蓬莪術(shù)醋制前后總姜黃素的大鼠腸吸收動(dòng)力學(xué)差異比較

高天慧，袁 濤，朱宗萍，廖 婉*，林美斯，任 波*

(1.西南特色中藥資源國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 611137;2.成都市食品藥品檢驗(yàn)研究院，四川 成都 610045；3.成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院針灸學(xué)校，四川 成都 610097)

蓬莪術(shù)CurcumaphaeocaulisVal.是川產(chǎn)道地藥材的代表性品種之一，也是2020年版《中國藥典》收載的莪術(shù)主要來源之一[1]。具有行氣破血、消積止痛之效，常用于治療氣滯血瘀所致的癥瘕積聚、經(jīng)閉及心腹瘀痛等癥。蓬莪術(shù)炮制最早記載于《雷公炮炙論》中，“凡使，于砂盆中用醋磨”，醋制后主入肝經(jīng)血分，既能增 “破積消堅(jiān)，去積聚癖塊”之效，又可緩生品峻猛之性。課題組前期結(jié)果表明總姜黃素是蓬莪術(shù)的主要藥效部位之一，其所含主要單體成分為雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素及姜黃素[2]。經(jīng)測定，醋制后的蓬莪術(shù)飲片中，雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素及姜黃素分別由(0.081 5±0.003)、(1.083 5±0.014)、(0.683 0±0.004)mg/g增加至(0.187 0±0.003)、(3.858 5±0.032)、(5.953 5±0.046)mg/g[3]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，醋制后的蓬莪術(shù)中，總姜黃素對(duì)TGF-β信號(hào)通路的調(diào)控能力進(jìn)一步提高，從而增強(qiáng)了抗肝炎作用[4]，這表明總姜黃素可能是蓬莪術(shù)醋制“增效減毒”的重要物質(zhì)基礎(chǔ)之一。

蓬莪術(shù)最常用的給藥方式為口服，而吸收為口服給藥后確保藥效發(fā)揮的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，小腸是體內(nèi)藥物吸收的主要部位，在體腸灌注模型常用于研究口服藥物腸道吸收情況[5-6]。故本實(shí)驗(yàn)以大鼠在體腸灌流模型為載體，開展蓬莪術(shù)醋制前后總姜黃素大鼠腸吸收差異研究。并將蓬莪術(shù)的另一大主要組分—揮發(fā)油[7]，與總姜黃素進(jìn)行配伍，開展腸吸收研究，以期更全面合理地反映蓬莪術(shù)藥效成分在大鼠體內(nèi)腸吸收情況，對(duì)比分析蓬莪術(shù)醋制前后及組分配伍前后大鼠體內(nèi)生理效應(yīng)表達(dá)的過程性機(jī)制差異，以期進(jìn)一步揭示蓬莪術(shù)“增效減毒”的科學(xué)內(nèi)涵。

1 材料

LC-2030C3D型高效液相色譜儀(日本島津公司)；UV756CRT型紫外可見分光光度計(jì)(上海佑科儀器儀表有限公司)。

雙去甲氧基姜黃素(CAS 33171-05-0，批號(hào)140613)、去甲氧基姜黃素(CAS 24939-17-1，批號(hào)140815)、姜黃素(CAS 458-37-7，批號(hào)140612)均購于四川省維克奇生物科技有限公司，純度≥98%；甲醇(色譜純，批號(hào)WXBC8485V)、乙腈(色譜純，批號(hào)WXBC9153V)，均購于美國Sigma-Aldrich公司；冰醋酸(色譜純，批號(hào)2018060103，成都市科隆化學(xué)品有限公司)；水合氯醛(分析純，批號(hào)2017030301)、苯酚紅(分析純，批號(hào)2017091801，成都市科隆化學(xué)品有限公司)。

蓬莪術(shù)采自道地產(chǎn)區(qū)四川省，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)中藥標(biāo)本中心盧先明教授鑒定為姜科植物蓬莪術(shù)CurcumaphaeocaulisVal.。按課題組前期蓬莪術(shù)醋制專利方法[8](專利號(hào)ZL 2013 1 0400255.2)炮制得醋莪術(shù)飲片，即取適量蓬莪術(shù)生品，加入30%量的9°米醋，拌勻悶潤2 h，煮至醋液收干，于120 ℃下干燥30 min，取出稍冷，干燥即得醋莪術(shù)飲片[9]。

清潔級(jí) SD大鼠，雄性，36只，體質(zhì)量(300±25)g，由成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，生產(chǎn)許可證編號(hào)為 SCXK(川)2015-030。

