甘草愈傷組織誘導(dǎo)及帶芽莖段叢生芽增殖條件優(yōu)化

李偉　張東向　劉麗杰　呂晴　任艷波

摘 要：為篩選適于甘草愈傷組織誘導(dǎo)及帶芽莖段叢生芽增殖的最佳激素配比，選取萌發(fā)能力最強(qiáng)的甘草種子作為試驗(yàn)材料，獲得無菌苗，取其下胚軸和帶芽莖段為外植體，在不同激素配比下誘導(dǎo)愈傷組織，統(tǒng)計(jì)愈傷組織的生長(zhǎng)狀況、顏色狀態(tài)、誘導(dǎo)率和出愈率等指標(biāo)，并研究不同激素對(duì)甘草帶芽莖段叢生芽增殖的影響，統(tǒng)計(jì)帶芽莖段叢生芽株高、節(jié)間距、真葉數(shù)、增殖倍數(shù)等指標(biāo)。結(jié)果表明：MS+6BA 1.0 mg·L-1+2，4D 2.0 mg·L-1和MS+6BA 1.0 mg·L-1+NAA 2.0 mg·L-1有利于下胚軸愈傷組織的誘導(dǎo)，MS+6BA 0.2～0.6 mg·L-1有利于帶芽莖段愈傷組織的形成;MS+6BA 1.8 mg·L-1對(duì)帶芽莖段的生長(zhǎng)最為有利，MS+6BA 1.0～2.2 mg·L-1有利于帶芽莖段叢生芽的增殖，隨著6BA濃度的升高，甘草帶芽莖段叢生芽的增殖倍數(shù)也隨之增加。

關(guān)鍵詞：甘草;愈傷組織;帶芽莖段;叢生芽;激素

中圖分類號(hào)：S 567.23 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：0253-2301（2021）10-0027-07

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2021.10.006

Optimization on the Callus Induction and Proliferation of Cluster Budsfrom Stem Segments with Buds of Glycyrrhiza Uralensis

LI Wei， ZHANG Dong-xiang*， LIU Li-jie， LYU Qing， REN Yan-bo

（College of Life Sciences and Agriculture and Forestry， Qiqihar University/Heilongjiang Key Laboratory of

Resistance Gene Engineering and Biodiversity Protection in Cold Areas， Qiqihar， Heilongjiang 161006， China）

Abstract： In order to screen the best hormone ratio for callus induction and the proliferation of cluster buds from the stem segments with buds of Glycyrrhiza uralensis， the seeds of Glycyrrhiza uralensis with the strongest germination ability were selected as the experimental materials to obtain the aseptic seedlings. The hypocotyls and stem segments with buds were taken as the explants to induce the callus under different hormone ratios， and the growth status， color status， induction rate and healing rate of callus were counted. Then， the effects of different hormones on the proliferation of cluster buds from the stem segments with buds of Glycyrrhiza uralensis were studied. And the indicators such as plant height， node spacing， number of true leaves and proliferation multiple of cluster buds from the stem segments with buds were counted. The results showed that MS+6BA 1.0 mg·L-1+2，4D 2.0 mg·L-1 and MS+6BA 1.0 mg·L-1+NAA 2.0 mg·L-1 were conducive to the induction of hypocotyl callus， and MS+6BA 0.2-0.6 mg·L-1 was conducive to the callus formation of the stem segments with buds. MS+6BA 1.8 mg·L-1 was the most beneficial to the growth of the stem segments with buds， and MS+6BA 1.0-2.2 mg·L-1 was conducive to the proliferation of cluster buds from the stem segments with buds. With the increase of 6BA concentration， the proliferation multiple of cluster buds from the stem segments with buds of Glycyrrhiza uralensis also increased.

