響應(yīng)面法優(yōu)化枯草芽孢桿菌發(fā)酵玉米秸稈產(chǎn)腐植酸條件

摘 要：為探索枯草芽孢桿菌發(fā)酵玉米秸稈產(chǎn)腐植酸的最佳條件。以玉米秸稈與麩皮配比、尿素添加量、培養(yǎng)基初始pH為試驗(yàn)因素，以發(fā)酵產(chǎn)物腐植酸含量為指標(biāo)，根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果選定因素水平，采用Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)法，研究各因素交互作用及其對發(fā)酵產(chǎn)腐植酸的影響，擬合獲得二次多項(xiàng)式回歸模型。結(jié)果表明：枯草芽孢桿菌發(fā)酵玉米秸稈產(chǎn)腐植酸的最佳條件為玉米秸稈與麩皮配比0.95∶1、尿素添加量0.81%、培養(yǎng)基初始pH 6.1，在37℃條件下發(fā)酵7 d，發(fā)酵產(chǎn)物腐植酸含量為19.58%，較優(yōu)化前腐植酸含量提高了38.3%。

關(guān)鍵詞：腐植酸;玉米秸稈;枯草芽孢桿菌;響應(yīng)面法;副產(chǎn)物綜合利用

中圖分類號(hào)：S 816.6 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：0253-2301（2021）10-0047-05

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2021.10.010

Optimization of Humic Acid Production from Corn Straw Fermented byBacillus Subtilis Based on Response Surface Methodology

CHEN Yong-qiang

（Fujian Main Station of Agricultural Product Processing and Promotion， Fuzhou， Fujian 350003， China）

Abstract： In order to explore the best conditions for humic acid production from corn straw fermented by Bacillus subtilis， the proportion of corn straw and bran， the additive amount of urea and the initial pH of culture medium were taken as the experimental factors， and the content of humic acid was taken as the index. The factor levels were selected according to the results of single factor experiment， and the method of Box-Benhnken experimental design was used to study the interaction of various factors and their effects on humic acid， thus to obtain the quadratic polynomial regression model. The results showed that the optimal conditions of humic acid production from corn straw fermented by Bacillus subtilis were as follows： the proportion of corn straw and bran was 0.95∶1， the additive amount of urea was 0.81%， and the initial pH of culture medium was 6.1. After 7 days of fermentation at 37℃， the humic acid content of the fermentation products was 19.58%， which was 38.3% higher than that before the optimization.

Key words： Humic acid; Corn straw; Bacillus subtilis; Response surface methodology; Comprehensive utilization of by-products

玉米是我國重要糧食作物，每年產(chǎn)生大量玉米秸稈，如何提高這一農(nóng)業(yè)廢棄物的綜合利用水平，減少環(huán)境污染和資源浪費(fèi)，實(shí)現(xiàn)變廢為寶、化害為利，具有非常重要的意義[1-3]。利用農(nóng)業(yè)廢棄物生產(chǎn)生物腐植酸是農(nóng)業(yè)資源化和功能化的一個(gè)重要渠道，生物腐植酸活性比天然腐植酸高，作為一種生長調(diào)節(jié)劑，在種養(yǎng)殖等領(lǐng)域具有廣泛用途[4-9]。當(dāng)前生物腐植酸的發(fā)酵方法仍以人工堆建自然發(fā)酵為主，存在產(chǎn)量低、產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定等問題[10-12]。本研究對前期篩選獲得的具有腐植酸發(fā)酵能力的枯草芽孢桿菌進(jìn)行發(fā)酵條件研究，以期為玉米秸稈的綜合利用探索渠道，為利用玉米秸稈生產(chǎn)腐植酸提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 原料與菌株

玉米秸稈、麩皮采自龍海市白水鎮(zhèn)，玉米秸稈烘干粉碎備用。

枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis從市售有機(jī)肥中篩選獲得。

1.2 試劑與培養(yǎng)基

菌種活化培養(yǎng)基與種子液培養(yǎng)基 [13]：牛肉膏 3 g·L-1，NaCl 5 g·L-1，蛋白胨 10 g·L-1，瓊脂15 g·L-1，pH 7.0～7.2，121℃蒸汽滅菌20 min。種子液培養(yǎng)基不添加瓊脂。

