辣椒幾丁質(zhì)酶類基因家族的全基因組鑒定和表達(dá)特征分析

劉卓毅 于文菲 蔡文麗 劉子珊 張雨 袁媛 伍炳華 呂美玲

摘 ?要：幾丁質(zhì)酶（chitinase， EC 3.2.1.14）是一種降解幾丁質(zhì)的糖苷酶，在植物應(yīng)對(duì)非生物和生物脅迫中起重要作用。本研究對(duì)辣椒幾丁質(zhì)酶類（Capsicum annuum chitinase-like， CaCTL）基因家族成員進(jìn)行了全基因組注釋、進(jìn)化分析和基因表達(dá)模式分析。從最新的辣椒基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中鑒定出31個(gè)CaCTL成員。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹將這些成員分為GH18和GH19亞家族，并進(jìn)一步分為5個(gè)亞類（Ⅰ～Ⅴ類）。保守基序分析結(jié)果表明，每個(gè)亞類中的成員存在功能相關(guān)性。對(duì)辣椒、矮牽牛以及番茄的CTL基因家族成員同源性分析表明，在矮牽牛和番茄中分別有7個(gè)和11個(gè)辣椒CaCTL的同源基因。通過qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，在正常環(huán)境生長(zhǎng)的辣椒植株中，64.2%的GH18亞家族的CaCTL成員表達(dá)水平很低，有64.7%的GH19亞家族成員在不同組織中存在差異表達(dá)。順式作用元件分析表明，CaCTL成員啟動(dòng)子區(qū)域存在許多激素反應(yīng)以及生物和非生物應(yīng)激相關(guān)元件。當(dāng)植物遭受不同的非生物脅迫時(shí)，qRT-PCR結(jié)果顯示，多數(shù)CaCTL成員表達(dá)上調(diào)。當(dāng)植物遭受高溫干旱條件時(shí)，多個(gè)CaCTL成員的表達(dá)上調(diào)明顯。上述結(jié)果豐富了CTL基因家族進(jìn)化的研究，為探索CaCTL成員的功能提供了數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：辣椒;幾丁質(zhì)酶類基因;非生物脅迫;進(jìn)化分析;表達(dá)分析

中圖分類號(hào)：S641.3 ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Abstract： Chitinase （EC 3.2.1.14） is chitin-degrading glycosidase， which plays important roles in the abiotic and biotic defense of plants. In this study， we conducted whole-genome annotation， molecular evolution， and gene expression analyses on the Capsicum annuum chitinase-like （CaCTL） gene family members. Thirty-one CaCTL genes （CaCTLs） were identified from the latest Capsicum genome database. According to the phylogenetic analysis， the genes were divided into GH18 and GH19 subgroups and further subdivided into five classes （Class I to Class V）. Conserved motif arrangements indicated the functional relevance within each group. Homology analysis of CTL gene family members in pepper， petunia and tomato indicated that there were 7 and 11 homologous genes of CaCTL members in petunia and tomato， respectively. By qRT-PCR analysis， in the normal growing plants， we found that 64.2% GH18 subgroup CaCTLs showed a very low expression level， 64.7% GH19 subgroup CaCTLs were differentially expressed in different tissues. Cis-acting element analysis showed that many hormone responses， as well as biotic and abiotic stress elements were found in the promoters of CaCTLs. Correspondingly， qRT-PCR showed that many CaCTLs had upre gulated expression profiles when the plants suffered different abiotic stress conditions， especially when plants are subjected to high temperature and drought conditions. The results would enrich the evolutionary process of the CTL gene family and provide a foundation for the exploration of the function of CaCTLs.

Keywords： Capsicum annuum L.; chitinase-like gene; abiotic stress; evolution analysis; expression analysis