Key words： Glycyrrhiza uralensis; Callus; Stem segments with buds; Cluster buds; Hormone

甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch為豆科Leguminosae甘草屬Glycyrrihiza多年生草本植物，是中國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中最古老和最常用的草藥之一。它含有20多種三萜和300多種黃酮類化合物。近年來，研究表明從甘草中分離的活性化合物具有抗腫瘤、抗菌、抗病毒、抗炎、免疫調(diào)節(jié)功能，同時(shí)具有恢復(fù)和保護(hù)神經(jīng)、消化、呼吸、內(nèi)分泌和心血管系統(tǒng)的功效[1]?！吨袊幍洹?020年版規(guī)定甘草有3個(gè)來源，即烏拉爾甘草G.Uralensis Fisch.、光果甘草G.glabra Linn. 及脹果甘草G.inflata Batalin.[2]。甘草具有多種藥用價(jià)值[3]，由于過度和不可持續(xù)的采挖，甘草的野生資源減少得非常迅速，現(xiàn)在雖然甘草在中國西北部地區(qū)廣泛種植[4]。但人工栽培易受外界環(huán)境影響，因此無性系育苗是保持親本優(yōu)良特性的首選途徑，特別是植物組織培養(yǎng)方法具有生長(zhǎng)周期短、外植體遺傳背景一致性高、生長(zhǎng)條件可控制等優(yōu)勢(shì)，可快速、高效的繁育種苗[5]。甘草成材需要2～5年，種子發(fā)芽率低，人工育種周期長(zhǎng)，進(jìn)行組織培養(yǎng)快速繁殖就成為對(duì)甘草保護(hù)性開發(fā)利用的最佳途徑[6]。目前，對(duì)甘草愈傷組織誘導(dǎo)及帶芽莖段叢生芽增殖條件有一定研究[7-8]。本試驗(yàn)研究不同激素對(duì)下胚軸及帶芽莖段誘導(dǎo)愈傷組織的影響，以及不同激素對(duì)帶芽莖段叢生芽增殖的影響，旨在篩選最佳激素配比，為甘草無性快繁提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

甘草種子由齊齊哈爾市昂昂溪區(qū)中草藥種植基地提供，試驗(yàn)使用的藥品未特殊標(biāo)注均為分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 甘草無菌苗及外植體的獲得 將甘草種子用蒸餾水浸泡25 min，再用0.1%升汞浸泡10 min，消毒后，在超凈工作臺(tái)內(nèi)用無菌水淘洗5遍，每遍2 min，將無菌種子接種于經(jīng)過滅菌的、未添加激素的MS培養(yǎng)基上，每瓶接種10粒，用封口膜封口后，放入恒溫培養(yǎng)箱，溫度25℃，暗培養(yǎng)，每天觀察種子萌發(fā)情況，待種子萌發(fā)以后，無菌苗生長(zhǎng)至5～10 cm，可用于外植體取材。

在無菌條件下，選擇種子萌發(fā)能力最強(qiáng)且長(zhǎng)勢(shì)最好、茁壯、有節(jié)段的無菌苗，在超凈工作臺(tái)內(nèi)用滅過菌的鑷子取出，置于事先經(jīng)高壓滅菌冷卻后的培養(yǎng)皿上，再用滅過菌的解剖刀和鑷子取其下胚軸（0.7 cm）和帶芽莖段（0.7 cm）。

1.2.2 不同激素配比對(duì)甘草下胚軸愈傷組織誘導(dǎo)的影響 將獲得的下胚軸接種于添加不同濃度的6BA、2，4D、NAA且經(jīng)過滅菌的MS培養(yǎng)基上，每瓶接種4個(gè)，培養(yǎng)基含3%蔗糖和0.8%瓊脂糖，pH 5.8，溫度25℃，光照周期16 h/d，光照強(qiáng)度2 000 lx，暗培養(yǎng)下則不提供光照。培養(yǎng)基中6BA、NAA和2，4D的濃度梯度見表1，下胚軸誘導(dǎo)愈傷組織共4種培養(yǎng)基，每種處理重復(fù)3次，21 d后觀察愈傷組織誘導(dǎo)情況。