基礎(chǔ)發(fā)酵培育基：玉米秸稈粉與麩皮重量1∶1，加水?dāng)嚢杈鶆?，水分含量控制?5%左右，pH自然，121℃滅菌20 min。

試劑：重鉻酸鉀、硫酸亞鐵銨、鄰菲羅啉、濃硫酸、氫氧化鈉均為分析純。

1.3 主要儀器

BHC1300型超凈工作臺(tái)（蘇靜集團(tuán)安泰公司），LRH型生化培養(yǎng)箱（上海一恒科技有限公司），THZ2氣浴式恒溫?fù)u床（智城分析儀器制造有限公司），U2910型分光光度計(jì)（日本HITACHI公司），F(xiàn)Z102型植物粉碎機(jī)（天津泰斯特儀器有限公司）。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 種子液制備 將菌種從斜面轉(zhuǎn)接到活化平板，37℃條件下生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，然后轉(zhuǎn)接3環(huán)菌種到含100 mL種子培養(yǎng)基的 250 mL錐形瓶中，37℃、200 r·min-1搖床培養(yǎng)24 h，取培養(yǎng)液與滅菌生理鹽水混合，調(diào)節(jié)菌種液OD600在（1.0±0.1）作為發(fā)酵種子液。

1.4.2 發(fā)酵條件 500 mL錐形瓶裝發(fā)酵培養(yǎng)基100 g，接種5 mL種子液，混合均勻，37℃條件下生化培養(yǎng)箱發(fā)酵7 d，其間每隔2 d攪拌1次。本試驗(yàn)內(nèi)容均在此條件下發(fā)酵。

1.4.3 單因素試驗(yàn) （1）玉米秸稈與麩皮配比研究。調(diào)整基礎(chǔ)培養(yǎng)基玉米秸稈與麩皮比例，兩者重量比分別2∶1、1.5∶1、1∶1、1∶1.5、1∶2，每個(gè)試驗(yàn)做3個(gè)平行，進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)腐植酸研究，探索較優(yōu)主要發(fā)酵原料配比。（2）尿素添加量研究。在前期無機(jī)氮對發(fā)酵產(chǎn)腐植酸影響的研究中發(fā)現(xiàn)添加尿素有較好的促進(jìn)作用，因此在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)中，以100 g玉米秸稈與麩皮基準(zhǔn)，分別添加0.5%、0.75%、1%、1.25%、1.5%尿素，每個(gè)試驗(yàn)做3個(gè)平行，探討不同尿素添加量對發(fā)酵產(chǎn)腐殖酸的影響。（3）培養(yǎng)基初始pH研究。調(diào)節(jié)基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH分別為4、4.5、5、5.5、6，每個(gè)試驗(yàn)做3個(gè)平行，探討不同初始pH對發(fā)酵產(chǎn)腐殖酸的影響。

1.4.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取玉米秸稈與麩皮添加質(zhì)量比（X1）、尿素添加量（X2）、培養(yǎng)基初始pH（X3）3個(gè)試驗(yàn)因素的較優(yōu)區(qū)域，以腐植酸含量為響應(yīng)值，使用Designer-Expert 8.0.6 Trial軟件，進(jìn)行三因素三水平Box-Benhnken Design（BBD）中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)[14]（試驗(yàn)因素水平和編碼見表1），通過回歸分析優(yōu)化枯草芽孢桿菌發(fā)酵玉米秸稈產(chǎn)腐植酸條件。

1.4.5 測定方法 采用重鉻酸鉀氧化法[15]測定發(fā)酵產(chǎn)物的腐植酸含量，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì)，數(shù)值以%表示。試驗(yàn)樣品發(fā)酵后60℃烘干2 h，經(jīng)粉碎過篩后作為測定樣品;未接種的培養(yǎng)基同樣處理后作為空白樣品;結(jié)果計(jì)算不再扣除氯離子含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 玉米秸稈與麩皮配比對產(chǎn)腐植酸的影響 由圖1可知，發(fā)酵產(chǎn)物腐植酸含量隨著玉米秸稈與麩皮添加量比值的降低，呈先快速增加后緩慢下降的變化趨勢。在玉米秸稈與麩皮添加量比值為1∶1時(shí)，發(fā)酵產(chǎn)物腐植酸含量最高，為14.16%。

2.1.2 尿素添加量對產(chǎn)腐植酸的影響 由圖2可知，發(fā)酵產(chǎn)物腐殖酸含量隨著尿素添加量的增加，呈量先增后減的變化趨勢。當(dāng)尿素添加量為0.75%時(shí)，發(fā)酵產(chǎn)物腐殖酸含量最高，為18.15%。表明添加適量的尿素對枯草芽孢桿菌發(fā)酵玉米秸稈產(chǎn)腐植酸有促進(jìn)作用，當(dāng)添加量較大時(shí)起抑制作用，試驗(yàn)中尿素添加量為1.5%時(shí)，發(fā)酵產(chǎn)物腐植酸含量為13.51%，比最高值下降了25.61%。