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.11.008

幾丁質(zhì)酶（chitinase，EC.3.2.1.14）是一種由單基因編碼的降解幾丁質(zhì)的糖苷酶，主要水解幾丁質(zhì)多聚體中的β-1，4糖苷鍵，產(chǎn)生N-乙酰氨基葡萄糖寡聚體。幾丁質(zhì)酶廣泛存在于自然界的各類生物中。細(xì)菌可以通過合成的幾丁質(zhì)酶分解幾丁質(zhì)獲得營(yíng)養(yǎng)維持生存;真菌中的幾丁質(zhì)酶在其細(xì)胞分裂和形態(tài)建成等方面發(fā)揮作用;昆蟲等節(jié)肢動(dòng)物中的幾丁質(zhì)酶在其蛻皮等生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮重要的作用[1];人體內(nèi)的類幾丁質(zhì)酶大多與免疫相關(guān)[2]。植物中的幾丁質(zhì)酶表達(dá)具有組織特異性，參與植物的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)[3]和有性生殖[4]的調(diào)控過程。幾丁質(zhì)酶在植物抵御疾病以及環(huán)境脅迫方面也發(fā)揮重要作用。研究表明，當(dāng)植物受到干旱[5]、低溫[6]、病蟲害[7-8]等非生物和生物脅迫時(shí)，會(huì)引起體內(nèi)幾丁質(zhì)酶含量的增加。

根據(jù)氨基酸序列的差異以及結(jié)構(gòu)域的有無，植物幾丁質(zhì)酶可以分為糖苷水解酶家族18（glycoside hydrolase family 18，GH18）和糖苷水解酶家族19（glycoside hydrolase family 19，GH19）2個(gè)亞家族。GH18亞家族成員廣泛存在于細(xì)菌、真菌、植物、哺乳動(dòng)物、昆蟲和病毒等生物體中，而GH19亞家族成員僅出現(xiàn)在植物以及鏈霉菌屬中[9]。Cao等[10]在番茄中鑒定了43個(gè)SlCTL（Solanum lycopersicum chitinase-like）成員，有11個(gè)屬于GH18亞家族，有32個(gè)屬于GH19亞家族，發(fā)現(xiàn)脅迫處理以及外源激素處理會(huì)引起多數(shù)成員的響應(yīng)。GH19亞族成員具有Chitin-bind domain（CBD）結(jié)構(gòu)。CBD可以與幾丁質(zhì)結(jié)合，加速或加劇植株對(duì)侵入病蟲菌的識(shí)別與反應(yīng)，增強(qiáng)植物體對(duì)環(huán)境脅迫的抵抗能力[11-12]。Ali等[13]從辣椒中鑒定了16個(gè)具有CBD結(jié)構(gòu)的幾丁質(zhì)酶類基因（Capsicum annuum chitinase-like，CaCTL），包括CM334數(shù)據(jù)庫(kù)中的8個(gè)和Zunla-1數(shù)據(jù)庫(kù)中的8個(gè)，發(fā)現(xiàn)這些CaCTL成員參與逆境防御反應(yīng)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，在辣椒的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)以及脅迫響應(yīng)中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。

辣椒是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物，具有極高的生產(chǎn)價(jià)值。在生長(zhǎng)過程中極易遭受炭疽病、灰霉病、軟腐病等各類生物病害和異常溫度、水量、pH、環(huán)境等非生物因素的傷害，影響其產(chǎn)量與品質(zhì)，導(dǎo)致經(jīng)濟(jì)價(jià)值下降。本研究通過序列檢索和比對(duì)，在辣椒CM334數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索到了31個(gè)CaCTL成員（包括Ali等[13]從辣椒CM334數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索到的8個(gè)含有CBD結(jié)構(gòu)的CaCTL成員），分析了CaCTL的進(jìn)化關(guān)系、基因結(jié)構(gòu)、組織特異表達(dá)以及響應(yīng)環(huán)境脅迫的表達(dá)特征等。

1 ?材料與方法

1.1 ?CaCTL基因家族成員的序列鑒定

根據(jù)已發(fā)表文獻(xiàn)[10， 14]，在擬南芥（Arabidopsis thaliana）基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（TAIR，http：//arabidopsis. org/）和茄科基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（Sol genomics network，https：//solgenomics.net/）中分別下載到25條擬南芥和43條番茄的CTL成員的氨基酸序列。將上述序列在茄科基因組網(wǎng)站的Capsicum annuum L. v CM344數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行蛋白BLAST比對(duì)，收集比對(duì)結(jié)果中有“Chitinase”或者“Chitinase-like”注釋的氨基酸序列。為了防止遺漏，同時(shí)在Capsicum annuum L. v CM344蛋白注釋數(shù)據(jù)庫(kù)中以“Chitinase”為關(guān)鍵詞直接檢索，收集檢索結(jié)果中的氨基酸序列。將上述2次獲得的序列結(jié)果進(jìn)行整合，去除冗余序列。使用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的“CD-Search”功能分析非冗余蛋白序列中的功能域。根據(jù)上述分析結(jié)果，確定最終的CaCTL基因家族成員。