2 方法與結(jié)果

2.1 醋制前后蓬莪術(shù)揮發(fā)油及總姜黃素提取 分別取蓬莪術(shù)飲片(生品、醋品)，加入8倍量水，浸泡1 h后水蒸氣蒸餾提取6 h，收集即得淡黃色具特殊氣味的透明油狀物質(zhì)，加入適量無水硫酸鈉脫水后離心2 min即得[10]。

提取揮發(fā)油后，過濾所得即為去油藥渣。稱取去油蓬莪術(shù)藥渣(生品、醋品)，加入3倍量的950 mL/L乙醇，提取2次，每次2 h，濾液合并，減壓濃縮至浸膏，即得總姜黃素[11]。生莪術(shù)總姜黃素浸膏中雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素、姜黃素質(zhì)量濃度分別為(1.030 0±0.046)、(9.810 5±0.130)、(10.628 5±0.211)mg/g，醋莪術(shù)總姜黃素浸膏中雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素、姜黃素質(zhì)量濃度分別為(1.720 0±0.016)、(19.403 0±0.087)、(29.465 5±0.077)mg/g。

2.2 酚紅K-R溶液制備 為校正大鼠在體循環(huán)腸灌流實(shí)驗(yàn)中小腸對(duì)水分的吸收與分泌，選擇腸不吸收性物質(zhì)酚紅校正藥物因水吸收導(dǎo)致的濃度偏差。精密稱定NaCl 7.80 g、KCl 0.35 g、CaCl20.37 g、NaHCO31.37 g、NaH2PO40.32 g、MgCl20.02 g、葡萄糖1.40 g，加水定容成1.0 L，即得空白標(biāo)準(zhǔn)K-R溶液。精密稱取酚紅20 mg，用空白標(biāo)準(zhǔn)K-R溶液溶解并稀釋成酚紅質(zhì)量濃度為20 mg/L的溶液，即得酚紅K-R溶液[12]。

2.3 大鼠腸灌流液制備 參考文獻(xiàn)[13]方法，配制4組大鼠腸灌流液，用酚紅標(biāo)準(zhǔn)K-R溶液，定容至100 mL即可。根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，每100 g蓬莪術(shù)飲片能夠提取約1 mL的揮發(fā)油，然后制備浸膏大約為20 mL，故本實(shí)驗(yàn)揮發(fā)油和總姜黃素的比例基本與原飲片中含量比例保持一致。具體分組及各組組分見表1。

表1 4組大鼠腸灌流液組分及配比Tab.1 Composition and ratio of intestinal perfusion fluid for 4 groups of

2.4 酚紅方法學(xué)考察 按“2.2”項(xiàng)下方法制備質(zhì)量濃度為10.0 μg/mL的酚紅對(duì)照品溶液，倍比稀釋后，分別精密吸取0.5 mL，加入0.2 mol/L NaOH溶液5 mL，混勻。在558 nm處測定吸光度(A)值，精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性試驗(yàn)均符合要求。以酚紅對(duì)照品溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，以吸光度為縱坐標(biāo)(A)進(jìn)行回歸，得方程為A=0.169X-0.007 3(r=0.999 1)，在0.326 6～10.45 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 HPLC法建立

2.5.1 色譜條件 參照2020年版《中國藥典》[1]，并根據(jù)實(shí)驗(yàn)實(shí)際情況得優(yōu)化的色譜條件。Agilent Zorbax SB-C18色譜柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流動(dòng)相4%醋酸-乙腈(52∶48)；體積流量1.0 mL/min；柱溫25 ℃；檢測波長430 nm；進(jìn)樣量10 μL；運(yùn)行時(shí)間15 min。色譜圖見圖1，可知上述條件下各成分色譜峰分離度良好。

2.5.2 混合對(duì)照品溶液制備 分別取適量雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素和姜黃素對(duì)照品，精密稱定，并置于10 mL棕色量瓶中，用空白K-R溶液-甲醇(2∶1)溶液定容至刻度，搖勻即得。

1.雙去甲氧基姜黃素 2.去甲氧基姜黃素 3.姜黃素1.bisdemethoxycurcumin 2.demethoxycurcumin 3.curcumin圖1 各成分HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.5.3 樣品處理方法 取2.0 mL大鼠原位腸灌注樣品溶液，與1.0 mL甲醇渦旋混合2 min(2 000 r/min)后，在12 000 r/min條件下離心5 min，吸取上清液，過針式過濾器后置進(jìn)樣瓶中即得。

2.5.4 線性關(guān)系考察 分別精密吸取“2.5.2”項(xiàng)下的混合對(duì)照品適量，倍比稀釋后，在“2.5.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣，以 對(duì) 照 品 質(zhì) 量 濃 度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，進(jìn)行回歸，結(jié)果見表2，表明各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 各成分線性關(guān)系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.5.5 精密度試驗(yàn) 取“2.5.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，在“2.5.1”項(xiàng)條件下重復(fù)進(jìn)樣6次，測得雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素和姜黃素含量RSD分別為1.30%、0.75%、0.66%，表明儀器精密度良好。

