Duchenne型肌營養(yǎng)不良癥的治療

羅 宏，岑海媚，羅 彬，張玉生，b，張 譽

(暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院 a.神經(jīng)內(nèi)科；b.腦血管病中心，廣東 廣州 510632)

Duchenne型肌營養(yǎng)不良癥(Duchenne muscular dystrophy, DMD)是因編碼抗肌萎縮蛋白的Dystrophin基因突變，導(dǎo)致進(jìn)行性肌無力、肌肉萎縮的一種遺傳性肌病，男性占多數(shù)，全球發(fā)病率為(10.7～27.8)/10萬活產(chǎn)嬰兒[1]?；純撼Ｔ?～3歲時出現(xiàn)臨床癥狀，多數(shù)患者于12歲逐漸喪失行走能力，隨病程進(jìn)展逐漸累及膈肌及心肌，最終在20～30歲時死于呼吸衰竭或心力衰竭[2]。Dystrophin基因位于染色體X p21上，總長度約2.20×106bp，是目前為止發(fā)現(xiàn)的人類最大基因之一[3]。Dystrophin基因轉(zhuǎn)錄全長約427 k的dystrophin蛋白，后者是維系肌膜穩(wěn)定性的關(guān)鍵蛋白，該蛋白缺失后導(dǎo)致肌膜穩(wěn)定性破壞，肌肉收縮產(chǎn)生的機(jī)械應(yīng)力無法被相關(guān)蛋白吸收導(dǎo)致肌肉炎癥，進(jìn)而激活肌細(xì)胞再生。最終, 反復(fù)修復(fù)再生的肌肉會被脂肪和纖維結(jié)締組織取代，導(dǎo)致纖維化[4]。

迄今，DMD尚無切確的根治方法，但隨著對該病發(fā)病機(jī)制和病理變化過程的認(rèn)識不斷深入，以及分子生物學(xué)和基因工程的快速發(fā)展，DMD治療不斷取得新進(jìn)展。這些治療方案主要圍繞恢復(fù)dystrophin蛋白表達(dá)或彌補(bǔ)dystrophin蛋白缺失而進(jìn)行。本文對DMD治療的研究現(xiàn)狀進(jìn)行綜述，并分析這些治療方案的利弊，為臨床醫(yī)師治療DMD提供參考。

1 恢復(fù)dystrophin蛋白表達(dá)治療

DMD致病機(jī)制主要是功能性dystrophin蛋白缺乏，故最有效、最根本的治療方法就是恢復(fù)dystrophin蛋白功能和表達(dá)。目前治療方法主要有：通讀療法、外顯子跳躍療法、病毒載體介導(dǎo)的基因療法、干細(xì)胞療法，以及CRISPR/Cas9基因編輯療法等。