2.1.3 培養(yǎng)基初始pH對產(chǎn)腐植酸的影響 從圖3可知，發(fā)酵產(chǎn)物腐殖酸含量隨著培養(yǎng)基初始pH值的升高，呈先升后降的變化趨勢，在培養(yǎng)基初始pH值為6時(shí)發(fā)酵產(chǎn)物腐植酸含量最高，為15.39%。表明，該枯草芽孢桿菌比較適合在弱堿性條件下發(fā)酵玉米秸稈產(chǎn)腐植酸，過酸環(huán)境下產(chǎn)腐植酸能力受到抑制。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果及分析

2.2.1 擬合方程和方差分析 BBD試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。應(yīng)用Design-Expert 軟件對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析（表3），擬合多項(xiàng)式回歸模型并作真實(shí)響應(yīng)面擬合圖。方差分析結(jié)果表明：模型P<0.000 1，說明模型極顯著;失擬項(xiàng)P=0.288 0>0.05，說明模型擬合程度好，可以用該模型進(jìn)行分析和預(yù)測。擬合腐植酸含量（Y）的多項(xiàng)式回歸方程為：

Y=19.30-1.08X1+0.37X2+0.32X3-0.028X1X2+0.005X1X3-0.075X2X3-1.63X12-0.75X22-0.71X32

一次項(xiàng)X1（玉米秸稈與麩皮比重）、X2（尿素添加量）、X3（發(fā)酵初始pH）對發(fā)酵產(chǎn)腐植酸的影響均為極顯著（P<0.000 1），二次項(xiàng)X12、X22、X32對發(fā)酵產(chǎn)腐植酸的影響均極顯著（P<0.000 1），交互項(xiàng)中X2X3對發(fā)酵產(chǎn)腐植酸的影響顯著（P<0.01）、其他兩個(gè)交互項(xiàng)對發(fā)酵產(chǎn)腐植酸的影響不顯著。

2.2.2 因素交互作用分析 由圖4可知，隨著尿素添加量的增加和培養(yǎng)基pH的提高，發(fā)酵產(chǎn)物腐植酸含量呈先升高后下降的變化趨勢，表明在某一尿素添加量和某一培養(yǎng)基初始pH值條件下，發(fā)酵產(chǎn)物腐植酸含量具有極大值。

圖4 尿素添加量和培養(yǎng)基初始pH對發(fā)酵的影響

Fig.4 Effects of the additive amount of urea and the initial pH of culture medium on fermentation

2.2.3 響應(yīng)面優(yōu)化發(fā)酵條件及驗(yàn)證 通過軟件對回歸模型求極值并將標(biāo)準(zhǔn)變量轉(zhuǎn)換為實(shí)際變量，獲得枯草芽孢桿菌發(fā)酵玉米秸稈產(chǎn)腐植酸的最佳條件為：玉米秸稈與麩皮添加量比值為0.95∶1，尿素添加量為0.81%，培養(yǎng)基初始pH為6.1，發(fā)酵產(chǎn)物腐植酸含量預(yù)測值為19.55%。在該發(fā)酵條件下，經(jīng)5次重復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn)，測得發(fā)酵產(chǎn)物腐植酸含量均值為19.58%，與預(yù)測值基本相符，說明該模型可以很好地預(yù)測實(shí)際發(fā)酵情況。

3 結(jié)論與討論

可以利用枯草芽孢桿菌發(fā)酵玉米秸稈產(chǎn)腐植酸，提高玉米秸稈綜合利用價(jià)值，減少農(nóng)業(yè)廢棄物帶來環(huán)境污染和資源浪費(fèi)。單因素試驗(yàn)表明：玉米秸稈與麩皮添加量比值、尿素添加量、培養(yǎng)基初始pH的變化，均會(huì)影響枯草芽孢桿菌發(fā)酵玉米秸稈產(chǎn)腐植酸的能力。隨著麩皮添加量的增加腐植酸含量先升后降，這可能是玉米秸稈以碳源物質(zhì)為主，而麩皮含有更為豐富的蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、維生素等營養(yǎng)物質(zhì)，添加適量的麩皮可以促進(jìn)菌體生長代謝產(chǎn)腐植酸，但麩皮添加量較大時(shí)菌體以擴(kuò)大生物量為主，腐植酸產(chǎn)量反而下降;隨著尿素添加量的增加腐植酸含量先升后降，這可能是尿素作為基礎(chǔ)培育基的補(bǔ)充氮源被菌體利用，添加適量的尿素促進(jìn)了菌體生長代謝從而增加了腐植酸產(chǎn)能，但添加量過大時(shí)尿素對菌體形成毒害作用，抑制了菌體的生長代謝;隨著培養(yǎng)基初始pH的提升腐植酸含量先升后降，這可能是該菌較適生長環(huán)境為弱堿性，當(dāng)培養(yǎng)基過酸或過堿時(shí)，菌體細(xì)胞膜通透性、膜內(nèi)酶結(jié)構(gòu)和功能受到影響，抑制了菌體對營養(yǎng)基質(zhì)的利用和代謝產(chǎn)物的合成與積累。

