4、基質金屬蛋白酶(MMP)2、MMP9、MMP13、TIMP-1 mRNA表達采用qPCR方法檢測?？俁NA提取采用RNA純化試劑盒(Toyobo公司)，mRNA表達檢測采用SYBR Green real-time PCR Master Mix (SYBR) (Toyobo公司)，以及ViiATM7 real-time PCR System。引物由Takara公司設計合成。SYBR一步法RT-PCR反應條件如下：42 ℃15 min、95 ℃ 2 min、95 ℃變性15 s，40個循環(huán)，60 ℃延伸退火1 min。

1.12 免疫印跡 肝組織采用RIPA 緩沖液裂解，4 ℃12 000 r/min離心10 min，測定上清液蛋白濃度，10%或12%凝膠電泳，轉移至Hybond-ECL硝酸纖維膜，封閉，一抗4 ℃孵育過夜，αSMA(1∶1000)、CD68(1∶500)、CD163(1∶1000)、Alb(1∶500)、GAPDH(1∶5000)；二抗(1∶10 000)室溫下孵育1 h，ECL顯影，自動掃描儀讀取每一條帶的灰度積分值。

1.2 倫理學審查 本研究經上海中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會批準，批號：PZSHUTCM190823003。

2 結果

2.1 成功分離大鼠原代BMDM并誘導分化為M1和M2表型 培養(yǎng)至第7天時M1-BMDM和M2-BMDM均呈不規(guī)則形態(tài)特征。免疫熒光染色顯示，M1-BMDM高表達CD11b/c和CD68(圖1a、b)，M2-BMDM高表達CD163和CD206(圖1c、d)。流式細胞計數顯示M1-BMDM為CD45+(98.6%)、CD68+(88.6%)、CD11b/c+(97.7%)(圖1e)；M2-BMDM為CD206+(98.9%)(圖1f)。qRT-PCR檢測結果顯示，M1-BMDM CD68 mRNA水平顯著上調(P<0.01)，M2-BMDM CD206 mRNA水平顯著上調(P<0.01)(圖1g)。

2.2 M1-BMDM和M2-BMDM均可抑制肝臟炎癥反應和肝纖維化進展 HE染色顯示，M組大鼠肝小葉結構紊亂，肝細胞廣泛脂肪變性，匯管區(qū)大量炎性細胞浸潤；與M組比較，M1-BMDM和M2-BMDM組肝細胞脂肪變性及炎癥反應明顯減輕(圖2a)。血清生化學檢測顯示，與N組比較，M組ALT、AST活性顯著升高[分別為(1433.6±310.77) U/L vs (16.6±1.5)U/L, (2311.8±246.20) U/L vs (60.6±12.1)U/L,P值均<0.01]，與M組比較，M1-BMDM和M2-BMDM組ALT [分別為(649.29±396.28)U/L、(894.17±348.27) U/L]、AST [分別為(1109.86±695.21) U/L、(1335.83±425.75) U/L]均顯著降低(P值均<0.01)(圖2c)。

天狼猩紅膠原染色顯示，M組大鼠匯管區(qū)可見大量膠原沉積，部分膠原纖維伸入肝實質，形成完整的假小葉結構。與M組比較，M1-BMDM和M2-BMDM組肝臟膠原沉積明顯減輕(圖2b)。與N組比較，M組肝組織Hyp含量顯著增加[(311.26±61.44) μg/g vs (177.32±10.72) μg/g,P<0.01]；與M組比較，M1-BMDM和M2-BMDM組Hyp含量均顯著降低[分別為(225.08±47.86) μg/g vs (311.26±61.44) μg/g,P<0.05; (211.42±50.51) μg/g vs (311.26±61.44) μg/g,P<0.01](圖2c)。與Hyp相吻合，膠原半定量分析顯示，M組膠原染色陽性染色面積顯著增加(5.00±2.20 vs 1.16±0.20,P<0.01)，與M組比較，M1-BMDM和M2-BMDM組肝臟膠原染色陽性面積顯著減少(2.38±0.70 vs 5.00±2.20, 2.27±0.61 vs 5.00±2.20,P值均<0.05)(圖2e)。