1.1通讀療法 通讀療法是一種適用于大約10%無義突變患者的方法，運用藥物誘導(dǎo)與核糖體結(jié)合，跳過識別提前出現(xiàn)的終止密碼子，從而恢復(fù)全長、功能性肌營養(yǎng)不良蛋白的表達(dá)[5]。目前用于無義突變通讀療法的治療藥物主要有氨基糖苷類抗生素、Ataluren、RTCl3、RTCl4等，其中只有氨基糖苷類抗生素及Ataluren 進(jìn)入臨床試驗階段。(1)氨基糖苷類抗生素：慶大霉素為治療DMD患者無義突變傳統(tǒng)類藥物，其與核糖體特定位點結(jié)合，誘導(dǎo)過早出現(xiàn)的終止密碼子的通讀，促進(jìn)全長抗肌營養(yǎng)不良蛋白的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。研究表明，用慶大霉素治療的mdx小鼠(DMD模型鼠)肌膜中檢測到肌營養(yǎng)不良蛋白的高表達(dá)，并且提高了肌肉收縮所誘導(dǎo)的損失抵抗力。然而在人體試驗卻得到了矛盾的結(jié)果。Malik等[6]采用3種不同的治療方案驗證了靜脈注射慶大霉素治療DMD患兒無義突變的療效，觀察周期為6個月。結(jié)果顯示，接受慶大霉素6個月治療的患兒抗肌營養(yǎng)不良蛋白的表達(dá)增加，血清肌酸激酶(CK)水平降低，但反應(yīng)肌肉功能質(zhì)量改善的指標(biāo)卻沒有改變，需要更高的劑量才能改善患者的結(jié)果。此外，慶大霉素的耳毒性及腎毒性也限制了其在治療DMD方面的長期應(yīng)用。為此，目前有研究開發(fā)出了氨基糖苷類衍生物NB74和NB84，已經(jīng)在體外測試證明了其在細(xì)胞毒性和通讀效率方面優(yōu)于慶大霉素。另外一種氨基糖苷類抗生素硫酸阿貝卡星(NPC-14)Ⅱ期臨床試驗(試驗編號：NCT01918384))目前已完成，但尚未公布結(jié)果。(2)Ataluren：Ataluren(PTC124)是目前研究最多、最有希望的抑制無義突變的通讀治療藥物。在一項為期28天的Ⅱa期研究中，DMD患者在治療后顯示Ataluren 能增加11%抗肌萎縮蛋白的表達(dá)[7]。隨后的一項為期48周雙盲安慰劑對照的Ⅱb期研究中，Bushby等[8]采用兩種不同的治療方案治療174名無義突變的DMD患者，其中方案一：每天口服Ataluren 3次(10、10、20 mg/kg，分別是早上，中午和晚上劑量，n=57)；方案二：每天口服Ataluren 3次(20、20、40 mg/kg，分別是早上，中午和晚上劑量，n=60)，對照組(n=57)予安慰劑治療。結(jié)果顯示，與安慰劑相比，每天服用40 mg/kg Ataluren的治療組在平均6 min步行測試(6MWT)距離上比安慰劑組增加了30 m，然而在每天服用80 mg/kg的治療組卻看不到癥狀的改善，這種結(jié)果可能歸因于Ataluren的鐘形劑量效應(yīng)曲線?；谶@些結(jié)果及相關(guān)研究，Ataluren于2014年獲得歐洲藥品管理局(EMA)條件性批準(zhǔn)，但卻沒有獲得美國食品與藥品管理局(FDA)批準(zhǔn)。原因是Ataluren Ⅱb期研究及Ⅲ期研究(試驗編號：NCT01826487)未能達(dá)到主要終點事件。由于2017年Ataluren的Ⅲ期研究顯示阿塔魯侖治療組和安慰劑對照組之間的6MWT差異無統(tǒng)計學(xué)意義[9]，PTC Therapeutics公司被要求在2021年之前進(jìn)行一項新的驗證性研究來確認(rèn)臨床療效。Ataluren主要用于治療≥5歲的無意義突變的DMD患者[10]。2018年，EMA在審查了該藥對治療2～5歲患者安全性數(shù)據(jù)后，批準(zhǔn)將Ataluren治療的適應(yīng)證擴(kuò)大到≥2歲患有無義突變的DMD患者[9]，近期一項評估Ataluren治療6個月～2歲的無意義突變的DMD患兒安全性的試驗(試驗編號：NCT04336826)正在進(jìn)行，期待獲得預(yù)期的療效和安全性。雖然Ataluren有很好的治療前景，經(jīng)Ataluren治療的DMD患者活動階段可能延長5年，但Ataluren治療只適用于約13%攜帶無義突變的DMD患者，而且這種藥物價格昂貴，未來在臨床上普及需一段時間。

1.2外顯子跳躍療法 缺失突變是肌營養(yǎng)不良常見的突變類型，約占所有DMD突變的68%[11]，缺失突變包括移碼突變和整碼突變。Becker肌營養(yǎng)不良癥(becker muscular dystrophy, BMD)是肌營養(yǎng)不良的一種癥狀相對較輕的臨床表型，其特征是框內(nèi)整碼突變但不破壞閱讀框(ORF)，因此可以產(chǎn)生部分截短的功能性蛋白。而DMD是由于框內(nèi)移碼突變破壞閱讀框，導(dǎo)致dystrophin蛋白的缺失。基于這種閱讀框架假說，科學(xué)家提出了外顯子跳躍這一概念。外顯子跳躍療法是通過合成的反義寡核苷酸(ASO)序列在DMD基因的前信使RNA剪接過程中誘導(dǎo)預(yù)先指定的外顯子跳過，將嚴(yán)重DMD表型改善為臨床癥狀較輕、預(yù)后較好Becker肌營養(yǎng)不良癥。大約90%的DMD患者的dystrophin基因缺失可以通過跳過多個外顯子治療而癥狀改善[12]。目前進(jìn)入臨床試驗的反義寡核苷酸藥物有Drispersen、Eteplirsen、Golodirsen等，幾種不同的化合物在不同的DMD動物模型中進(jìn)行了測試，并且在Ⅱ期臨床試驗中顯示了令人滿意的結(jié)果。

