林蛙卵蛋白的功能特性及組分鑒定

張 葉，趙昌輝，張鐵華

（吉林大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130000）

0 引言

中國(guó)林蛙，俗名又稱蛤士蟆、雪蛤，主要分布在我國(guó)東北地區(qū)和中原地區(qū)，是一種珍貴的藥食兼用的經(jīng)濟(jì)型動(dòng)物[1]。林蛙通常在2月份進(jìn)入繁殖期，從繁殖期的雌蛙體內(nèi)取出的輸卵管即為林蛙油，而林蛙卵就是剝離輸卵管后剩余的副產(chǎn)物[2]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，每只林蛙一年最多可產(chǎn)1 200～1 300顆卵。在每年林蛙的人工養(yǎng)殖場(chǎng)地中，林蛙卵的產(chǎn)量約為林蛙油的8倍。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，林蛙卵的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值并不低，甚至可能高于目前被市場(chǎng)廣泛認(rèn)可的林蛙油。林蛙卵中含有種類豐富的蛋白質(zhì)，以及不飽和脂肪酸、多種人體必需氨基酸、維生素和雌激素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[3]，具有極大的開(kāi)發(fā)潛力。林蛙卵中蛋白含量多且種類豐富，約占卵總組分的16.8%，王宇等人[4]采用高效液相色譜技術(shù)和氨基酸分析儀測(cè)定表明，卵蛋白中包含人體營(yíng)養(yǎng)需要的9種必需氨基酸，其中天冬氨酸和谷氨酸含量最高。陶鳳云等人[5]利用有機(jī)溶劑分級(jí)沉淀加多種色譜技術(shù)的方法分離得到一種蛋白質(zhì)，具有RNA酶活性。這種具有RNA酶活性的林蛙卵蛋白可有效抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)[6]。張肅等人[7]得出了林蛙卵蛋白對(duì)抗疲勞有積極作用的結(jié)論。這些研究證實(shí)了林蛙卵蛋白的生理活性但沒(méi)有測(cè)定過(guò)它的基礎(chǔ)功能特性和蛋白組成。

蛋白的功能特性是指其在食品加工過(guò)程及運(yùn)輸貯藏條件下在食品體系中起到的特殊作用，物理、化學(xué)等多方面作用及共同作用都包含其中。林蛙卵中的蛋白含量高表明其在食品工業(yè)中有很大的應(yīng)用潛力。對(duì)林蛙卵蛋白的基本功能特性（如溶解性、持水性、凝膠性、起泡性、乳化性等性質(zhì)）要有深入的了解，才能根據(jù)其功能特點(diǎn)決定在食品配方中的具體用途[8]，從而提升林蛙卵蛋白在食品工業(yè)中的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料及方法

1.1 材料

林蛙干卵，吉林通化康元生物公司提供；正己烷、氫氧化鈉、鹽酸均為食品級(jí)，北京化工廠提供。

1.2 儀器與設(shè)備

XMTD-8222型電熱恒溫水浴鍋，北京長(zhǎng)源實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠產(chǎn)品；ML204TS型電子分析天平，德國(guó)IKAC公司產(chǎn)品；IKAC-HS7型磁力加熱攪拌器，德國(guó)IKAC公司產(chǎn)品；AVANTIJ-E型高速離心機(jī)，美國(guó)貝克曼公司產(chǎn)品；PHS-3c型雷磁pH計(jì)，中國(guó)上海精科儀器有限公司產(chǎn)品；Alphal-2型冷凍干燥機(jī)，德國(guó)Martin Christ公司產(chǎn)品；SyergyhtHT型酶標(biāo)儀，美國(guó)Biotek公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 林蛙卵蛋白的提取

林蛙卵的蛋白提取參考金紅等人[9]、李知興等人[10]的方法并加以改動(dòng)。取適量林蛙卵于40℃烘箱中烘干2 h，取出后放入自封袋于干燥器中儲(chǔ)存?zhèn)溆?。以正己烷作為提取劑?duì)蛙卵進(jìn)行浸提脫脂，在料液比1∶8（g∶mL），溫度40℃的條件下恒溫振蕩4 h，然后以轉(zhuǎn)速3 000 r/min離心20 min，棄去提取液，反復(fù)浸提3次。在通風(fēng)櫥內(nèi)揮發(fā)掉殘余有機(jī)溶劑，然后將脫脂后的蛙卵經(jīng)烘干粉碎成脫脂林蛙卵粉。

