萬年春酒鎮(zhèn)痛、抗炎、抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎作用

馮加華，衛(wèi)克昭，張子旭，吳 歡，屈戰(zhàn)果，章 忱，高建平*

(1.上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，上海 201203；2.上海雷允上藥業(yè)有限公司，上海 201400；3.上海中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，上海 201203)

萬年春酒為上海雷允上藥業(yè)有限公司研制生產(chǎn)的藥酒，其中含有的中藥包括紅參、枸杞子、地楓皮、玉竹、鎖陽、川牛膝、淫羊藿、丹參、紅花、狗脊(制)、白術(shù)(麩炒)等，乙醇體積分數(shù)在40%～50%間。該藥酒的主要功能與主治為補氣健脾、益精滋腎、祛風(fēng)活血、強壯筋骨，用于氣虛脾弱、腰膝酸軟、風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛等。其中含有的地楓皮、川牛膝、淫羊藿、狗脊等中藥對治療關(guān)節(jié)炎有一定的作用。該藥酒目前在臨床上作為處方藥使用，使用患者有限，臨床資料少且無相應(yīng)的實驗研究數(shù)據(jù)為其應(yīng)用提供參考，限制了其臨床使用，故本實驗對萬年春酒的抗炎、鎮(zhèn)痛和對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療作用的藥效學(xué)進行實驗研究，為該藥酒臨床用于關(guān)節(jié)炎或關(guān)節(jié)疼痛疾病提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 藥物與給藥劑量 萬年春酒(上海雷允上藥業(yè)有限公司，批號161101)；元胡止痛片(太極集團四川綿陽制藥有限公司，批號1809005)；阿司匹林腸溶片(德國拜耳公司，批號BJ40065)；甲氨蝶呤片、醋酸地塞米松片(上海上藥信誼藥廠有限公司，批號036170502、015180102)。

給藥劑量設(shè)計依據(jù)為萬年春酒臨床人用劑量(25～50 mL/次)，根據(jù)等效劑量換算倍數(shù)[1]，人與小鼠或大鼠的等效劑量按12或6倍系數(shù)計算，人體質(zhì)量按60 kg計，得到小鼠等效劑量為5.0～10.0 mL/kg，大鼠等效劑量為2.5～5.0 mL/kg，以2倍等比設(shè)定3個劑量組，故小鼠藥效實驗低、中、高劑量分別為2.5、5.0、10.0 mL藥酒/kg，大鼠藥效實驗低、中、高劑量分別為1.25、2.5、5.0 mL藥酒/kg，給藥前將藥酒原液稀釋到相應(yīng)劑量給藥。同法計算陽性藥給藥劑量，或參考相關(guān)文獻中的劑量設(shè)定。

1.2 動物 清潔級ICR、BALB/c小鼠，雌雄各半，體質(zhì)量18～22 g；清潔級SD大鼠，雌雄各半，體質(zhì)量180～200 g，均購于上海斯萊克實驗動物有限公司，動物生產(chǎn)許可證號SCXK(滬)2012-0002，飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心，溫度22～24 ℃，相對濕度(40±5)%，每天12 h光照。

1.3 試劑 冰醋酸、二甲苯(國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號20160108、F20090218)。不完全弗氏佐劑(美國Sigma公司，批號SLBR3 879 V)；卡介苗(上海瑞楚生物科技有限公司，批號A0318R19021)，將卡介苗(50 mg)和不完全弗氏佐劑(5 mL)混合配制成完全弗氏佐劑，質(zhì)量濃度10 mg/mL；牛Ⅱ型膠原(美國Chondrex公司，批號180235)，與完全弗氏佐劑溶液按照1∶1混合用于實驗。

1.4 儀器 HH-4型水浴鍋(江蘇杰瑞爾電器有限公司)；JA5003AL型天平(上海精天電子儀器有限公司)；0～10 mm指針式測厚儀(開拓工具國際集團，分度值0.01 mm)；Biotek Synergy HT型酶標(biāo)儀(美國Bio-Tek公司)；YLS-7A型足趾體積測量儀(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院設(shè)備站，編號005090074)。