Drispersen(2′O-methyl-ribo-oligonucleoside-phosphorothioate，2′OMePS)是基于2′-O-甲基硫代磷酸酯修飾的寡核苷酸，是第一個在DMD患者身上測試的寡核苷酸，旨在跳過51號外顯子。在Drispersen的一項Ⅲ期研究中，涉及186例DMD患兒，其中治療組125例接受每周6 mg/kg的Drispersen皮下劑量，對照組61例接受安慰劑治療，遺憾的是雖然治療組的療效優(yōu)于安慰劑組，但未能證明6MWT差異有統(tǒng)計學(xué)意義或臨床顯著改善，同時治療組還觀察到注射部位炎癥反應(yīng)、蛋白尿、血小板減少[13]，因此FDA拒絕了Drispersen的上市批準(zhǔn)申請，關(guān)于Drispersen的開發(fā)研究也于2016年終止。

Eteplirsen(phosphorodiami-date morpholinooligomers, PMOs)是一種嗎啉反義寡聚物，通過特異性跳過外顯子51來恢復(fù)DMD基因的翻譯閱讀框架，從而促進(jìn)缺陷遺傳變異體中營養(yǎng)不良蛋白的產(chǎn)生。2016年，基于Eteplirsen Ⅱ/Ⅲ期臨床研究的結(jié)果，F(xiàn)DA有條件的批準(zhǔn)對DMD患者進(jìn)行這種治療[14]，但由于參與臨床試驗的患者數(shù)量較少，Eteplirsen的臨床療效需要更多的研究來進(jìn)一步驗證。

最近，在Ⅰ/Ⅱ期試驗和正在進(jìn)行的Ⅲ期試驗取得積極結(jié)果后，F(xiàn)DA批準(zhǔn)了另一種藥物Golodirsen, 適用于治療8%外顯子53順應(yīng)性突變的DMD患者[15]。Golodirsen是設(shè)計用來跳過外顯子53的寡核苷酸，在前期研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)患者抗肌萎縮蛋白表達(dá)增加，目前Ⅲ期臨床試驗(試驗編號：NCT0250038l，NCT03532542)正在進(jìn)行中。

盡管反義寡核苷酸介導(dǎo)的外顯子跳躍療法有著良好的治療前景，但這種治療策略也存在明顯的局限性：(1)療效有限，細(xì)胞攝取率低，不能有效的輸送到靶組織，無法恢復(fù)心肌中dystrophin蛋白的表達(dá)。(2)由于反義寡核苷酸藥物分子較小，會通過腎臟快速排泄。(3)外顯子跳躍療法旨在將DMD表型轉(zhuǎn)為臨床癥狀輕微的BMD表型，不能完全治愈DMD患者。(4)由于反義寡核苷酸藥物在血液中的半衰期短，需要重復(fù)給藥才能維持治療效果[16]。(5)治療個體化，只針對特定類型的外顯子跳躍突變，例如Drispersen和Eteplirsen只能治療約13%的51號外顯子突變的患者[17]。

