引起肉種雞產(chǎn)蛋下降的新型坦布蘇病毒的分離和鑒定

劉 東，劉紅祥，劉秋云，任衍倍，李 彬，劉建濤，王群義，劉 平，宋姍姍，杜元釗

(青島易邦生物工程有限公司 動(dòng)物基因工程疫苗國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東 青島 266032)

2010年4月以來，在我國浙江、福建、上海、山東等養(yǎng)鴨集中區(qū)，陸續(xù)暴發(fā)了一種以蛋鴨、種鴨采食、產(chǎn)蛋大幅度下降，肉鴨、成鴨、肉鵝等共濟(jì)失調(diào)、神經(jīng)癥狀為主要特征的疾病，經(jīng)鑒定病原為坦布蘇病毒，該病毒傳播迅速、蔓延范圍廣，給我國養(yǎng)鴨業(yè)帶來巨大損失[1-4]。隨著疫病的發(fā)展，坦布蘇病毒易感宿主逐漸擴(kuò)大，不僅可以感染水禽鴨、鵝，也可以感染雞、鴿子、麻雀等，研究表明，蛋雞也可感染坦布蘇病毒并引起產(chǎn)蛋下降。陳仕龍等[5]從產(chǎn)蛋下降的蛋雞群分離到坦布蘇病毒，動(dòng)物回歸試驗(yàn)也表明坦布蘇病毒可以導(dǎo)致雞群產(chǎn)蛋下降。張敬峰等[6]也從臨床表現(xiàn)產(chǎn)蛋下降的蛋雞群鑒定到1株坦布蘇病毒。

近年來坦布蘇病毒感染家禽現(xiàn)象逐漸增多且有蔓延趨勢，本研究首次從我國產(chǎn)蛋下降的肉種雞群中分離到新型坦布蘇病毒，并通過動(dòng)物回歸試驗(yàn)證明新型坦布蘇病毒可以引起肉種雞群產(chǎn)蛋下降。因此開展新型坦布蘇病毒的流行病學(xué)調(diào)查對該病的防控和公共衛(wèi)生安全具有重要意義。同時(shí)本研究通過對新型坦布蘇病毒流行病學(xué)調(diào)查，在病毒特性、遺傳譜系、血清學(xué)感染規(guī)律、動(dòng)物攻毒試驗(yàn)方面取得初步進(jìn)展，為新型坦布蘇病毒的疫苗研究和疫病防控等提供大量數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 樣本來源病料、血清來自廣東、江蘇、湖北、廣西、福建等地出現(xiàn)產(chǎn)蛋下降的肉種雞場。

1.2 試劑與耗材PCR試劑和Marker為TaKaRa產(chǎn)品；RT-PCR試劑為湖南艾克瑞產(chǎn)品；50 X TAE buffer為上海生工產(chǎn)品；Goldview核酸染料為labest產(chǎn)品；瓊脂糖為康為世紀(jì)產(chǎn)品；核酸提取試劑盒為杭州博日產(chǎn)品；ELISA試劑盒來自上海獸醫(yī)研究所、美國(IDEXX)愛德士公司等。

1.3 儀器與設(shè)備超凈工作臺(北京東聯(lián)哈爾儀器)；離心機(jī)(eppendorf)；核酸提取純化儀(杭州博日)；電泳儀(北京六一)；凝膠成像儀(上海培清科技)；移液器(eppendorf)；生化培養(yǎng)箱(上海精宏)。

1.4 細(xì)菌分離無菌采集發(fā)病場雞只肝臟、卵巢、輸卵管等組織樣本接種胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基(TSA+血清)，置于37℃溫箱中培養(yǎng)。

1.5 分子生物學(xué)

1.5.1PCR和RT-PCR檢測 采集臨床出現(xiàn)降蛋雞只的氣管、肝臟、脾臟、腎臟等組織，剪碎、研磨、凍融、離心處理，采用全自動(dòng)核酸提取試劑盒進(jìn)行組織DNA和RNA的提取，分別設(shè)計(jì)雞傳染性支氣管炎病毒、新城疫病毒、減蛋綜合征病毒、滑液囊支原體、禽流感病毒、坦布蘇病毒的引物進(jìn)行PCR和RT-PCR檢測，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列與擴(kuò)增片段大小以及目的基因見表1。