2 方法

2.1 鎮(zhèn)痛作用研究

2.1.1 小鼠熱水縮尾潛伏期(痛閾)將小鼠尾巴垂直浸入50 ℃水浴3 cm左右深度，檢測從水浴中回縮出水面的潛伏期(基礎(chǔ)痛閾)，10 s內(nèi)視為合格，隨機分成模型組、元胡止痛片組(1.5 g/kg)及萬年春酒低、中、高劑量組(2.5、5.0、10.0 mL/kg)，稀釋到相應(yīng)劑量灌胃給藥，而模型組給予等體積蒸餾水，容積均為20 mL/kg，每天1次，連續(xù)6 d。末次給藥后30、60、90、120 min，檢測小鼠尾巴從50 ℃水浴中回縮出水面的潛伏期，即為痛閾[1]。

2.1.2 醋酸致小鼠扭體反應(yīng) 將小鼠隨機分為模型組、阿司匹林組(0.2 g/kg)及萬年春酒低、中、高劑量組(2.5、5.0、10.0 mL/kg)，灌胃給藥，而模型組給予等體積蒸餾水，灌胃體積均為20 mL/kg，每天1次，連續(xù)3 d。末次給藥后1 h，各組小鼠腹腔注射0.5%醋酸0.2 mL，觀察15 min內(nèi)出現(xiàn)扭體反應(yīng)的次數(shù)，計算疼痛抑制率[1]，公式為抑制率=[(模型組扭體次數(shù)均值-藥物組扭體次數(shù)均值)/模型組扭體次數(shù)均值]×100%。

2.2 抗炎作用研究 小鼠隨機分為模型組、阿司匹林組(0.2 g/kg)及萬年春酒低、中、高劑量組(2.5、5.0、10.0 mL/kg)，灌胃給藥，模型組給予等體積蒸餾水，灌胃體積20 mL/kg，每天1次，連續(xù)5 d。末次給藥后1 h，小鼠右耳內(nèi)廓均勻涂抹100%二甲苯40 μL致炎，左耳不涂作為對照，1 h后脫頸椎處死，沿耳廓基線剪下雙耳，用直徑8 mm的打孔器分別在左右耳的同一部位沖下圓形耳片，電子天平稱定質(zhì)量，以兩耳片質(zhì)量差(右耳片質(zhì)量-左耳片質(zhì)量)為耳腫脹度，并計算耳腫脹抑制率[1]，公式為抑制率=[(模型組腫脹度-藥物組腫脹度)/模型組腫脹度]×100%。

2.3 抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎作用研究

2.3.1 完全弗氏佐劑誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎 造模前，測量大鼠右后踝關(guān)節(jié)以下部分體積，除正常組外各組于右后足足跖中部注射0.1 mL完全弗氏佐劑以誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎[2]，1周后測量右后足踝關(guān)節(jié)以下部分(同造模前測量位置)的足體積評價模型是否成功。造模大鼠隨機分為模型組、醋酸地塞米松組(2 mg/kg)及萬年春酒低、中、高劑量組(1.25、2.5、5.0 mL/kg)，灌胃給藥，每天1次，連續(xù)4周，而正常組、模型組大鼠灌胃等體積蒸餾水，灌胃體積10 mL/kg，每5 d稱量1次大鼠體質(zhì)量，根據(jù)其變化調(diào)整給藥劑量，每7 d進行1次大鼠關(guān)節(jié)炎評分，測量右后足踝關(guān)節(jié)以下足體積。實驗結(jié)束后，麻醉小鼠并處死，取踝關(guān)節(jié)固定、脫鈣、包埋、切片后行HE染色，在光學(xué)顯微鏡下檢測關(guān)節(jié)組織中滑膜細胞增生、細胞侵蝕、血管翳形成、炎癥和骨質(zhì)侵蝕評分。關(guān)節(jié)炎評分標(biāo)準(zhǔn)[2-3]為0分，無關(guān)節(jié)炎；1分，發(fā)紅或微腫脹；2分，中度腫脹；3分，嚴重腫脹；4分，嚴重腫脹且不能負重或有潰爛，出現(xiàn)耳部紅斑、尾巴風(fēng)濕結(jié)節(jié)情況的，加1分。關(guān)節(jié)病理評分標(biāo)準(zhǔn)[3]為(1)滑膜細胞增殖評分，0=無增殖;1=輕微增殖，2～4層滑膜細胞；2=中度增殖，4層以上滑膜細胞；3=滑膜細胞過度增殖，侵蝕軟骨和骨，關(guān)節(jié)間隙消失；(2)血管翳評分，0=無改變；1=兩個部位出現(xiàn)血管翳；2=四個部位出現(xiàn)血管翳，伴有軟骨表面侵蝕；3=四個以上部位出現(xiàn)血管翳或二個部位出現(xiàn)大范圍血管翳；(3)炎癥浸潤評分，0=正常；1=輕度炎癥，出現(xiàn)1個聚集物或少量散在炎性細胞(T細胞、B細胞、巨噬細胞、漿細胞)浸潤；2=中度炎癥，2個或2個以上的白細胞聚集物；3=重度炎癥，炎細胞大量浸潤，大量白細胞聚集，分散浸潤明顯；(4)骨質(zhì)侵蝕評分，0=正常；1=微量侵蝕，1～2個小的淺部位；2=少量侵蝕，1～4個中等大小和深度部位；3=中等侵蝕，5個以上部位，局部侵蝕到骨皮質(zhì)；4=重度侵蝕，多重損傷，局部或完全侵蝕到骨皮質(zhì)；5=廣泛損傷，皮質(zhì)穿透骨長度的25%。