為了解決外顯子跳躍的局限性問題，科學(xué)家們研究了一系列新的治療策略。在這些策略中，為了解決反義寡核苷酸藥物循環(huán)系統(tǒng)清除快的問題，相關(guān)研究采用硫代磷酸酯(PS)修飾的反義寡核苷酸與血漿/血清蛋白結(jié)合，降低其腎臟清除率，并增加其在組織中的蓄積，特別是腎臟和肝臟，從而大大降低反義寡核苷酸藥物在循環(huán)系統(tǒng)的清除率[18]。此外，在克服外顯子跳躍療法心肌療效低問題上，有研究已經(jīng)開發(fā)出一種肽綴合的多肽偶聯(lián)嗎啉代寡聚物(PPMO)，這種寡聚物富含精氨酸，具有良好的藥代動力學(xué)特征，能夠增強(qiáng)細(xì)胞的攝取，已經(jīng)在細(xì)胞和動物實驗上證實了在細(xì)胞穩(wěn)定性及細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)效率方面優(yōu)于PMO[5]，但該藥在非人類靈長類動物的安全性評估中，結(jié)果揭示低劑量導(dǎo)致了嚴(yán)重的腎臟毒性[19]，因此在進(jìn)入人體臨床試驗階段之前還需要更多研究來進(jìn)一步驗證其安全性。

1.3病毒載體介導(dǎo)的基因替代療法 基因替代療法是一種能治愈DMD的療法，通過病毒載體將外源性修飾過的功能基因?qū)胨拗黧w內(nèi)，置換突變基因并恢復(fù)抗肌萎縮蛋白表達(dá)。腺相關(guān)病毒(adeno-associatedvirus, AAV)是DMD治療最常用、最有希望的載體，具有致病性低、免疫原性低、外源基因可在宿主內(nèi)長期表達(dá)等優(yōu)點[20]。DMD基因是人類最大的基因之一，總長度約2.3 Mb，dystrophin cDNA 約14 kb，兩者長度都遠(yuǎn)超過了腺相關(guān)病毒5 kb的最大承載能力[21]。于是，有研究通過創(chuàng)建微型或小型抗肌營養(yǎng)不良蛋白解決這個問題。在一項研究中，將攜帶mini/micro dystrophin的AAV載體注射到DMD模型犬中，結(jié)果顯示了肌肉組織學(xué)的改善[22]，然而，在一項對6名注射了AAV相關(guān)的微型抗肌營養(yǎng)不良蛋白基因的DMD男孩的研究中，由于對微型抗肌營養(yǎng)不良蛋白產(chǎn)生了T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，轉(zhuǎn)基因表達(dá)沒有成功[23]。目前，著眼于開發(fā)一種重組腺相關(guān)病毒載體(NCT 03368742)和更有效的載體傳遞系統(tǒng)的研究正在進(jìn)行中。

1.4CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)的基因編輯治療 CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)是近幾年研究的熱點，同時也是一種充滿希望的治療方法，因為它從根本上永久糾正DMD患者的基因缺陷，達(dá)到治愈DMD的效果，同時也將DMD患者長期治療成本降至最低。Ousterout等[24]的研究中用SpCas9將針對DMD內(nèi)含子44和55的gRNA電穿孔于1例外顯子48-50缺失的DMD患者的永生化肌肉細(xì)胞中，證實了gRNAs可以有效地刪除DMD基因中的單個或多個外顯子。另外一項研究中，Young等[25]采用CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)的外顯子跳躍療法在HiPSC中實現(xiàn)了45-55號外顯子的跳躍。值得注意的是，DMD基因中缺少該外顯子45-55區(qū)域的患者通常是無癥狀的或者表現(xiàn)為輕微的表型[26]，因此治療45-55號外顯子的DMD患者具有重要的臨床意義。

基因組編輯是一種特定于突變的方法，這意味著必須針對不同的突變專門設(shè)計和優(yōu)化引導(dǎo)RNA。另外，基因組編輯方法也可能會出現(xiàn)脫靶效應(yīng)，這會導(dǎo)致DNA的永久性改變。未來需要進(jìn)一步深入了解基因組編輯的非靶點效應(yīng)的機(jī)制和頻率，以充分闡明相關(guān)的安全問題。

1.5干細(xì)胞療法 干細(xì)胞療法基于干細(xì)胞的異體或自體移植，目的是重建肌肉衛(wèi)星細(xì)胞庫，恢復(fù)肌營養(yǎng)不良蛋白的表達(dá)。治療的干細(xì)胞的來源可以是健康的、組織相容的捐贈者，也可以是經(jīng)過基因校正的自體細(xì)胞。目前已經(jīng)有許多類型的干細(xì)胞應(yīng)用于DMD動物模型并取得了預(yù)期的結(jié)果，這里我們主要介紹幾種近幾年興起的、充滿希望的干細(xì)胞療法。

