化濁解毒方對(duì)多氯聯(lián)苯126暴露致大鼠脂肪胰島素抵抗的機(jī)制

郭勝男，張 莉，吳深濤，劉弘毅

(1.山東大學(xué)第二醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250000；2.天津河?xùn)|盛世眾康醫(yī)院，天津 300171；3.天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津 300380；4.云南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，云南 昆明 650000)

據(jù)國(guó)際糖尿病聯(lián)盟估計(jì)，到2045年，全球糖尿病的患病人數(shù)將從2017年的4.25億增加到6.29億[1]。2型糖尿病更為普遍，約占糖尿病患者的90%，主要是由胰島素抵抗和代償性胰島素分泌不足引起[2-3]。導(dǎo)致胰島素抵抗和2型糖尿病的危險(xiǎn)因素很多，不可改變的危險(xiǎn)因素有家族病史、年齡(>45歲)等；可改變的危險(xiǎn)因素有肥胖、高血脂、高血壓等。但是，這些傳統(tǒng)的常規(guī)危險(xiǎn)因素不能完全解釋全世界范圍內(nèi)2型糖尿病患者人數(shù)的迅猛增加，但其與全球城市化和工業(yè)化進(jìn)程相一致[4]。

持續(xù)性有機(jī)污染物是全球工業(yè)化發(fā)展帶來(lái)的環(huán)境污染物，是污染物中最具代表性的有毒化學(xué)物質(zhì)[5]，可通過(guò)食物鏈在人體中(例如血液、脂肪、肝臟、母乳等)積累，對(duì)人體健康構(gòu)成巨大威脅[6]。德國(guó)哈勒和奧格斯堡兩項(xiàng)隊(duì)列研究證實(shí)，持續(xù)性有機(jī)污染物具有在一般人群中致胰島素抵抗及糖尿病的影響[7]。

先前的動(dòng)物研究結(jié)果表明，吳深濤教授的經(jīng)驗(yàn)方——化濁解毒方能夠顯著改善二惡英及多氯聯(lián)苯標(biāo)準(zhǔn)品暴露的ZDF大鼠糖毒性、脂毒性及由其引起的胰島素抵抗[8-9]，但具體分子生物學(xué)機(jī)制目前尚不明確。本課題選用了1種具有代表性且毒性較強(qiáng)的持續(xù)性有機(jī)污染物——PCB126，建立ZDF大鼠染毒模型，探究化濁解毒方改善染毒大鼠脂肪組織胰島素抵抗的分子生物學(xué)機(jī)制，為未來(lái)抗糖尿病藥物的研發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物及飼料 選用SPF級(jí)健康雄性 ZDF(fa/fa)大鼠作為模型對(duì)照，體質(zhì)量180～200 g；選擇SPF級(jí)雄性ZDF(fa/+)大鼠作為正常對(duì)照，體質(zhì)量140～160 g，均購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(京)2016-0006。PMILabdiet5008飼料配比為粗蛋白24%，粗脂肪7.1%，粗纖維3.2%，無(wú)氮浸出物48.9%，礦物質(zhì)(有機(jī)物)6.7%，維生素3.2%，購(gòu)自雍立(上海)生物科技有限公司。

1.2 藥物 多氯聯(lián)苯126(3,3′,4,4′,5-pentachlorobiphenyl，PCB126)，CAS號(hào)57465-28-8，分子式C12H5CI5，購(gòu)自北京曼哈格生物技術(shù)有限公司；CH223191(CAS號(hào)301326-22-7，分子式C19H19N5O)，購(gòu)自美國(guó)Selleck Chemicals公司。化濁解毒方顆粒(組方藥材黃連、大黃、姜黃、蟬蛻、僵蠶、枳實(shí)、清半夏、白芍、柴胡、黃芩、干姜、佩蘭)，由天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥廠制備，批號(hào)津藥制字(臨)Z20130944。