表1 引物序列和擴(kuò)增目的片段大小以及目的基因

PCR反應(yīng)條件為：98℃預(yù)變性2 min；98℃變性10 s，60℃退火15 s，72℃延伸1.5 min，共32個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。

RT-PCR反應(yīng)條件為：50℃反轉(zhuǎn)錄30 min，95℃預(yù)變性3 min；95℃變性30 s，55℃退火35 s，72℃延伸1.5 min，共32個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用凝膠成像儀觀察和記錄結(jié)果。

1.5.2坦布蘇病毒E基因克隆測序分析 將1.5.1檢測疫病中的陽性目的條帶進(jìn)行膠回收，回收產(chǎn)物與pMD18-T載體進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，在37℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)過夜；挑取單個(gè)白色菌落，37℃搖床培養(yǎng)8 h以上，經(jīng)菌液PCR鑒定的陽性菌液，送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序，將測序結(jié)果進(jìn)行比對分析，序列比對采用MegAlign程序,進(jìn)化樹采用鄰接法(MEGA6.0軟件)構(gòu)建。

1.6 病毒分離

1.6.1SPF雞胚分離 將送檢的組織樣本剪碎、研磨、凍融、離心(12 000 r/min，10 min)后取上清，經(jīng)0.22 μm的濾器過濾后，通過絨毛尿囊膜接種9日齡SPF雞胚，每個(gè)雞胚0.2 mL，每日照胚，若雞胚死亡，觀察胚體變化，收獲胚體和尿囊液經(jīng)處理后繼續(xù)傳代，連傳3代；若雞胚未死亡，則在第6天采集胚體、尿囊液等經(jīng)處理后繼續(xù)傳代，連傳3代。對收取的尿囊液和胚體采用PCR和RT-PCR方法檢測雞傳染性支氣管炎病毒、新城疫病毒、減蛋綜合征病毒、滑液囊支原體、禽流感(H9N2)、坦布蘇病毒。

1.6.2細(xì)胞分離 采用CEF、DF-1細(xì)胞同時(shí)進(jìn)行細(xì)胞分離，當(dāng)細(xì)胞長到80%～90%后按2%接種1.6.1中經(jīng)0.22 μm的濾器過濾后的上清，每日觀察細(xì)胞病變，當(dāng)細(xì)胞病變達(dá)80%以上時(shí)收獲，進(jìn)行傳代，連傳3代；若無細(xì)胞病變則每3 d傳代1次，連傳3代。收取F3代細(xì)胞培養(yǎng)上清液采用PCR和RT-PCR方法檢測雞傳染性支氣管炎病毒、新城疫病毒、減蛋綜合征病毒、滑液囊支原體、禽流感(H9N2)、坦布蘇病毒。

1.7 血清學(xué)檢測

1.7.1ELISA檢測 采集不同地域的發(fā)病雞群、假定健康群、育成階段等肉種雞群的血清，采用坦布蘇病毒抗體檢測試劑盒進(jìn)行檢測。將待檢血清進(jìn)行10倍稀釋，取抗原包被板，將稀釋后的血清、陰性對照和陽性對照，按照每孔0.1 mL加入到抗原包被板中，置于37℃溫箱中孵育1 h；棄去孔中液體，加入洗滌液0.3 mL，作用3 min，棄去洗滌液，重復(fù)3次；每孔加入單克隆抗體0.1 mL，37℃孵育1 h；棄去孔中液體，加入洗滌液0.3 mL，作用3 min，棄去洗滌液，重復(fù)3次；每孔加入TMB底物溶液0.1 mL，輕搖2 s，室溫下避光顯色10 min；每孔加入終止液0.05 mL，置酶標(biāo)儀上測定各孔D值。