1.2 ?CaCTL基因家族成員的序列比對(duì)、進(jìn)化樹構(gòu)建和理化性質(zhì)預(yù)測(cè)

在NCBI中搜索獲得擬南芥（A. thaliana）、人類（Homo sapiens）、歐洲云杉（Picea abies）、玉米（Zea mays）、羅晃子（Tamarindus indica）和釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）6個(gè)物種中鑒定的CTL的氨基酸序列。利用ClustalW軟件進(jìn)行CaCTL成員與上述蛋白的氨基酸多重序列比對(duì)，使用MEGA 7軟件的NJ（Neighbor Joining）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并使用EvolView（https：//www. evolgenius.info）在線美化。通過ExPASY網(wǎng)站（https： //web.expasy.org/protparam/）中的檢索計(jì)算功能獲得CaCTL成員的分子量、等電點(diǎn)信息。利用CELLO在線工具（CELLO v.2.5，http：//cello.life. nctu.edu.tw/）預(yù)測(cè)蛋白的亞細(xì)胞定位。

1.3 ?基因結(jié)構(gòu)、保守基序、順式作用元件和同源性分析

利用MEME 5.0.5在線工具（http：//meme-suite. org/tools/meme）分析CaCTL基因家族成員的保守基序，最大檢索參數(shù)設(shè)置為16，其他數(shù)值默認(rèn)。為了增加可信度，運(yùn)用保守域數(shù)據(jù)庫(kù)（CDD，http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/）進(jìn)一步檢查基因家族成員序列的保守結(jié)構(gòu)域。進(jìn)而利用TBtools工具繪制CaCTL家族成員的基因結(jié)構(gòu)（外顯子-內(nèi)含子）圖。

利用TBtools軟件在茄科基因組網(wǎng)站（Sol genomics network，https：//solgenomics.net/）提取辣椒基因組文件中各家族成員起始密碼子上游2 kb的序列。將獲得的序列提交到PlantCare網(wǎng)站（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）進(jìn)行順勢(shì)作用元件預(yù)測(cè)。對(duì)預(yù)測(cè)的順勢(shì)元件信息進(jìn)行整理篩選后，使用TBtools進(jìn)行可視化作圖。

為分析CTL基因家族在茄科植物中的分布及同源關(guān)系，從茄科基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中下載矮牽牛（ftp：//ftp.solgenomics.net/genomes/Petunia_axillaris）、辣椒（ftp：//ftp.solgenomics.net/genomes/Capsi-cum_annuum/C.annuum_cvCM334）和番茄（ftp：// ftp.solgenomics.net/tomato_genome/Fla.8924）的基因組序列文件和注釋文件（矮牽牛未組裝到染色體水平），使用TBtools軟件進(jìn)行基因同源性分析并對(duì)結(jié)果進(jìn)行可視化。

1.4 ?植物材料與脅迫處理

植物材料辣椒種植于福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院人工氣候室。培養(yǎng)光周期為14 h光照/10 h黑暗，溫度為（25±1）℃，濕度為70%。在生殖生長(zhǎng)期取辣椒的根、莖、葉、花蕾、開放花和漿果，保存于–80 ℃冰箱。

植物材料的脅迫處理試驗(yàn)：首先用75%的乙醇清洗辣椒種子30 s，進(jìn)而用無菌水沖洗3次，然后用2%次氯酸鈉溶液消毒5 min，再次用無菌水沖洗3次。將上述處理過的種子播種于MS液體培養(yǎng)基中，置于在14 h光照/10 h黑暗環(huán)境下震蕩培養(yǎng)，生長(zhǎng)溫度設(shè)置25 ℃。待辣椒幼苗子葉展開后，將幼苗分為3個(gè)處理組，第1組置于（4±1）℃條件下3 h進(jìn)行低溫脅迫處理，第2組置于（42±1）℃下3 h進(jìn)行高溫脅迫處理，第3組置于無塵濾紙上24 h進(jìn)行干旱脅迫處理。以置于正常生長(zhǎng)條件下培養(yǎng)的幼苗作為對(duì)照。收集上述處理后的植物材料，保存于–80 ℃冰箱。