1.3 試劑與儀器

1.3.1 試劑 碘[125I]胰島素放射免疫試劑盒，購(gòu)自北京北方生物技術(shù)研究所；游離脂肪酸測(cè)定試劑盒(比色法)，購(gòu)自南京建成生物工程研究所；甘油三酯試劑盒(酶比色法)、膽固醇試劑盒(酶比色法)，均購(gòu)自北京中生北控生物科技股份有限公司；一抗AhR(貨號(hào)ER62618)，購(gòu)自杭州華安生物技術(shù)有限公司；PPARγ、CD36、GLUT4、FGF21和、TNFα抗體(貨號(hào)分別為ab272718、ab252923、ab33780、ab171941、ab66579)、蛋白酶抑制劑及磷酸酶抑制劑(批號(hào)分別為201111、201112)，均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒(貨號(hào)G1003)，購(gòu)自武漢賽維爾生物科技有限公司；中性樹膠(批號(hào)ZLI-9555)，購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；BCA 蛋白定量試劑盒(貨號(hào)BD0028)、β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)單克隆抗體(貨號(hào)AP0060)，均購(gòu)自美國(guó)Bioworld Technology公司；SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液5×(貨號(hào)P0015 L)，購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；山羊抗兔二抗(購(gòu)自北京ANOLA，貨號(hào)AN19618A)。無(wú)水乙醇(批號(hào)100092683)、二甲苯(批號(hào)10023418)，均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.3.2 儀器 SN697雙探頭全自動(dòng)放免γ計(jì)數(shù)器(上海核所日環(huán)光電儀器有限公司)；7020型ISE全自動(dòng)生化分析儀(日本日立公司)；TDZ5-WS低速多管架自動(dòng)平衡離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司)；723S分光光度計(jì)(上海棱光技術(shù)有限公司)；170-3940型電泳儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；Trans-Blot型轉(zhuǎn)膜儀(美國(guó)Invitrogen公司)；Amersham imager 600型超靈敏多功能成像儀(美國(guó)General Electric公司)；RM2235病理切片機(jī)、ASP200S全自動(dòng)脫水機(jī)、G1150H加熱石蠟包埋系統(tǒng)、DM3000正置光學(xué)顯微鏡(德國(guó)Leica公司)；Image-Pro Plus 6.0圖像分析儀(美國(guó)Media Cybemetics公司)。

2 方法

2.1 分組與飼養(yǎng) 雄性ZDF(fa/fa)大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，根據(jù)口服葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)(OGTT)合格者隨機(jī)分為模型組與多氯聯(lián)苯染毒組，染毒8周，根據(jù)OGTT結(jié)果將多氯聯(lián)苯染毒組隨機(jī)分為染毒組、陽(yáng)性藥組及化濁解毒方高、中、低劑量組，其間均以PMILabdiet5008專用飼料喂養(yǎng)，而雄性ZDF(fa/+)大鼠始終以普通飼料喂養(yǎng)。OGTT實(shí)驗(yàn)方案為過(guò)夜禁食不禁水8 h以上，次日上午7：00，檢測(cè)大鼠空腹血糖、空腹體質(zhì)量，50%葡萄糖以2 g/kg劑量灌胃，于0、60、90、120 min進(jìn)行血糖檢測(cè)，根據(jù)大鼠類型及前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將糖耐量正常及已形成糖尿病者剔除，糖耐量受損者納入合格者范疇。

2.2 染毒及給藥 染毒組大鼠以每天250 ng/kg劑量灌胃給予PCB126染毒，模型組、正常組大鼠灌胃等量橄欖油，連續(xù)8周。依據(jù)《中國(guó)臨床藥理學(xué)與治療學(xué)》及課題組前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定化濁解毒方高、中、低劑量分別為6.0、3.0、1.5 g/kg[10-11]，陽(yáng)性藥組大鼠給予10 mg/kg CH223191灌胃治療，模型組、正常組大鼠以等量生理鹽水灌胃，連續(xù)4周。