2.3.2 Ⅱ型膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎 除正常組外，其他各組小鼠尾根部注射0.07 mL、足跖中部注射0.03 mL牛Ⅱ型膠原和完全弗氏佐劑的混合乳劑以誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎[4-5]，3周后再次加強免疫，根據(jù)足腫脹情況確定模型是否成功。二次免疫后，小鼠隨機分為模型組、甲氨蝶呤組(1 mg/kg)及萬年春酒低、中、高劑量組(2.5、5.0、10.0 mL藥酒/kg)，灌胃給藥，而正常組和模型組小鼠灌胃等體積蒸餾水，給藥劑量20 mL/kg，每天1次，連續(xù)30 d，每7 d評估小鼠關(guān)節(jié)炎評分，測量足掌厚度。灌胃給藥30 d后麻醉處死小鼠，取踝關(guān)節(jié)，固定、脫鈣、包埋、切片后行HE染色，在光學(xué)顯微鏡下檢測關(guān)節(jié)組織中滑膜細胞增生、細胞侵蝕、血管翳形成、炎癥和骨質(zhì)侵蝕評分。

3 結(jié)果

3.1 鎮(zhèn)痛作用

3.1.1 對小鼠熱水縮尾潛伏期(痛閾)的影響 與模型組比較，萬年春酒各劑量組和元胡止痛片組給藥后90、120 min，痛閾值均升高(P<0.05，P<0.01)，中劑量組給藥后30 min痛閾值升高(P<0.05)，見表1。

表1 萬年春酒對小鼠熱水縮尾潛伏期(痛閾)的影響

3.1.2 對醋酸致小鼠扭體反應(yīng)的影響 與模型組比較，萬年春酒各劑量組和阿司匹林組小鼠扭體反應(yīng)次數(shù)降低(P<0.01)，見表2。

表2 萬年春酒對醋酸致小鼠扭體反應(yīng)的影響

3.2 抗炎作用 與模型組比較，萬年春酒各劑量組和阿司匹林組小鼠耳腫脹度降低(P<0.01)，見表3。

表3 萬年春酒對二甲苯致小鼠耳腫脹的影響

3.3 抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎作用

3.3.1 完全弗氏佐劑誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎

3.3.1.1 關(guān)節(jié)腫脹程度 與正常組比較，模型組大鼠足體積、關(guān)節(jié)炎評分升高(P<0.01)；與模型組比較，萬年春酒各劑量組大鼠足體積、關(guān)節(jié)炎評分降低(P<0.05，P<0.01)，見表4～5。

表4 萬年春酒對完全弗氏佐劑誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎大鼠足體積的影響

表5 萬年春酒對完全弗氏佐劑誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)炎評分的影響(分，

3.3.1.2 踝關(guān)節(jié)病理組織學(xué) 正常組大鼠滑膜細胞覆蓋在疏松結(jié)締組織，未見滑膜細胞增生和浸潤，關(guān)節(jié)軟骨、骨質(zhì)、關(guān)節(jié)腔間隙均正常，無炎細胞浸潤；模型組大鼠滑膜細胞增生、血管翳形成、炎細胞浸潤、軟骨及骨質(zhì)侵蝕；與模型組比較，萬年春酒各劑量組和醋酸地塞米松組滑膜細胞輕度增生，少量血管翳形成、少量軟骨及骨質(zhì)破壞，并且中、高劑量組和醋酸地塞米松組大鼠踝關(guān)節(jié)軟骨及骨質(zhì)侵蝕或破壞方面改善更明顯，見圖1。