利用HiPSCs基因工程恢復(fù)dystrophin蛋白的功能性表達(dá)治療肌營養(yǎng)不良是充滿希望的治療方法。iPSCs細(xì)胞構(gòu)建是通過將攜帶有4種轉(zhuǎn)錄因子(OCT3/4、SOX2、KLF4和c-MYC)的相關(guān)病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)入人類體細(xì)胞(如皮膚或血液細(xì)胞)中使之發(fā)生重編程，從而獲取與胚胎干細(xì)胞相似潛能的誘導(dǎo)多潛能性干細(xì)胞[27]。為了產(chǎn)生表達(dá)dystrophin的肌纖維，可以對來自DMD患者的hiPSCs進(jìn)行基因編輯，使其表達(dá)功能性dystrophin蛋白，以用于自體細(xì)胞替代治療。理論上，基因編輯聯(lián)合干細(xì)胞療法可以糾正大多數(shù)DMD突變，永久修復(fù)DMD基因，Young等[25]在免疫低下的mdx小鼠中移植來自基因校正的DMD-hiPSCs，結(jié)果成功恢復(fù)了dystrophin蛋白的表達(dá)證實了這一理論的可行性，然而目前還沒有基因編輯的iPSCs用于細(xì)胞移植治療的臨床試驗。在進(jìn)入臨床試驗前還需要克服幾個關(guān)鍵限制因素：(1)需要找到DMD患者產(chǎn)生HiPSCs的最佳體細(xì)胞類型，優(yōu)化培養(yǎng)條件，以避免在生產(chǎn)過程中細(xì)胞在體外分化。(2)需要優(yōu)化干細(xì)胞的輸送途徑，提高干細(xì)胞的移植效率，動脈移植可以可以繞過肺屏障，但安全性需要更多研究驗證[28]。(3)Cas9的非靶點效應(yīng)以及在接受治療的患者中潛在的腫瘤或畸胎瘤形成的風(fēng)險。

鑒于干細(xì)胞療法的局限性，有研究者開發(fā)了一種嵌合細(xì)胞(DEC)療法，通過將供體肌母細(xì)胞和受體肌原細(xì)胞在體外融合獲得嵌合細(xì)胞，然后在免疫抑制下移植到mdx小鼠中, 結(jié)果顯示，mdx小鼠的肌營養(yǎng)不良蛋白的表達(dá)顯著提高(超過37.27%)，以及肌肉功能的改善[29]。嵌合細(xì)胞治療因為攜帶自體細(xì)胞，可以減少免疫反應(yīng)的發(fā)生，能延長移植物的存活時間并且不針對特定的基因突變，因此嵌合細(xì)胞療法將是未來治療DMD非常有吸引力的潛在治療方法。

2 彌補(bǔ)dystrophin蛋白缺失的治療

盡管DMD是一種單基因疾病，但dystrophin蛋白的缺失會觸發(fā)多種病理表現(xiàn)，包括炎癥、鈣穩(wěn)態(tài)喪失、功能性缺血和肌肉再生受損等。因此針對DMD繼發(fā)性病理表現(xiàn)，采用彌補(bǔ)dystrophin蛋白缺失的治療可以延緩DMD疾病進(jìn)程，提高患者的生活質(zhì)量，這對DMD患者具有重要的臨床意義。

2.1抗氧化劑與抗炎藥 皮質(zhì)類固醇(如強(qiáng)的松、強(qiáng)的松龍和地夫可特)是DMD的標(biāo)準(zhǔn)治療方法[1]。雖然皮質(zhì)類固醇延緩了DMD的進(jìn)展，但長期使用會引起包括體重增加、發(fā)育遲緩、胰島素抵抗、骨質(zhì)疏松癥和行為改變等不良反應(yīng)[30]。Vamorolone(VBP15)是一種糖皮質(zhì)激素類似物，與糖皮質(zhì)激素作用機(jī)制相似，但不良反應(yīng)較少。Vamorolone的Ⅱb期研究表明了其具有抗炎作用，并且不會引起與皮質(zhì)類固醇不良效應(yīng)相關(guān)的生物標(biāo)記物的改變[31]。最近對48名患有DMD的男孩(4～7歲，初次使用類固醇治療患者)進(jìn)行的最新研究結(jié)果顯示，在24周的治療期內(nèi)，每天服用不同劑量(2 mg/kg和6 mg/kg)的顯示炎癥反應(yīng)減少，且沒有觀察到嚴(yán)重的不良反應(yīng)[32]。雖然Vamorolone的安全性優(yōu)于糖皮質(zhì)激素，但在使用高劑量組的患者中也出現(xiàn)了體重增加的不良反應(yīng)，因為目前沒有這種藥物長期治療效果的數(shù)據(jù)，導(dǎo)致相關(guān)的不良反應(yīng)可能未觀察到。值得注意的是，Vamorolone作為一種鹽皮質(zhì)激素受體拮抗劑和糖皮質(zhì)激素受體激動劑，它也可能起到心臟保護(hù)作用[33]。