2.3 取材及血清指標(biāo)檢測(cè) 給藥結(jié)束后，大鼠過(guò)夜禁食不禁水8 h以上，次日腹腔注射麻醉后取材，腹主動(dòng)脈取血后3 000 r/min離心15 min，收集血清，檢測(cè)空腹血糖(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)、空腹血清胰島素(fasting insulin，F(xiàn)INS)、甘油三酯(triglycerides，TG)、膽固醇(cholesterol，TC)、游離脂肪酸(free fatty acid，F(xiàn)FA)水平。對(duì)各組大鼠胰島素抵抗指數(shù)(homeostasis model assessment for insulin resistance，HOMA-IR)進(jìn)行計(jì)算[12]，公式為HOMA-IR=FBG×FINS/22.5。切取大鼠附睪脂肪組織，生理鹽水清洗脂肪表面，置于4%多聚甲醛中固定，制作常規(guī)石蠟包埋進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，剩余大鼠脂肪組織做好標(biāo)記進(jìn)行分裝，迅速將其置于干冰泡沫盒中冷凍，再迅速轉(zhuǎn)移放于-80 ℃冰箱中保存。

2.4 HE染色觀察大鼠脂肪組織病理學(xué)變化 大鼠新鮮脂肪組織固定于4%多聚甲醛中24 h以上，常規(guī)乙醇梯度脫水，透明，石蠟包埋，切取4 μm，常規(guī)脫蠟，復(fù)水后進(jìn)行HE染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察各組脂肪組織形態(tài)，采用圖像分析儀比較脂肪細(xì)胞平均大小。

2.5 Western blot檢測(cè)大鼠脂肪組織AhR、PPARγ及下游CD36、GLUT4、FGF21、TNFα蛋白表達(dá) 取凍存的大鼠脂肪組織適量，剪碎后放入離心管，根據(jù)相應(yīng)比例加入Western及IP細(xì)胞裂解液、蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑，超聲破碎儀冰上破碎組織，4 ℃、14 000 r/min離心5 min，分離上清液，即為總蛋白，BCA法檢測(cè)蛋白濃度，4%～12% SurePAGE蛋白預(yù)制膠上樣電泳分離蛋白，濃縮膠80 V電泳25 min，分離膠100 V電泳75 min，以PagePuler Prestained Protein Ladder所示的分子量切膠，甲醇浸泡PVDF膜，將目的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，放入封閉液(5%進(jìn)口脫脂奶粉)中，室溫?fù)u床緩慢封閉2 h，TBST洗滌，分別加入AhR(1∶1 000)、PPARγ(1∶1 000)、CD36(1∶1 000)、GLUT4(1∶1 000)、FGF21(1∶1 000)、TNFα(1∶1 000)一抗，4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗滌5次，加入TBST稀釋的HRP 標(biāo)記的二抗(1∶10 000)孵育1 h，再用TBST洗滌，按照顯影液說(shuō)明書進(jìn)行曝光。采用 Image J軟件，分析各目的蛋白/β-actin的灰度值。

3 結(jié)果

3.1 化濁解毒方對(duì)大鼠空腹血糖、空腹胰島素及胰島素抵抗指數(shù)的影響 與正常組比較，模型組大鼠空腹血糖、空腹胰島素、胰島素抵抗指數(shù)升高(P<0.01)；與模型組比較，染毒組大鼠空腹血糖、空腹胰島素、胰島素抵抗指數(shù)升高(P<0.01)；與染毒組比較，化濁解毒方各劑量組與陽(yáng)性藥組大鼠上述指標(biāo)均降低(P<0.01)，見表1。

表1 各組大鼠空腹血糖、空腹胰島素及胰島素抵抗指數(shù)Tab.1 FBGs,FINSs and HOMA-IRs in rats in each

3.2 化濁解毒方對(duì)大鼠血脂水平的影響 與正常組比較，模型組大鼠 TC、TG、FFA水平升高(P<0.01)；與模型組比較，染毒組大鼠TC、TG、FFA水平升高(P<0.01)；與染毒組比較，化濁解毒方各劑量組與陽(yáng)性藥組大鼠TC、TG、FFA水平均降低(P<0.01)；化濁解毒方低劑量組大鼠TG水平雖有改善作用，但效果不顯著(P>0.05)，見表2。