1.5 ?qRT-PCR分析

取辣椒根、莖、葉、花蕾、開放花、漿果和受脅迫處理的幼苗材料各100 mg，使用Trizol試劑盒（全式金生物，北京）提取總RNA。分別取上述組織的1 μg總RNA，使用PrimeScript RT試劑盒（全式金生物，北京）反轉(zhuǎn)錄成一鏈cDNA。

利用NCBI網(wǎng)站的引物設(shè)計(jì)工具（http：// www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/）設(shè)計(jì)辣椒CaCTL基因家族成員的qRT-PCR引物。根據(jù)文獻(xiàn)[15]，選擇CaUBI為內(nèi)參基因（F：5-TGTCC ATCTGCTCTCTGTTG-3，R：5-CACCCCAAGCA CAATAAGAC-3）。用TransStart Top Green qPCR SuperMix試劑盒（全式金生物，北京），在CFX96實(shí)時(shí)系統(tǒng)（Bio-Rad，美國(guó)）實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行各基因表達(dá)水平的檢測(cè)。每一反應(yīng)總體積為15 μL。qRT-PCR反應(yīng)條件如下：94 ℃反應(yīng)30 s后，進(jìn)行42個(gè)循環(huán)。每個(gè)循環(huán)為94 ℃反應(yīng)5 s，60 ℃反應(yīng)15 s和72 ℃反應(yīng)10 s。試驗(yàn)設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)，每次生物學(xué)重復(fù)開展3次技術(shù)重復(fù)，采用2-CT方法計(jì)算相對(duì)表達(dá)水平。隨后利用TBtools軟件生成熱圖，利用GraphPad Prism 8軟件生成柱狀圖。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?CaCTL基因家族成員的鑒定與系統(tǒng)發(fā)育分析

通過序列比對(duì)和功能域分析，發(fā)現(xiàn)辣椒基因組中存在31個(gè)被注釋的有水解幾丁質(zhì)功能或具有幾丁質(zhì)酶類功能的CaCTL成員（表1）。序列分析表明，CaCTL成員氨基酸的長(zhǎng)度范圍為55 AA（CA10g09860）～436 AA（CA05g11510），蛋白質(zhì)分子量為6.342～49.598 kDa，等電點(diǎn)（pI）為4.64～9.24。通過亞細(xì)胞定位分析，發(fā)現(xiàn)CaCTL成員大多定位于胞外基質(zhì)中，少數(shù)定位在溶酶體、線粒體或質(zhì)膜上。

系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明（圖1），CaCTL基因家族成員分別有14個(gè)（45.1%）和17個(gè)（54.9%）屬于GH18和GH19亞家族。本研究將CaCTL家族成員進(jìn)一步分為5類。其中Ⅲ類和Ⅴ類屬于GH18亞家族，分別包含9個(gè)和5個(gè)CaCTL成員，都包含有GH18結(jié)構(gòu)域;Ⅰ類、Ⅱ類和Ⅳ類屬于GH19亞家族，分別包含2個(gè)、12個(gè)和3個(gè)CaCTL成員，都包含有GH19結(jié)構(gòu)域。

2.2 ?CaCTL基因家族成員的基因結(jié)構(gòu)、保守結(jié)構(gòu)域以及順式元件分析

外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示（圖2），GH18和GH19亞家族間基因的結(jié)構(gòu)和內(nèi)含子的數(shù)目存在明顯差異。GH18亞家族成員多數(shù)（85.7%）不含有內(nèi)含子，而GH19亞家族成員多數(shù)（58.9%）含有內(nèi)含子。在31個(gè)CaCTL成員中有5個(gè)具有較長(zhǎng)的內(nèi)含子結(jié)構(gòu)，包括CA12g20880、CA00g51890、CA08g10220、CA5g11510、CA04g08220;有19個(gè)成員（61.2%）不具備內(nèi)含子，有3個(gè)成員（9.7%）具有2個(gè)內(nèi)含子，1個(gè)成員（3.2%）具有3個(gè)內(nèi)含子，1個(gè)成員CA05g11510（3.2%）具有7個(gè)內(nèi)含子。