1.7.2HI檢測 采集不同地域的不同發(fā)病階段雞群、假定健康群、育成階段等肉種雞群的血清按照獸藥典(2015)進(jìn)行ND、H9、H5 Re-11、H5 Re-12、H7 Re-3抗體的檢測，測定發(fā)病前后HI抗體變化情況。

1.8 動(dòng)物回歸試驗(yàn)將SPF產(chǎn)蛋雞采用口服、肌注、點(diǎn)眼的方式感染1.7.1中分離到的F3代坦布蘇病毒,每種方式0.4 mL，接種20只;同種方式采用生理鹽水設(shè)置對照組，在無菌隔離器中飼養(yǎng),每天統(tǒng)計(jì)產(chǎn)蛋及蛋質(zhì)量情況，連續(xù)觀察20 d。攻毒組和對照組于攻毒后第7和14天各取2只剖殺,觀察剖檢病變并采集病料采用RT-PCR方法進(jìn)行坦布蘇病毒的檢測，同時(shí)在第3，7，14天采集喉頭和泄殖腔棉拭子采用RT-PCR方法進(jìn)行坦布蘇病毒的檢測。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌學(xué)檢測結(jié)果將不同地域送檢的組織樣本(肝臟、卵巢、輸卵管)等病料接種胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基(TSA+血清)，培養(yǎng)48 h，無明顯細(xì)菌生長(表2)。

表2 送檢樣本細(xì)菌分離結(jié)果

2.2 分子生物學(xué)結(jié)果

2.2.1PCR和RT-PCR結(jié)果 對臨床出現(xiàn)疑似降蛋的肉種雞群，無菌采集樣本(氣管、肝臟、脾臟、腎臟)利用PCR和RT-PCR方法進(jìn)行雞傳染性支氣管炎病毒、新城疫病毒、減蛋綜合征病毒、滑液囊支原體、禽流感(H9N2)、坦布蘇病毒的檢測，結(jié)果從廣東、廣西、福建、湖北、江蘇等地疑似發(fā)病的肉種雞組織樣本中均檢測到坦布蘇病毒，電泳結(jié)果見圖1，陽性率為20%～41.6%(表3)。對以上地區(qū)育成階段雞群采集樣本檢測坦布蘇病毒均為陰性(表4)，以上發(fā)病群樣本與育成階段未發(fā)病群樣本均未檢測到雞傳染性支氣管炎病毒、新城疫病毒、減蛋綜合征病毒、滑液囊支原體、禽流感(H9N2)等病毒。

表3 發(fā)病雞群坦布蘇病毒檢測果 份

表4 育成階段雞群坦布蘇病毒檢測結(jié)果 份

2.2.2坦布蘇病毒E基因克隆測序分析結(jié)果 將坦布蘇病毒陽性PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆測序，與參考毒株(表5)進(jìn)行比對分析。E基因核苷酸同源性比對結(jié)果表明，本研究從肉種雞上分離到的坦布蘇病毒的同源性彼此為97.6%～99.3%，與泰國毒株的同源性最高，為97.0%～98.8%，與中國Ⅰ分支參考毒株的同源性為86.2%～88.3%，與中國Ⅱ分支參考毒株的同源性為86.9%～89.3%，與馬來西亞Ⅰ分支參考毒株的同源性為87.4%～88.9%，與馬來西亞Ⅱ分支參考毒株的同源性為86.1%～88.7%(表6)。進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，本研究分離到的坦布蘇病毒單獨(dú)處于一個(gè)亞分支，并與泰國參考毒株處于一個(gè)大分支，與馬來西亞和中國參考毒株分別屬于不同的分支(圖2)。

圖2 坦布蘇病毒E基因核苷酸進(jìn)化樹分析

表5 本研究所用坦布蘇病毒參考序列

表6 本研究分離的坦布蘇病毒與參考毒株核苷酸同源性 %

M.DL2000的Marker;6,11,12,16,21,24,27,29,33,36,40,42,44,45,50,54,62,64,68,69,73,77號.樣本為陽性;80號.為陰性對照;81號.為陽性對照。圖1 坦布蘇病毒電泳結(jié)果