表2 各組大鼠血脂水平Tab.2 Blood lipid levels in rats in each group n=10)

3.3 化濁解毒方對(duì)大鼠脂肪組織病理學(xué)形態(tài)的影響 正常組大鼠脂肪細(xì)胞排列緊密，細(xì)胞較小且大小均一；與正常組比較，模型組、染毒組大鼠脂肪細(xì)胞增大(P<0.01)，排列紊亂，以染毒組更顯著；與染毒組比較，化濁解毒方各劑量組及陽(yáng)性藥組大鼠細(xì)胞縮小(P<0.01)，中、高劑量組及陽(yáng)性藥組效果顯著，見圖1～2。

圖1 各組大鼠脂肪組織病理學(xué)形態(tài)(HE，×100)Fig.1 Pathological morphologies of adipose tissue in rats in each group (HE，×100)

注：與正常組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01;與染毒組比較，ΔΔP<0.01。圖2 各組大鼠脂肪細(xì)胞大小Fig.2 Fat cell sizes of rats in each

注：A為正常組，B為模型組，C為染毒組，D為陽(yáng)性藥組，E～G分別為化濁解毒方低、中、高劑量組。圖3 各組大鼠脂肪組織AhR/PPARs通路蛋白表達(dá)Fig.3 Expressions of AhR/PPARs pathway proteins in adipose tissue of rats in each group

3.4 化濁解毒方對(duì)大鼠脂肪組織AhR、CD36、TNFα蛋白表達(dá)的影響 與正常組比較，模型組大鼠AhR、CD36、TNF-α蛋白表達(dá)升高(P<0.01)；與模型組比較，染毒組大鼠AhR、CD36、TNF-α蛋白表達(dá)升高(P<0.01)；與染毒組比較，化濁解毒方中、高劑量組及陽(yáng)性藥組大鼠AhR、CD36、TNF-α蛋白表達(dá)降低(P<0.05，P<0.01)，見圖3、表3。

表3 各組大鼠脂肪組織AhR、CD36和TNF-α蛋白表達(dá)Tab.3 Expressions of AhR,CD36 and TNF-α proteins in adipose tissue of rats in each n=3)

3.5 化濁解毒方對(duì)大鼠脂肪組織PPAR-γ、GLUT4和FGF-21蛋白表達(dá)的影響 與正常組比較，模型組大鼠PPAR-γ、GLUT4、FGF-21蛋白表達(dá)降低(P<0.01)；與模型組比較，染毒組大鼠PPAR-γ、GLUT4、FGF-21蛋白表達(dá)降低(P<0.01)；與染毒組比較，化濁解毒方中、高劑量給藥組及陽(yáng)性藥組大鼠PPAR-γ、GLUT4、FGF-21蛋白表達(dá)均升高(P<0.05，P<0.01)，化濁解毒方低劑量組僅GLUT4蛋白表達(dá)升高(P<0.05)，PPAR-γ、FGF-21蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化(P>0.05)，見圖3、表4。

表4 各組大鼠脂肪組織PPAR-γ、GLUT4和FGF-21蛋白的表達(dá)Tab.4 Expressions of PPAR-γ,GLUT4 and FGF-21 proteins in adipose tissue of rats in each n=3)

4 討論

芳香烴受體(aryl hydrocarbon receptor，AhR)又名二惡英受體，是一種配體激活轉(zhuǎn)錄因子，主要在脂肪和肝臟中表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，PCB126可特異性激活A(yù)hR影響糖脂代謝、激發(fā)炎癥進(jìn)而導(dǎo)致胰島素抵抗[13-14]。白細(xì)胞分化抗原36 (cluster of differentiation 36,CD36)是一種高度糖基化的單鏈跨膜蛋白，能夠引起脂質(zhì)代謝紊亂和炎癥[15-16]，是AhR下游的主要靶點(diǎn)[17]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，染毒組脂肪組織的AhR表達(dá)升高，與胰島素抵抗相關(guān)的糖脂代謝指標(biāo)、炎癥因子TNFα及CD36的表達(dá)也升高，可能與PCB126激活A(yù)hR相關(guān)；與染毒組比較，化濁解毒方組AhR、TNFα、CD36及糖脂代謝指標(biāo)表達(dá)下降，胰島素抵抗顯著改善，且中、高劑量組及陽(yáng)性藥組效果顯著。陽(yáng)性藥CH223191是在脊椎動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的一種效且特異性的AhR受體拮抗劑，能有效抑制PCB126介導(dǎo)的核易位和AhR與 DNA 結(jié)合[18-19]。因此，CH223191有效阻止了PCB126誘導(dǎo)的AhR基因的激活，改善胰島素抵抗，化濁解毒方顯示出同等的效果，且呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系，說(shuō)明化濁解毒方可能具有類“AhR受體拮抗劑”的作用。

葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(glucose transporter 4，GLUT4)可促進(jìn)機(jī)體從外周攝取葡萄糖，調(diào)節(jié)生物體糖穩(wěn)態(tài)[20]。研究發(fā)現(xiàn)，GLUT4為AhR下游的靶點(diǎn)，AhR可通過(guò)抑制 GLUT4的表達(dá)與活性，誘發(fā)胰島素抵抗[21-22]。成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(fibroblast growth factor-21，F(xiàn)GF21)具有改善胰島素抵抗及調(diào)節(jié)血脂的功能，受AhR的調(diào)控，主要在脂肪表達(dá)[23]。結(jié)果顯示，染毒組GLUT4與FGF21表達(dá)下調(diào)，說(shuō)明兩者可能受到AhR的抑制。

過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferators-activated receptors，PPARs)在維持能量平衡和抑制炎癥中發(fā)揮核心作用。PPARγ(主要在脂肪表達(dá))是其中一個(gè)亞型，可增加脂質(zhì)在脂肪中的存儲(chǔ)，減輕脂質(zhì)在非脂肪組織的沉積，同時(shí)調(diào)節(jié)糖代謝和抑制炎癥。持續(xù)性有機(jī)污染物特異性激活 AhR 的多個(gè)下游重要靶點(diǎn)也受到 PPARs 調(diào)控。PPARs一方面受AhR的調(diào)控，另一方面可活化GLUT4，改善糖代謝，對(duì)CD36、TNF-α也有調(diào)節(jié)作用。研究發(fā)現(xiàn)，PPARγ能刺激脂肪分泌 FGF-21 通過(guò)對(duì)抗糖脂毒性及增加脂肪的胰島素敏感性來(lái)改善胰島素抵抗；同時(shí)，F(xiàn)GF21還可刺激脂肪分泌具有胰島素增敏作用的脂聯(lián)素[24]。本研究發(fā)現(xiàn)，染毒后，PPARγ及下游的GLUT4、FGF21均出現(xiàn)下調(diào)，一方面跟AhR的抑制相關(guān)，另一方面可能為PPARγ調(diào)控失衡；給藥后，3種蛋白均出現(xiàn)不同程度的上調(diào)，中、高劑量組效果顯著。前期實(shí)驗(yàn)表明，化濁解毒方能通過(guò)調(diào)節(jié) PPARγ的表達(dá)改善胰島素抵抗[11]。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，化濁解毒方改善胰島素抵抗的機(jī)制可能是一方面抑制脂肪組織AhR及下游CD36與TNFα的表達(dá)；另一方面促進(jìn)PPARγ及GLUT4與FGF21的表達(dá)。病理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，染毒組的脂肪細(xì)胞較模型組增大，給藥后，脂肪細(xì)胞減小。研究發(fā)現(xiàn)，脂肪細(xì)胞的大小與脂肪中TNFα表達(dá)呈正相關(guān)[25]。病理學(xué)結(jié)果說(shuō)明，PCB126可加重脂肪的炎癥，經(jīng)化濁解毒方處理后，脂肪炎癥及胰島素抵抗得到改善。因此，化濁解毒方改善染毒大鼠脂肪胰島素抵抗的機(jī)制與其調(diào)控AhR/PPARs通路相關(guān)。