取脫脂后的蛙卵用粉碎機(jī)粉碎，過(guò)60目篩，得到林蛙卵粉放入自封袋后于干燥器中儲(chǔ)存?zhèn)溆?。采用堿溶酸沉法提取林蛙卵蛋白。取一定量脫脂林蛙卵粉與水按1∶10（g∶mL）混合，攪拌30 min使其充分溶脹，用1 mol/L NaOH調(diào)pH值至11.0，50℃下恒溫水浴攪拌90 min后，以轉(zhuǎn)速5 000 r/min離心20 min，收集上清液。沉淀按原料液比再提取2次，合并3次上清液，用1 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH值至4.5，4℃下靜置12 h后以轉(zhuǎn)速8 000 r/min離心20 min，收集沉淀。沉淀加水調(diào)pH值至7.0，然后攪拌使沉淀復(fù)溶。冷凍干燥得林蛙卵蛋白粉。

1.3.2 林蛙卵蛋白的溶解性

林蛙卵蛋白的溶解度用氮溶解指數(shù)NSI來(lái)表示。蛋白濃度通過(guò)BCA快速測(cè)定試劑盒來(lái)完成，然后計(jì)算氮溶解指數(shù)。加好樣品的96孔板迅速放到37℃恒溫培養(yǎng)箱中保溫30 min，顯色結(jié)束后迅速于波長(zhǎng)562 nm處測(cè)定吸光度。另取樣品液在4℃條件下以轉(zhuǎn)速10 000 r/min離心15 min，離心后的上清液按照同樣步驟操作，控制溫度和時(shí)間條件與之前一致，測(cè)定其在波長(zhǎng)562 nm處的吸光度。每個(gè)樣品做3次平行。根據(jù)BSA標(biāo)準(zhǔn)品繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=1.168 1X+0.128 2，R2=0.998 4計(jì)算樣品中的蛋白含量，溶解性（NSI）計(jì)算公式如下：

1.3.3 林蛙卵蛋白的持水性

林蛙卵蛋白的持水性測(cè)定根據(jù)Qin X S等人[11]的方法并稍作修改。準(zhǔn)確稱取1 g林蛙卵蛋白樣品（A1）于50 mL離心管中，緩慢加入蒸餾水，邊加水邊攪拌，直到樣品變成輕微流動(dòng)性的糊狀，但不到能溶解的程度，然后將玻璃棒上的殘留洗到離心管中，隨后將蛋白糊在恒定溫度下保溫30 min，靜置結(jié)束后室溫條件下以轉(zhuǎn)速3 200 r/min離心5 min，緩緩傾斜離心管，使其中的多余水分流出，用濾紙吸取壁上殘留的水分然后稱取蛋白糊質(zhì)量A2，根據(jù)公式（2）計(jì)算蛋白持水性，每個(gè)樣品做3次平行。

1.3.4 林蛙卵蛋白的起泡性

林蛙卵蛋白的起泡性測(cè)定參考Kuan Y H等人[12]的方法并適當(dāng)修改。

（1）起泡性。配制1%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的蛋白樣品，調(diào)pH值，磁力攪拌30 min使之充分溶解后轉(zhuǎn)移到100 mL容量大小的量筒中并記錄初始體積V1，隨后以轉(zhuǎn)速10 000 r/min在高速剪切機(jī)下固定量筒作用2 min，記錄剪切作用結(jié)束時(shí)的溶液體積V2。每個(gè)樣品做3次平行。林蛙卵蛋白的起泡能力和起泡穩(wěn)定性用以下公式計(jì)算：

式中：V1——樣品初始體積，mL；

V2——均質(zhì)剛結(jié)束時(shí)的液體體積，mL。

（2）起泡穩(wěn)定性。將上述高速剪切結(jié)束后的樣品靜置30 min，然后再記錄此時(shí)的液體體積V3，用公式（4）計(jì)算其起泡穩(wěn)定性：

式中：V3——樣品高速剪切結(jié)束30 min后的液體體積，mL。

1.3.5林蛙卵蛋白的乳化性

林蛙卵蛋白的乳化性測(cè)定根據(jù)Haiying Chen等人[13]的方法并稍作改動(dòng)。分別配制蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%，0.2%，0.3%，0.4%，0.5%（W/V）的樣品，調(diào)pH值至9。然后在9 mL蛋白溶液樣品中加入3 mL新鮮購(gòu)買(mǎi)的葵花籽油，以轉(zhuǎn)速10 000 r/min在高速剪切機(jī)下固定量筒作用1 min。作用結(jié)束后迅速吸取20 μL溶液與5 mL 0.1%（W/V）的SDS溶液搖晃均勻，然后立即于波長(zhǎng)500 nm處測(cè)定吸光值（A0），不加樣品的0.1% SDS溶液是試驗(yàn)的空白對(duì)照；經(jīng)過(guò)剪切作用后的蛋白樣品要靜置10 min后再次取下清液，并按上述步驟測(cè)定吸光值（A1）。林蛙卵蛋白的乳化活力和乳化穩(wěn)定性分別用乳化活性指數(shù)（EAI）和乳化穩(wěn)定性指數(shù)（ESI）來(lái)表示，它們的計(jì)算公式如下：