愈傷組織誘導(dǎo)率（%）=（形成的愈傷組織塊數(shù)/接種外植體數(shù)）×100

1.2.3 6BA對(duì)甘草帶芽莖段愈傷組織誘導(dǎo)的影響 將獲得的帶芽莖段接種于添加不同濃度6BA且經(jīng)過滅菌的MS培養(yǎng)基上，每瓶接種4個(gè)，培養(yǎng)基含3%蔗糖和0.8%瓊脂糖，pH 5.8，溫度25℃，光照周期16 h/d，光照強(qiáng)度2 000 lx，暗培養(yǎng)下則不提供光照。

采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，6BA濃度分別為：0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 mg·L-1，每種處理重復(fù)3次，21 d后觀察愈傷組織誘導(dǎo)情況。

1.2.4 不同激素對(duì)甘草帶芽莖段叢生芽誘導(dǎo)和增殖的影響 （1）6BA對(duì)甘草帶芽莖段叢生芽形成的影響。以MS+3%蔗糖+0.8%瓊脂為基本培養(yǎng)基，6BA濃度分別為：0.2、0.6、1.0、1.4、1.8、2.2 mg·L-1，每瓶接種4個(gè)帶芽莖段（0.7 cm），每種處理重復(fù)3次。（2）KT對(duì)甘草帶芽莖段叢生芽形成的影響。以MS+3%蔗糖+0.8%瓊脂為基本培養(yǎng)基， KT濃度分別為： 0.2、0.6、1.0、1.4、1.8、2.2 mg·L-1，每瓶接種4個(gè)帶芽莖段（0.7 cm），每種處理重復(fù)3次。（3）6BA對(duì)甘草帶芽莖段叢生芽增殖的影響。以MS+3%蔗糖+0.8%瓊脂為基本培養(yǎng)基，6BA濃度分別為： 0.2、0.6、1.0、1.4、1.8、2.2 mg·L-1，每瓶接種4個(gè)帶芽莖段（0.7 cm），每種處理重復(fù)3次。

增值倍數(shù) =分化出叢生芽個(gè)數(shù)/接種帶芽莖段數(shù)量

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用Excel 2010進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和繪制圖表，采用SPSS19軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同激素配比對(duì)甘草下胚軸愈傷組織誘導(dǎo)的影響

由表2可知，處理1愈傷組織誘導(dǎo)率最高為75%，褐化率為16.67%;處理3誘導(dǎo)率為66.67%，褐化率為16.67%。各組處理愈傷組織生長(zhǎng)狀況不同，處理1有3塊達(dá)到最好（+++），3塊較好（++），1塊長(zhǎng)勢(shì)一般（+），2塊褐化，處理3有4塊最好（+++），2塊一般（+），2塊褐化，而處理2誘導(dǎo)率為33.33%，顯著低于其他組合。方差分析表明，處理1與處理2和處理4在愈傷組織塊數(shù)上存在顯著差異，與其他組合沒有顯著差異;處理1與處理2在誘導(dǎo)率上存在極顯著差異，與處理4在誘導(dǎo)率上存在顯著差異，與其他組合沒有顯著差異;雖然處理3與其他組合在愈傷組織塊數(shù)和誘導(dǎo)率上沒有顯著差異，但其誘導(dǎo)率較高，愈傷組織生長(zhǎng)狀態(tài)較好，且呈現(xiàn)疏松砂糖狀。綜合分析，選擇MS+6BA 1.0 mg·L-1+2，4D 2.0 mg·L-1和MS+6BA 1.0 mg·L-1+NAA 2.0 mg·L-1作為繼代培養(yǎng)的激素組合較為有利（圖1）。

2.2 6BA對(duì)甘草帶芽莖段愈傷組織誘導(dǎo)的影響

由表3可知，6BA濃度為0.2 mg·L-1和0.5 mg·L-1時(shí)，甘草帶芽莖段愈傷組織的生長(zhǎng)狀態(tài)較好，褐化率維持在較低水平，分別為8.33%和25.00%，6BA濃度為1.0、1.5、2.0 mg·L-1時(shí)，愈傷組織生長(zhǎng)狀態(tài)不如前者，褐化率也顯著高于前者，且伴有不同程度的木質(zhì)化;6BA濃度在0.2～2.0 mg·L-1時(shí)，甘草帶芽莖段均有愈傷組織形成，當(dāng)6BA濃度為0.2 mg·L-1時(shí)形成的愈傷組織最好，白色砂糖狀較多，褐化較少（圖2）。