2.3 M1-BMDM和M2-BMDM可顯著抑制HSC活化 免疫染色顯示，M組肝組織αSMA陽染細胞明顯增加，與M組比較，M1-BMDM和M2-BMDM組αSMA陽染細胞明顯減少(圖3a)。免疫印跡顯示，M組肝組織αSMA蛋白表達顯著增加(P<0.01)，與M組比較，M1-BMDM和M2-BMDM組αSMA蛋白表達均顯著降低(P值均<0.01)(圖3b、c)。qRT-PCR檢測顯示，M組αSMA、TGFβ1、Col1a1、Col4 mRNA表達均顯著增加(P值均<0.01)；與M組比較，M1-BMDM和M2-BMDM組上述指標mRNA表達水平均顯著降低(P<0.05或P<0.01)(圖3d)。

2.4 M1-BMDM和M2-BMDM對肝臟巨噬細胞活化、膠原酶及炎癥因子表達的影響 免疫染色顯示，與N組比較，M組CD68陽染細胞明顯增加，而CD163和CD206陽染細胞明顯減少。與M組比較，M1-BMDM組CD68陽染細胞改變不明顯，M2-BMDM組CD68陽染細胞明顯減少；M1-BMDM和M2-BMDM組CD163和CD206陽染細胞均有所增加，尤以M2-BMDM組最為顯著(圖4a～c)。

免疫印跡顯示，與N組比較，M組CD68蛋白表達顯著增加(P<0.01)，而CD163蛋白表達顯著降低(P<0.01)。與M組比較，M1-BMDM組CD68蛋白表達有降低趨勢但無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，M2-BMDM組CD68蛋白表達顯著降低(P<0.01)，且顯著低于M1-BMDM組(P<0.05)；M1-BMDM和M2-BMDM組CD163蛋白表達均顯著升高(P值均<0.01)，且M2-BMDM組顯著高于M1-BMDM組(P<0.05)(圖4d、e)。

MMP及其抑制劑檢測顯示，與N組比較，M組MMP2、MMP9和TIMP-1 mRNA表達均顯著升高(P值均<0.05)，而MMP13 mRNA表達水平顯著降低(P<0.01)；與M組比較，M1-BMDM和M2-BMDM組MMP2、TIMP-1 mRNA表達水平顯著降低(P值均<0.05)，而MMP13 mRNA表達水平顯著升高(均P<0.01)(圖4f)。

炎癥相關細胞因子檢測顯示，與N組比較，M組IL-4、IL-6、IL-10 mRNA表達水平顯著降低(P值均<0.05)，TNFα mRNA表達水平顯著升高(P<0.05)；與M組比較，M1-BMDM和M2-BMDM組IL-6、IL-10 mRNA表達水平均顯著升高(P值均<0.01)，且M2-BMDM組顯著高于M1-BMDM組(P<0.05)； M2-BMDM組TNFα mRNA表達水平顯著高于M組和M1-BMDM組(P值均<0.01)(圖4g)。

此外，免疫印跡檢測顯示，與N組比較，M組肝組織Alb蛋白表達顯著降低(P<0.01)；與M組比較， M2-BMDM組Alb表達顯著升高(P<0.01)，且顯著高于M1-BMDM組(P<0.01)(圖4h、i)。

3 討論

巨噬細胞起源于單核細胞前體，具有吞噬、抗原遞呈和分泌等多種功能，在組織穩(wěn)態(tài)和宿主防御中發(fā)揮重要作用[12]。由于巨噬細胞不同表型的高度特異性，普遍認為不同類型的巨噬細胞對肝纖維化的進展所帶來的影響不同[5,13]。但近年來，大量研究發(fā)現M1巨噬細胞同樣具有良好的抗炎和抗肝纖維化作用。如Ma等[14]研究表明BMDM體外極化為M1表型后對CCl4誘導的小鼠肝纖維化模型具有良好的干預作用，而M2-BMDM反而無效。本研究將BMDM極化為M1和M2表型后經尾靜脈注入CCl4誘導的肝纖維化大鼠體內，結果表明兩者均可顯著改善肝功能和肝組織病理，且顯著降低肝組織Hyp含量，表明兩者均具有良好的抗實驗性肝纖維化作用。