式中：D——稀釋倍數(shù)，D=250；

C——蛋白質(zhì)濃度，mol/mL；

Φ——油相所占的比例，Φ=1/4；

L——比色皿的厚度，L=1 cm；

Δt=10 min。

1.3.6 林蛙卵蛋白的蛋白組分鑒定

蛋白酶解：取100 μg蛋白使用FASP法進(jìn)行蛋白質(zhì)酶解，具體步驟如下：

（1）加入濃度為8 mol/L的Urea將體積補(bǔ)足至200 μL；

（2）向溶液中加入DTT試劑，使它的終濃度為10 mmol/L，然后在56℃水浴下反應(yīng)30 min；

（3）在向溶液中加入IAA試劑，使它的終濃度為50 mmol/L，室溫下用錫紙包裹嚴(yán)密，避光反應(yīng)40 min；

（4）將反應(yīng)結(jié)束的樣品轉(zhuǎn)移至10 K的超濾管中，室溫條件下以轉(zhuǎn)速12 000 r/min離心5 min，棄掉濾液；

（5）在濾管中加入8 mol/L的Urea 400 μL，室溫下以轉(zhuǎn)速12 000 r/min離心5 min，再棄掉濾液，該步驟重復(fù)3次；

（6）向?yàn)V管中再次加入50 mmol/L的TEAB溶液200 μL，室溫下以轉(zhuǎn)速12 000 r/min離心5 min，棄掉濾液，再重復(fù)3次；

（7）然后樣品∶酶=50∶1的質(zhì)量比在超濾管中加入胰蛋白酶，在37℃水浴條件下恒溫酶解16 h；酶解結(jié)束后，4℃條件下以轉(zhuǎn)速12 000 r/min離心10 min，收集濾液，凍干得到可用于色譜的樣品。

采用超高分辨率質(zhì)譜儀對(duì)分級(jí)得到的樣品進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。

1.3.7 數(shù)據(jù)分析

所有試驗(yàn)均做3次重復(fù)。采用SPSS 21.0進(jìn)行顯著性分析。通過(guò)單因素方差分析來(lái)比較差異性（p<0.05），根據(jù)方差齊性檢驗(yàn)結(jié)果選擇LSD和Dunnet'C法進(jìn)行多重比較。試驗(yàn)的所有數(shù)據(jù)圖均使用Origin 9.1軟件繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 林蛙卵蛋白的溶解性分析

pH值和溫度對(duì)林蛙卵蛋白溶解性的影響見(jiàn)圖1。

圖1 pH值和溫度對(duì)林蛙卵蛋白溶解性的影響

在溫度一定的條件下，林蛙卵蛋白的溶解性在pH值為4時(shí)處達(dá)到最低值，推測(cè)此處為林蛙卵蛋白的等電點(diǎn)附近，凈電荷值約為0。在遠(yuǎn)離pH值4的酸堿環(huán)境下，林蛙卵蛋白的溶解性有所上升，但未達(dá)到80%。pH值條件恒定時(shí)，改變環(huán)境溫度，發(fā)現(xiàn)林蛙卵蛋白在20～80℃范圍內(nèi)隨溫度升高而呈上升趨勢(shì)，80℃條件下氮溶解指數(shù)接近100%。

2.2 林蛙卵蛋白的持水性分析

溫度和pH值對(duì)林蛙卵蛋白持水性的影響見(jiàn)圖2。

圖2 溫度和pH值對(duì)林蛙卵蛋白持水性的影響

在pH值11，反應(yīng)時(shí)間30 min的條件下，林蛙卵蛋白的持水性在30～60℃內(nèi)先上升后下降并趨于平緩。當(dāng)溫度在30～40℃時(shí)，林蛙卵蛋白的持水性隨著溫度的升高而增大，在40℃時(shí)，持水性最佳達(dá)到5.93 g/g；繼續(xù)升高溫度時(shí)，蛋白質(zhì)分子三級(jí)結(jié)構(gòu)可能發(fā)生變化，鎖住水分子的能力減弱，溶解性上升，因此持水性表現(xiàn)為下降[14]。在室溫，反應(yīng)時(shí)間30 min的條件下，卵蛋白持水性在pH值3～11的范圍內(nèi)呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)。當(dāng)pH值在等電點(diǎn)（pH值4.5）附近時(shí)，蛋白質(zhì)分子本身呈現(xiàn)電中性，蛋白質(zhì)分子間相互締合收縮，持水性最低為5.576 g/g。