2.2Utrophin調(diào)節(jié) 抗肌萎縮蛋白相關(guān)蛋白(Utroin)是dystrophin結(jié)構(gòu)上(同源性80%)和功能上類似的結(jié)構(gòu)蛋白，通過上調(diào)這些蛋白質(zhì)的表達(dá)可以緩解DMD[34]。Ezutromid(SMT C1100)是一種口服生物分子，通過靶向utrophin-A啟動子以增加utrophin表達(dá)。Ezutromid(SMT C1100)及其相關(guān)化合物SMT022357都在臨床前實驗中被證明可以增加utrophin的產(chǎn)生，緩解肌營養(yǎng)不良癥進(jìn)程。然而該化合物的Ⅱ期試驗因未顯示出療效而終止研發(fā)[35]。

2.3組蛋白去乙?；敢种苿?組蛋白去乙?；?HDAC)抑制劑是一類能改變組蛋白表觀遺傳標(biāo)記，從而影響多個基因表達(dá)的化合物。HDAC抑制劑的作用機(jī)制主要是通過促進(jìn)一些肌肉再生因子(如卵泡抑制素)的轉(zhuǎn)錄，在體外刺激肌肉生成，對抗mdx小鼠的肌肉退化。Givinostat是一種HDAC抑制劑，具有抗炎、抗纖維化和促再生基因表達(dá)的作用[36]。Givinostat的Ⅲ期試驗(NCT03373968，NCT02851797)目前正在進(jìn)行中，希望能得到預(yù)期的療效和結(jié)果。

2.4他汀類藥物 2015年，Whitehead等[37]描述了他汀類藥物對治療mdx小鼠的積極作用，吸引了眾多研究者的眼球。與長期服用他汀類藥物引起骨骼肌病和橫紋肌溶解的結(jié)果不同，每天服用適量(5～10 mg/kg)辛伐他汀可明顯減輕炎癥、纖維化、氧化應(yīng)激和改善肌力。此外，辛伐他汀治療還可以減輕DMD進(jìn)展過程中的骨骼肌自噬[38]。然而，在一項評估他汀類藥物治療相關(guān)肌病風(fēng)險的薈萃分析顯示與服用安慰劑的患者療效相比沒有差別[39]，出現(xiàn)這種差異的原因可能是服用他汀類藥物的人群大多為老年患者，運動以及女性患者因素[40-41]也可能增加藥物不良反應(yīng)的風(fēng)險，未來還需要更多研究證實他汀類藥物治療DMD的安全性。

綜上所述，恢復(fù)肌營養(yǎng)不良蛋白的表達(dá)是治療該病主要治療目標(biāo)，為了達(dá)到對DMD患者的理想治療，我們需要聯(lián)合不同的治療策略，針對不同的疾病過程采取多種干預(yù)措施?；蚓庉嫾夹g(shù)聯(lián)合干細(xì)胞療法是目前前景最好和充滿希望的治療方法，但要轉(zhuǎn)化到臨床試驗階段還需要克服很多的困難，如何解決CRISPR-CAS9系統(tǒng)脫靶效應(yīng)的問題以及構(gòu)建理想的移植細(xì)胞是我們值得思考的問題。目前已經(jīng)有一系列的動物實驗甚至臨床試驗取得了令人鼓舞的結(jié)果，相信不久的將來DMD能夠得到有效的治療。