HSC在肝纖維化的發(fā)生與發(fā)展中發(fā)揮主導作用[15]，而TGFβ1主要來源于Kupffer細胞，是促進HSC活化和增殖的關鍵細胞因子[16]。本研究結果表明，M1-BMDM和M2-BMDM注射后均可顯著降低肝組織αSMA蛋白水平以及αSMA、TGFβ1、Col1a1和Col4 mRNA表達水平，提示兩者均可顯著抑制HSC的活化。一般認為M1巨噬細胞主要促進HSC的活化和肝纖維化進展，本研究出現相反的結果，可能與M1-BMDM促進內源性巨噬細胞向纖維化部位募集，而這些內源性巨噬細胞表現為Ly6Clow修復型巨噬細胞表型，并通過產生MMP促進膠原降解有關[14]。

肝纖維化逆轉不僅需要抑制HSC的活化，還需要促進ECM的降解，MMP家族在此過程中發(fā)揮關鍵作用。肝臟巨噬細胞是MMP的主要來源，特定的亞型通過分泌不同的MMP增強ECM降解以促進纖維化的消褪[17]。如M2巨噬細胞主要分泌MMP-9、MMP-12、MMP-13等促進活化的HSC凋亡以及纖維化消退[18]。本研究結果顯示，M1-BMDM和M2-BMDM注射后，均可顯著促進肝臟CD163和CD206的蛋白表達水平，M2-BMDM還可顯著降低CD68蛋白表達，且兩者均可增加MMP9、MMP13 mRNA表達水平，顯著降低 MMP2和TIMP-1 mRNA表達水平。提示M1-BMDM和M2-BMDM均可改善肝臟炎癥環(huán)境，促進肝臟M2巨噬細胞增殖并分泌MMP9和MMP13以促進膠原降解。

此外，一般認為TNFα和IL-6主要來源于M1巨噬細胞，發(fā)揮促炎作用[19]，而IL-10主要來源于M2巨噬細胞，發(fā)揮抗炎作用[20]。但TNFα和IL-6在肝損傷再生過程中也發(fā)揮關鍵作用[21]，研究表明，肝切除術后2 h左右，肝臟TNFα水平明顯上升，隨后IL-6水平顯著增加[22]，同時，IL-6基因敲除小鼠表現出明顯的肝再生受限[23]，提示TNFα和IL-6缺失可延緩肝臟再生[24]。這一觀點與本研究結果相吻合，即M1-BMDM和M2-BMDM注射后均可顯著增加IL-6、IL-10的mRNA表達水平，且兩者在M2-BMDM組顯著高于M1-BMDM組，且M2-BMDM還可顯著提高肝組織TNFα mRNA以及Alb的蛋白表達水平，提示M1-BMDM和M2-BMDM不僅能夠抑制肝臟炎癥反應和纖維化進展，后者還可能促進肝細胞的增殖和分化。

綜上所述，巨噬細胞在生理和病理條件下對肝臟穩(wěn)態(tài)的調節(jié)發(fā)揮重要作用[25-26]。M1-BMDM和M2-BMDM對實驗性肝纖維化均具有良好的干預效應，兩者均可抑制肝臟炎癥反應和HSC活化，促進抗炎M2巨噬細胞活化。此外，M2-BMDM可能還可抑制促炎M1巨噬細胞活化及促進肝再生，因此其綜合干預效果更佳。本研究尚處于初期階段，M1-BMDM和M2-BMDM注射后在體內的分布過程尚不清楚，其治療肝纖維化的內在機制仍有待深入研究；此外，雖然相對于模型組來說，M1-BMDM和M2-BMDM均具有良好的抗肝纖維化作用，但兩者是否優(yōu)于M0，尚有待今后實驗予以完善。此外，M1和M2巨噬細胞只是巨噬細胞活化的兩種極端狀態(tài)，且M2巨噬細胞可分為3 個亞群：M2a、M2b和M2c，不同亞型的功能也有差異[27]。還有學者認為肝纖維化恢復期的Ly6C+單核細胞具有與M1/M2 不同的表型[28]。因此，目前對于肝臟巨噬細胞表型轉換的潛在機制還缺乏充分的認識，未來需要對肝巨噬細胞的基因組和表型進行深入的研究，為肝纖維化的臨床治療提供科學依據。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監(jiān)護人以及與公開研究成果有關的利益沖突。

作者貢獻聲明：慕永平、劉平等負責課題設計；簡迅、王丹陽、陳高峰負責實驗實施、資料分析以及撰寫論文；許燕楠、陳佳美、劉偉等參與收集數據，修改論文；張華負責醫(yī)學統(tǒng)計；慕永平負責擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。