2.3 病毒分離結(jié)果

2.3.1SPF雞胚分離結(jié)果 送檢組織接種9日齡SPF雞胚，F(xiàn)1代部分雞胚在接種5 d后出現(xiàn)死亡，隨著培養(yǎng)代次的增加，雞胚死亡時(shí)間逐步提前(表7)。觀察胚體變化，死亡雞胚胚體發(fā)育小、充血，爪子干癟僵挺，絨毛尿囊膜發(fā)白增厚(圖3)。分別收取胚體和尿囊液，采用PCR和RT-PCR方法檢測雞傳染性支氣管炎病毒、新城疫病毒、減蛋綜合征病毒、滑液囊支原體、禽流感(H9N2)、坦布蘇病毒，結(jié)果F1-F3代中胚體和尿囊液均檢測到坦布蘇病毒陽性，未檢測到雞傳染性支氣管炎病毒、新城疫病毒、減蛋綜合征病毒、滑液囊支原體、禽流感(H9N2)。

圖3 胚體病變(左)及絨毛尿囊膜病變(右)

表7 SPF雞胚病毒分離結(jié)果

2.3.2細(xì)胞分離 將送檢樣本接種DF-1細(xì)胞，結(jié)果DF-1細(xì)胞在接種96 h后出現(xiàn)病變，細(xì)胞聚堆，圓縮，死細(xì)胞增多，隨著病變增多，細(xì)胞裂解(圖4)。對F3代細(xì)胞培養(yǎng)液采用PCR和RT-PCR方法檢測傳染性支氣管炎病毒、新城疫病毒、減蛋綜合征病毒、滑液囊支原體、禽流感(H9N2)、坦布蘇病毒，結(jié)果除檢測到坦布蘇病毒陽性外，其他均為陰性。

圖4 培養(yǎng)96 h后(左)及120 h后(右)的細(xì)胞病變

2.4 血清學(xué)結(jié)果

2.4.1ELISA檢測結(jié)果 采用ELISA檢測方法，對疑似降蛋雞群采集血清進(jìn)行坦布蘇病毒抗體的檢測，結(jié)果顯示坦布蘇病毒抗體陽性率為6.67%～32.6%(表8)；同時(shí)采集以上地區(qū)場內(nèi)假定健康群與育成階段雞群血清，坦布蘇病毒抗體顯示陽性率明顯偏低，為0～6.6%(表9，10)。

表8 發(fā)病肉種雞群坦布蘇病毒抗體結(jié)果 份

表9 假定健康群肉種雞群坦布蘇病毒抗體結(jié)果 份

表10 育成階段肉種雞群坦布蘇病毒抗體結(jié)果 份

2.4.2HI結(jié)果 采用HI檢測方法，對送檢的不同時(shí)間段發(fā)病群血清樣本進(jìn)行檢測，結(jié)果ND、H9、H5 Re-11、H5 Re-12、H7 Re-3等抗體無顯著變化，無異常。

2.5 動(dòng)物回歸試驗(yàn)結(jié)果將分離到的坦布蘇病毒感染SPF產(chǎn)蛋雞,結(jié)果攻毒組在攻毒后第1～8天的產(chǎn)蛋量明顯低于對照組，并于攻毒后第9～20天停止產(chǎn)蛋，對照組產(chǎn)蛋正常(圖5)。

圖5 試驗(yàn)期間攻毒組和對照組產(chǎn)蛋情況

與第7和14天每組各解剖2只，顯示攻毒組和對照組均無明顯病理病變，分別采集攻毒組雞只各組織進(jìn)行帶毒分析，結(jié)果顯示攻毒后7 d除了氣管與肺臟檢測陰性外其他組織均檢測到坦布蘇病毒，攻毒后14 d各組織均未檢測到坦布蘇病毒(表11)。