通過NCBI網(wǎng)站中的Pfam工具，檢索分析16個(gè)預(yù)測(cè)可能與GH18或者GH19相關(guān)的氨基酸保守基序。分析結(jié)果表明（圖3），同一亞家族的CaCTL成員間存在功能的相關(guān)性。在GH19亞家族中，Ⅰ類和Ⅳ類成員都含有Glyco_hydro_19 motif，Ⅱ類中只有3個(gè)成員含有Glyco_hydro_19 motif，其余成員均含有Chitin_bind motif （除CA08g10220），并且Chitin_bind motif僅分布于GH19亞家族中。在包含Ⅲ類和Ⅴ類的GH18亞家族中，除了CA05g11510沒有被檢索到motif外，其他的CaCTL成員廣泛分布有Glyco_hydro_18 motif。但是利用NCBI的CD-Search工具進(jìn)行檢索時(shí)，發(fā)現(xiàn)CA05g11510具有GH18結(jié)構(gòu)域。

啟動(dòng)子區(qū)域往往存在許多防御相關(guān)的響應(yīng)元件。對(duì)起始密碼子上游2 kb區(qū)域的序列進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)CaCTL成員啟動(dòng)子區(qū)域含有的順式元件涉及響應(yīng)植物激素和非生物脅迫等多個(gè)方面（圖4）。主要包括5種激素類響應(yīng)元件，分別為茉莉酸響應(yīng)元件（CGTCA/TGACG-motif）、赤霉素響應(yīng)元件（TATC/P/GARE-motif）、脫落酸響應(yīng)元件（ABRE）、水楊酸響應(yīng)元件（TC A-element）和生長(zhǎng)素響應(yīng)元件（TGA-element/AuxRR-core）。CGTCA/TGACG-motif存在于22個(gè)CaCTL成員的啟動(dòng)子區(qū)域，其中CA07g02470的啟動(dòng)子區(qū)域中最多，含有12個(gè);TATC/P/GARE-motif存在于15個(gè)CaCTL成員的啟動(dòng)子區(qū)域，其中CA01g20040的啟動(dòng)子區(qū)域中最多，含有4個(gè);ABRE存在于23個(gè)CaCTL成員的啟動(dòng)子區(qū)域，CA04g08220和CA07g02460的啟動(dòng)子區(qū)域中最多，分別含有5個(gè);TCA-element存在于10個(gè)CaCTL成員的啟動(dòng)子區(qū)域，除了CA08g07860和CA11g13780的啟動(dòng)子區(qū)域分別含有3個(gè)，其余基因分別含有1個(gè);TGA-element/AuxRR-core存在于14個(gè)CaCTL成員的啟動(dòng)子區(qū)域，CA08g10220的啟動(dòng)子區(qū)域中最多，含有3個(gè)。干旱誘導(dǎo)響應(yīng)元件（MBS）、低溫響應(yīng)元件（LTR）、防御與脅迫響應(yīng)元件（TC-rich repeats）以及晝夜節(jié)律響應(yīng)元件（circadian）也分布在該家族的許多成員的啟動(dòng)子區(qū)域。MBS存在于15個(gè)CaCTL成員的啟動(dòng)子區(qū)域，CA03g30180的啟動(dòng)子區(qū)域中存在5個(gè);LTR存在于9個(gè)CaCTL成員的啟動(dòng)子區(qū)域，除了CA11g13780的啟動(dòng)子區(qū)域中有2個(gè)以外，其他8個(gè)基因中都只含有1個(gè)該元件;TC-rich repeats存在于12個(gè)CaCTL成員的啟動(dòng)子區(qū)域，CA03g02990、CA03g30180、CA12g08860的啟動(dòng)子區(qū)域中數(shù)量最多，各含有3個(gè)。其他順式元件，比如創(chuàng)傷響應(yīng)元件（WUN- motif）僅存在與CA00g97030的啟動(dòng)子區(qū)域，參與玉米蛋白代謝調(diào)控的元件（O2-site）在CA08g15980的啟動(dòng)子區(qū)域中最多，含有3個(gè)。MYBHv1結(jié)合位點(diǎn)（CCAAT-box）以及AT-rich DNA結(jié)合蛋白（ATBP-1）的結(jié)合位點(diǎn)（AT-rich element）分別存在于9個(gè)和5個(gè)CaCTL成員的啟動(dòng)子區(qū)域中。