2.3 6BA對(duì)甘草帶芽莖段叢生芽形成的影響

由表4可知，6BA濃度為0.2 mg·L-1和1.4 mg·L-1的培養(yǎng)基中，均沒有叢生芽產(chǎn)生;6BA濃度為 1.8 mg·L-1時(shí)，帶芽莖段株高、莖節(jié)數(shù)、真葉片數(shù)均達(dá)到最大，分別為9.87 cm、5.79個(gè)、6.44片，與其他濃度存在極顯著差異;綜上分析，6BA濃度為1.8 mg·L-1時(shí)對(duì)于甘草帶芽莖段的生長(zhǎng)最為有利。

2.4 KT對(duì)甘草帶芽莖段叢生芽形成的影響

甘草帶芽莖段在表5所示的KT濃度作用下均無叢生芽產(chǎn)生，但卻長(zhǎng)出根和愈傷組織。由表5可知，KT濃度為2.2 mg·L-1時(shí)，帶芽莖段植株高、莖節(jié)數(shù)、真葉片數(shù)均達(dá)到最大，分別為9.24 cm、4.79個(gè)、5.37片，其中株高與其他濃度存在極顯著差異;KT濃度在1.0～2.2 mg·L-1范圍內(nèi)，隨著KT濃度增加，帶芽莖段的株高、莖節(jié)數(shù)、真葉數(shù)均呈現(xiàn)升高趨勢(shì);說明KT對(duì)叢生芽誘導(dǎo)作用較小，但對(duì)帶芽莖段的生長(zhǎng)、生根和愈傷組織誘導(dǎo)均有促進(jìn)作用（圖3）。

2.5 6BA對(duì)甘草帶芽莖段叢生芽增殖的影響

由表6可知，6BA濃度為0.2 mg·L-1和1.4 mg·L-1均沒有叢生芽產(chǎn)生，這與叢生芽誘導(dǎo)的結(jié)果一致;6BA濃度為2.2 mg·L-1的培養(yǎng)基中，叢生芽增殖倍數(shù)為3.13倍，為各濃度培養(yǎng)基中最高;6BA濃度在1.0～2.2 mg·L-1范圍內(nèi)，隨著6BA濃度增加，叢生芽的增殖倍數(shù)呈升高趨勢(shì);6BA濃度在0.6～1.8 mg·L-1范圍內(nèi)，隨著6BA濃度增加，叢生芽高及真葉數(shù)呈升高趨勢(shì)（圖4）。

3 討論與結(jié)論

種子萌發(fā)是植物體生活史中重要的階段， 直接影響到植物體后期的生長(zhǎng)發(fā)育和形態(tài)建成[9]，甘草種子的萌發(fā)受到溫度、光照、水分、pH值、赤霉素和貯藏時(shí)間等條件的影響[10]。本試驗(yàn)采用未添加激素的MS培養(yǎng)基作為種子萌發(fā)的培養(yǎng)基，從而進(jìn)一步獲得無菌苗。愈傷組織的誘導(dǎo)率受一些內(nèi)部和外部因子的影響，包括：基因型、營(yíng)養(yǎng)成分、激素、生理狀態(tài)和物理因子等。研究表明，甘草下胚軸、子葉、胚根均可作為外植體來誘導(dǎo)愈傷組織，其中下胚軸的愈傷組織無論從狀態(tài)還是長(zhǎng)勢(shì)均為最好[11]。本研究采用甘草下胚軸為外植體，愈傷誘導(dǎo)率最高可達(dá)77.78%，這與已有報(bào)道一致。甘草帶芽莖段誘導(dǎo)叢生芽試驗(yàn)中，僅選取6BA和KT兩種植物激素，其他激素仍可做深入研究。