表11 各組織帶毒情況

在攻毒后第3,7,14天分別采集喉頭和泄殖腔棉拭子進(jìn)行坦布蘇病毒的檢測，結(jié)果顯示第3天喉頭與泄殖腔檢測坦布蘇病毒均為陰性，第7天喉頭和泄殖腔多數(shù)檢測到坦布蘇病毒陽性(陽性率80%～100%)，第14天喉頭和泄殖腔拭子均為陰性(表12)，與組織中坦布蘇病毒帶毒規(guī)律一致。

表12 攻毒期間雞群排毒情況

整個(gè)試驗(yàn)期間對照組和攻毒組雞群均未出現(xiàn)明顯癥狀，且攻毒組蛋殼、蛋黃、蛋清質(zhì)量與對照組無明顯差異(圖6,7)。

1,2號.為對照組雞蛋;3～5號.為攻毒組圖6 對照組和攻毒組蛋殼質(zhì)量

01.為對照組;04.為攻毒組圖7 對照組和攻毒組蛋黃、蛋清質(zhì)量

3 結(jié)果

坦布蘇病自2010年暴發(fā)以來，給我國養(yǎng)禽業(yè)特別是水禽業(yè)造成了重大損失，隨著疫苗的研究、開發(fā)、應(yīng)用，在蛋鴨、種鴨方面取得明顯防控效果，但對臨床以共濟(jì)失調(diào)、癱瘓、神經(jīng)癥狀為主要特征的商品群如肉鴨、肉鵝等仍有較大危害。隨著坦布蘇病毒易感宿主范圍的擴(kuò)大，近年來蛋雞群特別是肉種雞群感染坦布蘇病毒報(bào)道逐漸增多，對家禽的危害也逐漸凸顯[7-9]。

本研究首次從我國出現(xiàn)產(chǎn)蛋下降的肉種雞中分離到坦布蘇病毒，通過動(dòng)物回歸試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，坦布蘇病毒能夠造成雞群明顯降蛋，證明坦布蘇病毒是造成本次肉種雞群產(chǎn)蛋下降的主因；通過測序分析可見肉種雞中分離到的坦布蘇病毒與泰國毒株親緣關(guān)系較近(97.0%～98.8%)，與我國水禽流行毒株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)(86.2%～89.3%)；通過病原學(xué)與血清學(xué)檢測可見，發(fā)病雞群坦布蘇病毒抗體轉(zhuǎn)陽率顯著(6.67%～32.6%)，假定健康雞群與育成階段雞群坦布蘇病毒抗體個(gè)別出現(xiàn)轉(zhuǎn)陽情況(0～6.6%)，但并沒有病原陽性檢出，仍需通過大量流調(diào)數(shù)據(jù)佐證，同時(shí)確定血液循環(huán)抗體對開產(chǎn)后雞群的保護(hù)率；通過臨床病原學(xué)檢測并結(jié)合SPF蛋雞攻毒試驗(yàn)排毒規(guī)律可見，消化系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)坦布蘇病毒檢出率相對偏高，帶毒時(shí)間為7～10 d，同時(shí)結(jié)果也顯示攻毒14 d后剖檢雞只未檢測到坦布蘇病毒陽性且雞群不再排毒，但產(chǎn)蛋率未恢復(fù)，故坦布蘇病毒感染雞群后是間歇性排毒還是一過性排毒，仍需進(jìn)一步探討研究。

坦布蘇病毒為黃病毒科黃病毒屬成員，多以節(jié)肢動(dòng)物(如蚊和脾等)為傳播媒介[10]，由于易感品種的寬泛，新型坦布蘇病毒在不同家禽品系中抗體陽性率、臨床表癥相關(guān)性、帶毒排毒率、臨床危害程度等仍需通過相關(guān)流調(diào)工作進(jìn)一步研究以確定感染規(guī)律，密切關(guān)注坦布蘇病毒的跨種感染規(guī)律也具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義。隨著坦布蘇病毒危害性加大，加強(qiáng)對不同易感宿主坦布蘇病毒的分離鑒定及其遺傳變異等研究對于該病的監(jiān)測和防控具有重要意義。