2.3 ?CaCTL基因家族成員染色體定位以及基因復(fù)制和進(jìn)化分析

染色體定位分析結(jié)果表明（圖5），在辣椒的12條染色體中，除第2號(hào)染色體外，其他染色體上均有CaCTL基因的分布。有29個(gè)CaCTL基因定位在11條染色體上，2個(gè)CaCTL基因分別定位在2條scaffold上（CA00g51890定位在scaffold5575上，CA00g97030定位在scaffold1231上）。第3號(hào)和第7號(hào)染色體上分布最多，各含有6個(gè)CaCTL成員，其次是第8號(hào)染色體，含有4個(gè)CaCTL成員。在第7號(hào)、第8號(hào)和第11號(hào)染色體上分別含有1個(gè)串聯(lián)重復(fù)基因?qū)Γ–A07g02440和CA07g02460、CA08g07860和CA08g07870、CA11g13780和CA11g13790）。

為了分析不同物種中CTL的進(jìn)化關(guān)系，本研究對(duì)茄科植物辣椒、矮牽牛和番茄的CTL基因家族成員的同源性進(jìn)行了分析。結(jié)果表明（圖6），矮牽牛和番茄基因組中有多個(gè)CTLs與辣椒的CaCTL成員存在同源性。辣椒基因組中分別有7個(gè)CaCTLs（CA08g07860、CA06g08030、CA07g 02290、CA07g02440、CA11g13780、CA12g02880、CA03g02990）和矮牽牛CTL成員存在同源性;有11個(gè)CaCTLs（CA08g07860、CA04g14160、CA05g11 510、CA06g08030、CA11g13780、CA12g20880、CA03g02990、CA03g31390、CA03g30170、CA10g09 860和CA10g09850）和番茄CTL成員存在同源性。

圖中灰色連線代表2個(gè)基因組具有同源關(guān)系的成員，藍(lán)色連線表示2個(gè)基因組中具有同源關(guān)系的CTL基因家族成員。

The gray lines in the figure represent the members of the two genomes that have a homologous relationship， and the blue. lines indicate the members of the CTL gene family that have a homologous relationship in the two genomes.

2.4 ?CaCTL基因家族成員的表達(dá)特征

通過qRT-PCR試驗(yàn)檢測(cè)CaCTL成員在辣椒6個(gè)組織（根、莖、葉、花蕾、開放花和漿果）中的表達(dá)特征。結(jié)果表明，GH18和GH19兩個(gè)亞家族CaCTL成員之間的表達(dá)差異非常明顯（圖7）。在GH19亞家族的17個(gè)CaCTL成員中，有6個(gè)基因（CA06g08030、CA00g97030、CA10g09850、CA03g30180、CA03g31390和CA03g30190）在所有組織中低表達(dá)或者不表達(dá)，而其他11個(gè)基因（64.7%）在不同組織中呈現(xiàn)差異表達(dá)。CA10g 09860、CA07g09480、CA00g51890和CA03g02990分別在根、葉片、漿果和花苞優(yōu)勢(shì)表達(dá)。在GH18亞家族的CaCTL成員中，有9個(gè)成員（64.2%）呈現(xiàn)低表達(dá)態(tài)勢(shì)，優(yōu)勢(shì)表達(dá)基因主要集中在根和花組織中。綜上所述，有超過半數(shù)的CaCTL成員在正常生長(zhǎng)的植株中顯示出較低的表達(dá)水平。