與正常組比較，模型組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜細胞增生、血管翳、炎細胞浸潤、骨質(zhì)侵蝕程度評分升高(P<0.01)；與模型組比較，萬年春酒中劑量組大鼠踝關(guān)節(jié)炎細胞浸潤、骨質(zhì)侵蝕程度的病理評分降低(P<0.05)，醋酸地塞米松組和萬年春酒高劑量組大鼠踝關(guān)節(jié)血管翳、骨質(zhì)侵蝕程度評分降低(P<0.05，P<0.01)，見表6。

表6 萬年春酒對完全弗氏佐劑誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎大鼠踝關(guān)節(jié)病理評分的影響(分，

注：A為正常組，B為模型組，C為醋酸地塞米松組，D為萬年春酒低劑量組，E為萬年春酒中劑量組，F(xiàn)為萬年春酒高劑量組。圖1 各組大鼠踝關(guān)節(jié)病理組織學(xué)切片(HE染色,×50)

3.3.2 Ⅱ型膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎

3.3.2.1 足掌厚度、關(guān)節(jié)炎評分 治療第6天后，與正常組比較，模型組小鼠足掌厚度、關(guān)節(jié)炎評分升高(P<0.01)；與模型組比較，萬年春酒中、高劑量組小鼠足掌厚度、關(guān)節(jié)炎評分降低(P<0.01)，見表7～8。

表7 萬年春酒對Ⅱ型膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎小鼠足掌厚度的影響

表8 萬年春酒對Ⅱ型膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎小鼠關(guān)節(jié)炎評分的影響(分，

3.3.2.2 踝關(guān)節(jié)病理組織學(xué) 正常組小鼠踝關(guān)節(jié)正常，未見有炎細胞浸潤，關(guān)節(jié)軟骨正常，關(guān)節(jié)囊覆蓋纖薄滑膜細胞；模型組小鼠踝關(guān)節(jié)充血，炎細胞輕度、大量或重度浸潤，關(guān)節(jié)滑膜細胞輕度或中度增生，關(guān)節(jié)軟骨中度破壞；大面積血管翳形成，關(guān)節(jié)間隙減小，骨質(zhì)損傷或破壞或侵蝕；與模型組比較，各給藥組小鼠踝關(guān)節(jié)炎細胞浸潤、滑膜細胞的增生、血管翳形成無明顯改善，而在骨質(zhì)損傷、侵蝕或破壞方面，萬年春酒中劑量組有一定改善作用，見圖2。

與正常組比較，模型組小鼠踝關(guān)節(jié)滑膜細胞增生、血管翳、炎細胞浸潤、骨質(zhì)侵蝕程度評分均升高(P<0.01)；與模型組比較，萬年春酒中劑量組小鼠踝關(guān)節(jié)骨質(zhì)侵蝕程度評分降低(P<0.05)，見表9。

注：A為正常組，B為模型組，C為甲氨蝶呤組，D為萬年春酒低劑量組，E為萬年春酒中劑量組，F(xiàn)為萬年春酒高劑量組。圖2 各組小鼠踝關(guān)節(jié)病理組織學(xué)切片(HE染色,×50)

表9 萬年春酒對Ⅱ型膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎小鼠踝關(guān)節(jié)病理評分的影響(分，

4 討論

萬年春酒處方中，含有地楓皮、川牛膝、淫羊藿、狗脊等多種對關(guān)節(jié)炎的防治有很好效果的中藥。處方中的地楓皮具有祛風(fēng)除濕，行氣止痛等功效，在治療跌打損傷和風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛等方面具有良好功效[6]，在臨床應(yīng)用中，將其制成藥酒在治療關(guān)節(jié)炎、四肢關(guān)節(jié)酸痛等方面獲得了成功案例[7]。川牛膝具有抗炎、抗超敏反應(yīng)、抗痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎等作用[8]。臨床用于治療風(fēng)濕痹痛以四肢大關(guān)節(jié)腫痛療效佳[9]。另外狗脊具有明顯的鎮(zhèn)痛和抗炎作用[10]，淫羊藿是中醫(yī)治療筋骨萎軟、風(fēng)濕痹痛等疾病的常用中藥，現(xiàn)代研究中關(guān)于該藥及其有效成分在鎮(zhèn)痛、抗炎、治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨性關(guān)節(jié)炎等方面的藥效研究非常多見[11]。以上中藥的組成及其研究基礎(chǔ)為該藥酒用于關(guān)節(jié)痛的治療提供了重要的依據(jù)。