2.3 林蛙卵蛋白的起泡性分析

pH值對(duì)林蛙卵蛋白起泡性的影響見(jiàn)圖3。

圖3 pH值對(duì)林蛙卵蛋白起泡性的影響

在蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的條件下，林蛙卵蛋白的起泡性在pH值8～11范圍內(nèi)呈增強(qiáng)的趨勢(shì)，原因可能是隨著越來(lái)越接近蛋白的最適溶解pH值，參與攪打成膜的蛋白質(zhì)分子增多，更多的蛋白分子吸附到氣-液界面，而蛋白質(zhì)分子間也更易相互結(jié)合，從而形成更多的泡沫。而蛋白的起泡穩(wěn)定性較差可能與樣品整體溶解度較低有關(guān)[15]。

2.4 林蛙卵蛋白的乳化性分析

蛋白質(zhì)量濃度對(duì)林蛙卵蛋白乳化性的影響見(jiàn)圖4。

圖4 蛋白質(zhì)量濃度對(duì)林蛙卵蛋白乳化性的影響

在室溫、pH值11的條件下，在0.1%～0.5%范圍內(nèi)，林蛙卵蛋白的EAI值隨質(zhì)量濃度升高而減小，與扁桃仁蛋白[16]具有類似的乳化特性。這可能是由于在較低的蛋白濃度下，分子擴(kuò)散系數(shù)較大，有利于新液滴在O/W界面的形成，因此EAI值較高；而在較高的蛋白濃度下，蛋白分子遷移受到阻止，可能降低蛋白吸附的有效性，導(dǎo)致EAI下降。而乳化穩(wěn)定性呈上升趨勢(shì)可能是因?yàn)橐旱纬叽鐪p小，從而使界面蛋白濃度增加，有效地阻止了液滴間的絮凝。

2.5 林蛙卵蛋白的蛋白組分分析

將質(zhì)譜采集到的樣品數(shù)據(jù)用Proteome Discoverer 2.1.0182（Thermo Fisher Scientific，Rockford，IL，USA）進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定分析，相關(guān)數(shù)據(jù)處理參數(shù)設(shè)置如下：

搜庫(kù)引擎：Sequest HT；蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)：（TaxId：10090；網(wǎng)址https://www.uniprot.org/uniprot/?query=mouse&sort=score）；Enzyme：Trypsin；Miss Cleavages：2；Variable Modifications：Oxidation(M)，Acetyl(Protein N-term)，Deamidated(N,Q)；Fixed modifications：Carbamidomethyl(C)；Peptide Mass Tolerance：±10 ppm；Fragment Mass Tolerance：±0.02 Da；Peptide FDR:Less than 1%；Protein Q Value：Less than 1%。

蛋白質(zhì)相對(duì)分子量分布圖見(jiàn)圖5。

圖5 蛋白質(zhì)相對(duì)分子量分布圖

整理數(shù)據(jù)結(jié)果可得，林蛙卵蛋白樣品中共包含425種蛋白/肽段，蛋白主要集中在50～200 kDa的分子量區(qū)間，且大部分蛋白是由2～8個(gè)特異性肽段組成。從鑒定出的425種蛋白中選取PE值小于3的蛋白（PE=1，2，3，4，5，值越小代表鑒定蛋白可靠性越高），利用Uniprot ID在數(shù)據(jù)庫(kù)中查詢其對(duì)應(yīng)的蛋白種類及物種來(lái)源等信息。

蛋白質(zhì)相對(duì)分子量分布圖見(jiàn)圖5，PE值小于3的蛋白種類見(jiàn)表1。

表1 PE值小于3的蛋白種類

（續(xù)表1）

3 結(jié)論

對(duì)林蛙卵中的混合蛋白進(jìn)行堿溶酸沉法提取，得到的蛋白粉通過(guò)生物化學(xué)手段測(cè)定其功能特性，包括溶解性、持水性、起泡性和乳化性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，林蛙卵蛋白的溶解性較差，在等電點(diǎn)pH值4.5時(shí)達(dá)到最低值，在pH值>9時(shí)和溫度60℃以上時(shí)，林蛙卵蛋白的溶解性有顯著增強(qiáng)，NSI值在0.6以上。與之相反，林蛙卵蛋白的持水性良好，在40℃時(shí)達(dá)到最佳值5.93 g/g，在遠(yuǎn)離等電點(diǎn)的pH值下持水性呈上升趨勢(shì)。林蛙卵蛋白的起泡能力一般與其溶解性較差有關(guān)，但乳化能力較好，乳化穩(wěn)定性隨質(zhì)量濃度增加而增加。另外，采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對(duì)蛋白中的蛋白和多肽種類進(jìn)行測(cè)定，得知林蛙卵蛋白中有約425種蛋白/肽段，與美洲牛蛙、林蛙等有較好的同源性，蛋白種類以酶居多，分子量主要集中在50～200 kDa。為林蛙卵蛋白今后在食品加工中應(yīng)用奠定了良好的理論基礎(chǔ)。