通過qRT-PCR分析，檢測(cè)CaCTL基因家族成員在受低溫（4 ℃）、高溫（42 ℃）以及干旱環(huán)境脅迫處理的幼苗中的表達(dá)特征。結(jié)果表明，與正常生長(zhǎng)的幼苗相比，在受低溫脅迫的幼苗中，CA03g30190、CA03g30170、CA07g09480、CA07g02470、CA12g08860等5個(gè)成員相對(duì)表達(dá)量顯著提高，而CA12g20880、CA00g97030、CA03g31430、CA08g07860、CA11g13780和CA01g 20040等6個(gè)成員的表達(dá)明顯受到抑制（圖8）。其中CA07g02470的相對(duì)表達(dá)水平最多，被上調(diào)6倍;CA12g20880的相對(duì)表達(dá)水平最少，被下調(diào)3.3倍。在受42 ℃高溫脅迫的幼苗中，相對(duì)表達(dá)水平被上調(diào)成員數(shù)量少但幅度大，被下調(diào)的成員數(shù)量多但幅度小。其中CA12g20880、CA11g13790、CA03g 31390、CA03g30190和CA12g08860等5個(gè)成員的相對(duì)表達(dá)量顯著升高，與對(duì)照中的表達(dá)水平存在極顯著差異，并以CA12g20880的相對(duì)表達(dá)水平最高，被上調(diào)21.1倍，而CA00g97030、CA10g 09850、CA10g09860、CA03g31430、CA05g 11510、CA08g15980、CA01g20040、CA07g02470、CA04g 14160、CA11g13780、CA03g30170和CA07g02460共計(jì)12個(gè)成員的表達(dá)水平明顯下調(diào)。在受干旱脅迫的幼苗中，絕大多數(shù)的CaCTL成員呈現(xiàn)相對(duì)表達(dá)量被上調(diào)，CA06g08030、CA10g09860、CA03g 30180、CA03g31390、CA07g 09480、CA08g10220、CA01g15470、CA11g13790、CA07g02290、CA04g 08220、CA07g02470、CA12g 08860、CA07g02440、CA09g07340和CA07g02460共計(jì)15個(gè)成員響應(yīng)強(qiáng)烈，尤其是CA07g02470的相對(duì)表達(dá)水平比對(duì)照幼苗植株高出114.7倍。僅有CA03g02990、CA05g11510、CA08g07870、CA08g07860、CA01g 20040和CA11g137806等6個(gè)成員顯示出明顯的下調(diào)。綜合來看，多數(shù)CaCTL成員的相對(duì)表達(dá)量在2個(gè)或者2個(gè)以上的逆境環(huán)境中都有上調(diào)。其中CA03g31390、CA11g13790和CA12g08860在3個(gè)脅迫處理中響應(yīng)強(qiáng)烈，CA03g30190在低溫和高溫脅迫條件下均顯著上調(diào)，CA08g10220、CA07g 09480和CA07g02470在低溫以及干旱兩種環(huán)境中上調(diào)。CA03g31430、CA05g11510、CA08g07870、CA08g07860、CA01g20040和CA11g13780在3種處理中相對(duì)表達(dá)量都顯著低于對(duì)照中的表達(dá)水平。

CK代表正常環(huán)境條件，4 ℃、42 ℃和干旱為脅迫處理?xiàng)l件。橫坐標(biāo)大于0為上調(diào)表達(dá)，小于0為下調(diào)表達(dá)。灰色字體的基因?yàn)镚H19亞家族成員，黑色字體的基因?yàn)镚H18亞家族成員。

CK replicates the normal environmental conditions; 4 ℃， 42 ℃ and drought replicate the stress treatment conditions. The abscissa data greater than 0 replicate the upregulated expression level， less than 0 replicate the downregulated expression level. Genes with gray font color are members of the GH19 subfamily， while genes with black font color are members of the GH18 subfamily.

3 ?討論

幾丁質(zhì)酶在植物的生長(zhǎng)發(fā)育中扮演重要角色。在水稻中，幾丁質(zhì)酶類基因OsCLP的T-DNA插入突變體（osclp）表現(xiàn)出根和莖生長(zhǎng)的顯著阻滯[16]。在擬南芥中，幾丁質(zhì)酶類基因AtCTL1和AtCTL2被敲除時(shí)，ctl1單突變體和ctl1ctl2雙突變體均表現(xiàn)出植株變矮，開花推遲和角果變小的表型[17]。在矮牽牛中，幾乎所有的花發(fā)育相關(guān)幾丁質(zhì)酶活性都位于柱頭上，并且在花藥開裂后活性增加約5倍[18]，說明植物幾丁質(zhì)酶在高等植物的有性生殖特別是授粉授精過程中也發(fā)揮功能。在本研究中，CaCTL成員在辣椒的根、莖、葉、花、漿果中的表達(dá)特征存在明顯差異，31個(gè)被鑒定的CaCTL成員可以區(qū)分為優(yōu)勢(shì)表達(dá)、微量表達(dá)和不表達(dá)3種模式。優(yōu)勢(shì)表達(dá)的成員在不同的組織中的表達(dá)水平存在差異，在同一器官的不同階段也呈現(xiàn)顯著變化。在花器官中，CA03g02990、CA12g20880、CA04g14160、CA00g51890、CA03g 31430、CA05g11510和CA01g20040在花苞到開放花的發(fā)育階段相對(duì)表達(dá)均呈下調(diào)模式，而CA07g13240、CA10g09860、CA07g09480、CA08g 10220、CA04g08220、CA07g02460和CA07g02440表現(xiàn)出上調(diào)表達(dá)，推測(cè)它們可能在花器官的發(fā)育中發(fā)揮作用。另外，CA03g02990、CA07g13240、CA00g51890、CA10g09860、CA07g09480、CA08g 10220和CA04g08220在營(yíng)養(yǎng)器官（根、莖、葉）中優(yōu)勢(shì)表達(dá)，推測(cè)這些CaCTL成員或許在辣椒植株?duì)I養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)期發(fā)揮作用。這些推測(cè)還需要進(jìn)一步的試驗(yàn)驗(yàn)證。