2.5.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取A、B、C、D 4組腸灌注液各6份，在“2.5.1”項(xiàng)條件下分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，記錄峰面積，3種成分的變化率均在97.99%～100.13%之間，RSD均<2%(見表3)。表明經(jīng)甲醇處理后的腸灌注液中各成分在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

表3 雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基和姜黃素的穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果(%)Tab.3 Stability test results of bisdemethoxycurcumin,demethoxycurcumin and curcumin(%)

2.5.7 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取已知雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素和姜黃素含量的腸灌注液6 份，分別加入適量對(duì)照品溶液，在“2.5.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測定，以測定濃度與配制濃度之比計(jì)算回收率。結(jié)果表明，溶液中3種成分的平均回收率均在98.67%～99.82%之間(n=6)。

2.6 大鼠小腸壁對(duì)主要成分的物理吸附試驗(yàn) 取禁食12 h，自由飲水的SD大鼠，處死后取出小腸，用生理鹽水洗凈后置于D組腸灌注中孵育2 h，測定孵育前后雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素及姜黃素的濃度，平行6次，計(jì)算孵育后3種成分的剩余百分率，考察其是否存在物理吸附情況。結(jié)果孵育2 h后灌流液中雙去甲氧基姜黃素的平均剩余率為(99.03±0.37)%；去甲氧基姜黃素的平均剩余率為(98.67±0.62)%；姜黃素的平均剩余率為(99.00±0.37)%；表明孵育2 h 后大鼠小腸壁對(duì)3種待測成分無顯著物理吸附[3]。

2.7 大鼠在體腸灌流試驗(yàn)方法 SD大鼠試驗(yàn)前12 h禁食不禁水，隨機(jī)分為12組，每組3只，均麻醉后固定，沿腹中線打開，暴露腹腔。參照文獻(xiàn)[12-13]方法，找到十二指腸段、空腸斷及回腸段。在每個(gè)腸段兩端各切一小口，先用37 ℃生理鹽水緩緩注入腸段，洗去腸內(nèi)容物。再用空白K-R溶液以2.0 mL/min 的體積流量循環(huán)10 min，排除腸內(nèi)多余生理鹽水。再取各組已預(yù)熱至37 ℃腸灌流液以1.0 mL/min體積流量循環(huán)10 min后，將體積流量調(diào)節(jié)為0.2 mL/min，立即從裝有灌流液的錐形瓶中取樣2.5 mL，作為測定零時(shí)間藥物濃度和酚紅濃度的樣品，然后向錐形瓶中補(bǔ)加2.5 mL含酚紅的標(biāo)準(zhǔn)K-R溶液，其后每隔15 min按同樣的方法取樣并補(bǔ)足含酚紅的標(biāo)準(zhǔn)K-R溶液，循環(huán)2 h后，中止試驗(yàn)。

2.8 腸灌注液中雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素及姜黃素吸收差異性測定 在“2.5.1”項(xiàng)條件下對(duì)每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取得的樣品進(jìn)行處理并檢測，按文獻(xiàn)[14]方法對(duì)所獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，以小腸剩余藥量的對(duì)數(shù)(lnX)對(duì)取樣時(shí)間(t)作圖，得直線，由直線斜率得吸收速率常數(shù)(Ka)，計(jì)算單位時(shí)間吸收率(P)，公式如下。lnX=lnX0-Ka×t；t1/2=0.693/Ka；P=(C0×V0-Ct×Vt)/(C0×V0×t)。以A組去甲氧基姜黃素在大鼠十二指腸吸收為例，可得其lnX-t曲線回歸方程為Y=-0.070 8X+4.098 6(r=0.969 4)、Y=-0.065 4X+4.065 2(r=0.955 8)、Y=-0.047 4X+3.783 9(r=0.931 4)。

獲得計(jì)算各組腸灌注液中3種待測成分的吸收速率常數(shù)Ka(h-1)、吸收半衰期t1/2(h)、每小時(shí)吸收百分率P(%)。采用IBM SPSS Statistics 21軟件對(duì)所獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)分析，結(jié)果見表4～6。

表4 不同組別中雙去甲氧基姜黃素在大鼠小腸吸收差異性Tab.4 Differences in bisdemethoxycurcumin absorption in rat small intestine of different n=3)

表5 不同組別中去甲氧基姜黃素在大鼠小腸吸收差異性Tab.5 Differences in demethoxycurcumin absorption in rat small intestine of different n=3)

表6 不同組別中姜黃素在大鼠小腸吸收差異性研究結(jié)果Tab.6 Differences in curcumin absorption in rat small intestine of different n=3)