通過響應(yīng)曲面法進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)和分析，結(jié)果表明：玉米秸稈與麩皮添加量比值、尿素添加量、培養(yǎng)基初始pH對發(fā)酵產(chǎn)物腐植酸含量的影響極顯著，尿素添加量與培養(yǎng)基初始pH的交互作用對發(fā)酵產(chǎn)物腐植酸含量的影響顯著;多項(xiàng)式回歸模型擬合程度高，可以用來優(yōu)化枯草芽孢桿菌發(fā)酵玉米秸稈產(chǎn)腐植酸的最佳條件、預(yù)測發(fā)酵產(chǎn)物腐植酸含量;優(yōu)化獲得最佳發(fā)酵條件為玉米秸稈與麩皮添加量比值0.95∶1、尿素添加量0.81%、培養(yǎng)基初始pH 6.1，經(jīng)驗(yàn)證試驗(yàn)測定發(fā)酵產(chǎn)物腐植酸含量為19.58%，較優(yōu)化前腐植酸含量提高了38.3%。

參考文獻(xiàn)：

[1]王立新.玉米秸稈綜合利用現(xiàn)狀和發(fā)展前景[J].農(nóng)業(yè)開發(fā)與裝備，2021（1）：66-67.

[2]唐英迪，袁洪印.淺談我國玉米秸稈綜合利用現(xiàn)狀及存在的問題[J].農(nóng)業(yè)與技術(shù)，2020（13）：43-44.

[3]徐瑩瑩，劉玉濤，王宇先，等.玉米秸稈綜合利用途徑探討[J].黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016（7）：145-149.

[4]奉靈波，周瑞芳，趙辰龍，等.利用甘蔗糖蜜酒精發(fā)酵液生產(chǎn)腐植酸的菌種鑒定及發(fā)酵條件研究[J].中國生物工程雜志，2012（10）： 80-85.

[5]VOLPI M，CORZO I，BASTOS R G，et al.Production of humic acids by solid-state fermentation of Trichoderma reesei in raw oil palm empty fruit bunch fibers[J].3 Biotech，2019，9（11）：1-10.

[6]安華.淺析腐植酸及腐植酸類肥料在農(nóng)業(yè)中的應(yīng)用[J].內(nèi)蒙古石油化工，2012（24）：21-22.

[7]張麗麗，劉德興，史慶華，等.黃腐酸對番茄幼苗適應(yīng)低磷脅迫的生理調(diào)控作用[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2018，51（8）：1547-1555.

[8]YILDIRIM ERTAN，EKINCI MELEK， TURAN METIN，et al.Humic+Fulvic acid mitigated Cd adverse effects on plant growth，physiology and biochemical properties of garden cress[J].Scientific Reports，2021，11（1）：8040.

[9]MELANIE A TRENFIELD，CEIWEN J PEASE，SAMANTHA L WALKER，et al.Assessing the Toxicity of Mine-Water Mixtures and the Effectiveness of Water Quality Guideline Values in Protecting Local Aquatic Species

[J].Environmental Toxicology and ChemistryVolume，2021，40（8）：2334-2346.

[10]呂志偉， 呼曉明.利用菌群LCM9發(fā)酵玉米秸稈生產(chǎn)生化黃腐酸及其應(yīng)用研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2021，38（35）：20466-20468.

[11]韓立新，曾憲成.腐植酸及其鈉鹽在畜牧業(yè)中的應(yīng)用[J].腐植酸，2012（2）：1-7.

[12]王秀飛，張維東，魏秀英，等.秸稈發(fā)酵生產(chǎn)生化黃腐酸的特點(diǎn)及應(yīng)用[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2013（19）：261-262.

[13]趙亞華.生物化學(xué)與分子生物學(xué)試驗(yàn)技術(shù)教程[M].北京：高等教育出版社，2005：53-62，251-253.

[14]CHAUDHARY ASMA，HUSSAIN ZAWAR，AIHETASH-AMAYESHA，et al.Pomegranate peels waste hydrolyzate optimization by Response Surface Methodology for Bioethanol production[J].Saudi Journal of Biological Sciences，2021，28（9）：4867-4875.

[15]四川省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局.DB51/T 842-2008肥料中腐植酸含量的測定重鉻酸鉀氧化法[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2008.

（責(zé)任編輯：柯文輝）

收稿日期：2021-09-09

作者簡介：陳勇強(qiáng)，男，1986年生，工程師，主要從事農(nóng)產(chǎn)品加工推廣。