植物作為一種固著生物，其生長(zhǎng)發(fā)育過程深受立地環(huán)境的影響，嚴(yán)重時(shí)甚至導(dǎo)致死亡，比如異溫[19-21]、干旱[22]、水淹、鹽堿危害[23-24]等非生物脅迫，以及由灰霉菌[25]、甜菜夜蛾[26]等造成的生物脅迫。為了應(yīng)對(duì)脅迫傷害，植物會(huì)合成一系列“病程相關(guān)蛋白”（pathogenesis-related proteins，PRs）度過危機(jī)。幾丁質(zhì)酶也屬于一類PRs，在增強(qiáng)植物抗性脅迫方面的作用被日漸關(guān)注。本研究發(fā)現(xiàn)，CaCTL基因家族成員對(duì)非生物脅迫環(huán)境也產(chǎn)生了廣泛的響應(yīng)。比如CA07g02470在低溫和干旱脅迫環(huán)境中的上調(diào)倍數(shù)顯著，CA12g20880對(duì)高溫脅迫響應(yīng)強(qiáng)烈，可能在相應(yīng)脅迫環(huán)境的應(yīng)對(duì)中發(fā)揮重要作用。部分成員與多種脅迫響應(yīng)相關(guān)，如CA03g31390、CA11g13790、CA12g08860、CA03g30190、CA08g10220、CA07g09480和CA07g 02470。這種現(xiàn)象在楊樹[27]和大豆[28]的CTL家族成員研究中也有出現(xiàn)，即同一個(gè)家族成員可以參與到不同的逆境響應(yīng)機(jī)制中。本研究發(fā)現(xiàn)脅迫環(huán)境中響應(yīng)較為敏感的CaCTL成員都具備有相應(yīng)的順式元件，比如CA03g31390含有1個(gè)低溫響應(yīng)元件、CA11g13790含有1個(gè)干旱響應(yīng)元件、CA12g08860含有1個(gè)低溫響應(yīng)元件以及3個(gè)防御應(yīng)激元件、CA03g30190還有1個(gè)防御應(yīng)激元件、CA08g10220含有1個(gè)干旱響應(yīng)元件、CA07g09480含有1個(gè)干旱響應(yīng)元件以及1個(gè)防御應(yīng)激元件?；蛟S還有一些脅迫響應(yīng)元件不在檢索的2 kb長(zhǎng)度之內(nèi)，但這些元件基本都與CaCTL成員在非脅迫環(huán)境中的響應(yīng)規(guī)律相一致。已有研究報(bào)道表明，茉莉酸（JA）、水楊酸（SA）和脫落酸（ABA）等植物激素和植物信號(hào)物質(zhì)都參與了植物體內(nèi)各種應(yīng)激信號(hào)通路的運(yùn)行[29-32]。辣椒中含有CBD結(jié)構(gòu)的幾丁質(zhì)酶對(duì)外源激素會(huì)產(chǎn)生響應(yīng)[13]，番茄CTL基因家族成員也已經(jīng)被證實(shí)積極參與到植物激素和植物信號(hào)的反應(yīng)過程[10]。本研究中順式元件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，許多CaCTL成員的啟動(dòng)子區(qū)域也包含有多個(gè)激素響應(yīng)元件，說明這些成員可能在植物激素響應(yīng)過程中發(fā)揮作用。但具體的觸發(fā)過程以及響應(yīng)模式還有待進(jìn)一步的研究探討。該研究結(jié)果豐富了CaCTL基因家族進(jìn)化的研究，為后期CaCTL基因家族成員的功能鑒定和辣椒的抗性育種提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

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責(zé)任編輯：黃東杰