根據(jù)結(jié)果，就同一腸段而言，雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素、姜黃素在3個(gè)腸段中均是醋品的吸收速率和吸收程度較佳，且配伍揮發(fā)油后抑制了3種成分在3個(gè)腸段中的吸收速率；而就相同成分，同一炮制及配伍方式，不同腸段而言的成分吸收差異，去甲氧基姜黃素、姜黃素總的趨勢是在回腸段吸收速率較快，在空腸段的吸收程度較好。此外，本研究中僅兩組分相互配伍后的C、D組檢測到了雙去甲氧基姜黃素，故A、B組中無雙去甲氧基姜黃素吸收情況的數(shù)據(jù)。

3 討論

中藥醋制是臨床常用的炮制方法，始載于西漢的《五十二病方》。醋制法能夠引藥入肝、緩和藥性、增加藥物有效成分溶出等[15]。甘彥雄等[4]發(fā)現(xiàn)蓬莪術(shù)醋制品能調(diào)控TGF-β信號(hào)通路以發(fā)揮抗肝炎作用，其中姜黃素和雙去甲氧基姜黃素是主要有效成分。本研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)比生品，醋制后蓬莪術(shù)總姜黃素3種成分在大鼠十二指腸、空腸、回腸的的吸收速度及程度都有所加快，這表明蓬莪術(shù)醋制后，不僅指標(biāo)性成分含量增加，且更有利于其在體腸吸收。故推測蓬莪術(shù)醋制后抗肝炎的藥效增強(qiáng)，可能與總姜黃素吸收增加有關(guān)。這與中藥傳統(tǒng)炮制“醋制入肝”的經(jīng)典理念不謀而合，更印證了“蓬莪術(shù)入肝，通肝經(jīng)聚血，破氣中之血”的科學(xué)性[16]，也進(jìn)一步提示總姜黃素可能是蓬莪術(shù)醋制“增效”的物質(zhì)基礎(chǔ)之一[17]。

本實(shí)驗(yàn)醋制后蓬莪術(shù)總姜黃素在小腸的主要吸收部位均發(fā)生了后移，生品總姜黃素成分中雙去甲氧基姜黃素在十二指腸中吸收最好，醋制后增加了回腸中的吸收；醋制前去甲氧基姜黃素和姜黃素在空腸中吸收最好，醋制后在回腸中的吸收明顯增加，配伍生品揮發(fā)油后在十二指腸中的吸收最好。醋品總姜黃素成分中去甲氧基姜黃素和姜黃素在配伍醋品揮發(fā)油前后均在回腸中吸收最好。故推測蓬莪術(shù)醋制后，其有效成分在體內(nèi)的延后吸收，增加了有效成分與機(jī)體相互作用的時(shí)間，達(dá)到了醋制“增效”的目的[18]，但這仍需進(jìn)一步的試驗(yàn)驗(yàn)證。

揮發(fā)油是蓬莪術(shù)中另一大重要組分，課題組前期研究已證明揮發(fā)油是蓬莪術(shù)發(fā)揮“破血消癥”功效的重要物質(zhì)基礎(chǔ)之一[19]。故本研究創(chuàng)新性地考察了蓬莪術(shù)生、醋品中的總姜黃素各與其揮發(fā)油配伍前后大鼠腸吸收差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)配伍揮發(fā)油后，總姜黃素中3種成分在大鼠小腸的吸收速度會(huì)降低。這可能是小腸自身吸收物質(zhì)生理特性所致，兩類物質(zhì)同時(shí)經(jīng)腸吸收產(chǎn)生競爭性抑制，從而影響總姜黃素的吸收速度。

研究中僅兩組分相互配伍后的C、D組檢測到了雙去甲氧基姜黃素成分。相比去甲氧基姜黃素、姜黃素，該成分在蓬莪術(shù)中含量本就偏低，經(jīng)大鼠腸吸收后，含量更是少之又少。而配伍揮發(fā)油后的腸灌注液中可檢測到雙去甲氧基姜黃素的變化情況，故推測總姜黃素配伍揮發(fā)油后可能會(huì)增加雙去甲氧基姜黃素在腸灌注液的含量或穩(wěn)定性。接下來，課題組也將采用更精密靈敏的儀器，對(duì)雙去甲氧基姜黃素成分的大鼠腸吸收情況開展深入研究。此外，課題組前期試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)雙去甲氧基姜黃素在介導(dǎo)抗肝炎蛋白表達(dá)時(shí)，相對(duì)于總姜黃素的其他成分來說，效果更勝一籌[2]。因此蓬莪術(shù)組分配伍與其藥效表達(dá)之間的復(fù)雜關(guān)系，值得我們更進(jìn)一步的研究。