在植物組培快繁中，生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素等生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)培養(yǎng)物的誘導(dǎo)分化起重要作用[12]。張洋等[13]研究顯示MS+6BA 1.0 mg·L-1 +2，4D 2.0 mg·L-1唐古特大黃外植體出愈率最高，且生長(zhǎng)快;楊曼等[14]研究表明在富民枳組織培養(yǎng)時(shí)，MS+6BA 1.0 mg·L-1 +NAA 2.56 mg·L-1時(shí)富民枳愈傷情況最佳;文沛玲等

[15]在研究不同濃度6BA對(duì)黑麥草種子出愈率的影響時(shí)得出，在一定的濃度范圍內(nèi)，MS+6BA能夠提高多年生黑麥草愈傷組織的出愈率，但隨著濃度的增加反而會(huì)降低黑麥草愈傷組織的出愈率，且6BA濃度均處于較低濃度水平;魏曉雪等[16]研究表明帶芽莖段為百里香組培的最佳外植體材料;劉雪蓮等[17]只添加細(xì)胞分裂素6BA的MS培養(yǎng)基叢生芽誘導(dǎo)率高于添加了細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素的MS培養(yǎng)基， 但芽叢長(zhǎng)勢(shì)弱;張延紅等[18]研究顯示6BA 的濃度對(duì)叢生芽的顏色、數(shù)目、生長(zhǎng)速度和健壯度的影響十分顯著;楊瀾等[19]研究表明濃度為2.0 mg·L-1的

6BA處理后的葉藝叢生芽經(jīng)過成苗培養(yǎng)后，其芽苗的生物增長(zhǎng)量均高于6BA的其他濃度處理。KT在植物組織培養(yǎng)中具有促進(jìn)生根的作用，但芽苗莖節(jié)間細(xì)長(zhǎng)，葉片狹長(zhǎng)且根細(xì)長(zhǎng)，芽苗并不健壯，不利于后期的出瓶移栽。

本試驗(yàn)研究了不同激素配比對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)及帶芽莖段叢生芽增殖的影響，結(jié)果表明，激素對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)作用明顯，在下胚軸誘導(dǎo)愈傷組織的試驗(yàn)中，MS+6BA 1.0 mg·L-1+2，4D 2.0 mg·L-1出愈率最高，但褐化率也較高，MS+6BA 1.0 mg·L-1+NAA 2.0 mg·L-1出愈率為其次，但褐化率較低，且愈傷組織長(zhǎng)勢(shì)比MS+6BA 1.0 mg·L-1+2，4D 2.0 mg·L-1好;低濃度的6BA對(duì)甘草帶芽莖段愈傷組織誘導(dǎo)有利，隨著濃度的升高，雖然愈傷組織誘導(dǎo)率均為100%，但褐化明顯，長(zhǎng)勢(shì)不好;6BA濃度為1.8 mg·L-1時(shí)甘草帶芽莖段的株高、節(jié)段、節(jié)間距、真葉各項(xiàng)指標(biāo)均最高，說明此濃度對(duì)于甘草帶芽莖段的生長(zhǎng)最為有利;不同濃度6BA和KT對(duì)帶芽莖段叢生芽誘導(dǎo)的結(jié)果表明：6BA對(duì)叢生芽的誘導(dǎo)有利，而KT的作用較小。本試驗(yàn)為甘草快繁提供了理論依據(jù)，為快繁體系的建立和優(yōu)選奠定基礎(chǔ)，對(duì)甘草的工廠化規(guī)模生產(chǎn)、加快產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程起到了促進(jìn)作用。

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（責(zé)任編輯：柯文輝）

收稿日期：2021-08-02

作者簡(jiǎn)介：李偉，男，1984年生，碩士，工程師，主要從事植物生理學(xué)與植物生物技術(shù)研究。

*通信作者：張東向，男，1963年生，碩士，教授，主要從事植物生理學(xué)與植物生物技術(shù)研究（E-mail：zhangdx1019@163.com）。

基金項(xiàng)目：黑龍江省省屬高等學(xué)?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)科研項(xiàng)目 （YSTSXK201887）;齊齊哈爾市科技攻關(guān)項(xiàng)目（SFGG201575）;齊齊哈爾大學(xué)研究生創(chuàng)新項(xiàng)目（YJSCX2019044）。