關(guān)節(jié)疼痛是各種關(guān)節(jié)炎性疾病最主要的表現(xiàn)，是導(dǎo)致患者關(guān)節(jié)活動受限甚至功能喪失的主要原因，緩解疼痛是最為主要的治療措施，可以改善患者關(guān)節(jié)的活動受限以及關(guān)節(jié)功能的退變[12]。故本研究對萬年春酒的鎮(zhèn)痛作用進行了評價。采用熱刺激造模法和化學(xué)刺激法制備2種常用的檢測鎮(zhèn)痛作用效果的疼痛模型，以刺激開始至出現(xiàn)反應(yīng)的潛伏期(痛閾)或固定時間內(nèi)疼痛反應(yīng)的次數(shù)作為疼痛的定量指標(biāo)評價藥效[1]。結(jié)果顯示，萬年春酒各劑量組在給藥后對這物理刺激和化學(xué)刺激兩種疼痛反應(yīng)均有抑制作用，2.5～10.0 mL/kg萬年春酒可提高小鼠對熱刺激反應(yīng)的閾值，抑制醋酸致小鼠扭體反應(yīng)，抑制率約為47.66%～69.67%，提示鎮(zhèn)痛效果顯著，有效劑量相當(dāng)于臨床人用量12.5～50.0 mL/次。本研究可提示該藥酒對于關(guān)節(jié)疼痛的緩解具有應(yīng)用價值。

關(guān)節(jié)及其周圍組織的炎癥反應(yīng)是各種關(guān)節(jié)炎的共性，是關(guān)節(jié)疼痛、腫脹以及功能障礙等的直接誘因，因此臨床上對各種類型的關(guān)節(jié)炎抗炎治療是主要治療措施之一。本研究采用化學(xué)物質(zhì)二甲苯刺激小鼠耳廓產(chǎn)生急性炎性腫脹，通過腫脹程度和腫脹抑制率評價受試藥物的抗炎作用。實驗結(jié)果表明，2.5～10.0 mL/kg萬年春酒可抑制二甲苯致小鼠的耳腫脹，表明其具有一定的抗炎作用，有效劑量相當(dāng)于臨床人用量12.5～50.0 mL/次。本實驗結(jié)果可提示萬年春酒在消除急性炎癥方面效果明顯，可以為臨床該藥酒用于關(guān)節(jié)炎治療提供實驗依據(jù)。

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎屬于一種免疫性疾病，以對稱性多關(guān)節(jié)炎為主要表現(xiàn)，關(guān)節(jié)處多有類風(fēng)濕皮下結(jié)節(jié)、關(guān)節(jié)變形以及關(guān)節(jié)組織病理組織學(xué)的異常，常表現(xiàn)為炎細胞浸潤、關(guān)節(jié)滑膜細胞增生、關(guān)節(jié)軟骨破壞、關(guān)節(jié)間隙減小、骨質(zhì)損傷等[13]。本實驗選擇了公認的兩個模型[5]，弗氏佐劑誘導(dǎo)和Ⅱ型膠原誘導(dǎo)模型，通過關(guān)節(jié)腫脹百分率、關(guān)節(jié)炎評分、關(guān)節(jié)病理組織學(xué)等[1-2]評價藥物作用。本研究結(jié)果顯示，從灌胃給藥治療第8天開始，1.25～5.0 mL/kg萬年春酒降低了關(guān)節(jié)腫脹的體積和/或關(guān)節(jié)炎評分，對關(guān)節(jié)的病理組織學(xué)的異常有改善作用；在Ⅱ型膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎模型實驗中，從灌胃給藥治療第6天開始，5.0～10.0 mL/kg萬年春酒降低了足掌厚度和/或關(guān)節(jié)炎評分，5.0 mL/kg萬年春酒對關(guān)節(jié)的病理組織學(xué)的異常有改善作用。實驗結(jié)果提示萬年春酒有抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎作用，可以作為該藥酒用于緩解風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛的關(guān)節(jié)腫脹、變形和病理組織學(xué)異常的參考依據(jù)，有效劑量相當(dāng)于臨床人用量25.0～50.0 mL/次。

綜上所述，本實驗結(jié)果可提示萬年春酒具有鎮(zhèn)痛和抗炎作用，對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的關(guān)節(jié)炎癥和關(guān)節(jié)病理組織學(xué)改變有緩解作用，為其臨床治療關(guān)節(jié)炎癥性疾病提供實驗依據(jù)。