發(fā)酵麥麩阿魏酰低聚糖的純化工藝及其心臟保護作用研究

陳秋燕 王 園 尹 娜 王瑞芳 郝希然 安曉萍 王 勤 齊景偉

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院1，呼和浩特 010018) (內(nèi)蒙古自治區(qū)草食家畜飼料工程技術(shù)研究中心2，呼和浩特 010018) (內(nèi)蒙古自治區(qū)藥品檢驗研究院3，呼和浩特 010010)

齊景偉，男， 1966年出生，教授，生物飼料的研發(fā)與應(yīng)用

小麥為禾本科的單子葉植物，是我國重要的經(jīng)濟農(nóng)作物之一；麥麩是一種包裹在小麥穎果胚乳和胚芽中的復(fù)合植物體，麥黃色，呈片狀或粉狀，是小麥加工過程的主要副產(chǎn)品，年產(chǎn)量高達2 000萬t以上[1,2]。研究表明麥麩的組成中大部分為非淀粉多糖，包括阿拉伯木聚糖、木葡聚糖和纖維素，其中木聚糖占干物質(zhì)質(zhì)量40%，此外還含有大量的酚醛酸、木質(zhì)素和一些蛋白質(zhì)等。存在于細胞壁中的酚酸被認為在多糖與木質(zhì)素通過酯鍵和醚鍵的交聯(lián)以及多糖鏈的交聯(lián)中起著重要作用[3-5]。阿魏酸是谷物中含量最豐富的酚酸，也是麥麩中重要的功效成分之一。阿魏酰低聚糖 (Feruloylated oligosaccharides, FOs) 是由低聚糖中不同位置的糖羥基與阿魏酸羧基酯化形成的一類阿魏酰衍生物[6]，兼具這兩種物質(zhì)的生理功能，且因其結(jié)構(gòu)中特殊酯鍵的存在，F(xiàn)Os具有比游離阿魏酸更強的抗氧化作用[7,8]，并具有較強的免疫調(diào)節(jié)、益生和減輕糖尿病綜合癥[8-10]等多種作用，對FOs的研究與利用越來越受到人們的重視。目前FOs主要采用酸水解法[11]、酶水解法[12]和生物發(fā)酵法[13]等進行提取，F(xiàn)Os粗提液中含有部分像色素和脂溶性成分等的雜質(zhì)[14]，致使FOs含量偏低，影響其功效的發(fā)揮，因此需對粗提液進行富集純化，以提高FOs的純度, 并評價其生理功能。

大孔吸附樹脂由于其獨特的多孔結(jié)構(gòu)和較大的比表面積，已被廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物有效成分的分離、純化，是吸附性和分子篩性分離原理相結(jié)合的分離材料[15-17]，具有選擇性好、分離效果好、再生處理方便、吸附速度快等特點[18]。有研究表明，最適用于分離純化FOs的大孔吸附樹脂為Amberlite XAD-2[19-21]，F(xiàn)Os是非極性的芳香族化合物，Amberlite XAD-2 對芳香族化合物有很強的吸附能力，能夠吸附FOs中的阿魏?；?，達到分離純化的效果。Sephadex LH-20是由葡聚糖 G-25羥丙基化加工而成，是基于被分離物質(zhì)分子質(zhì)量及其與酚酸的相互作用分離的技術(shù)[10]。因此，本實驗在前期獲得發(fā)酵麥麩FOs粗提物的基礎(chǔ)上，以吸附率與解吸率為評價指標，利用Amberlite XAD-2型號大孔吸附樹脂通過單因素篩選出發(fā)酵麥麩FOs的分離純化工藝條件，用Sephadex LH-20 葡聚糖凝膠進一步純化發(fā)酵麥麩 FOs的工藝條件，獲得最佳的純化條件，同時探討了經(jīng)分離純化后的發(fā)酵麥麩 FOs對斑馬魚心臟損傷的保護作用，以期為麥麩FOs生物活性研究以及麥麩的高效利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實驗所用的麥麩均購于市場；實驗用斑馬魚成魚購于國家斑馬魚資源中心(中國，武漢)；硼砂、甘氨酸、無水乙醇、氫氧化鈉、二甲基亞砜(DMSO)和間氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽(MS222)；大孔吸附樹脂Amberlite XAD-2；SephadexLH-20過濾凝膠；特非那。

紫外可見光光度計，電熱恒溫水浴鍋，旋轉(zhuǎn)氣浴恒溫振蕩器， SW-CJ 超凈工作臺， LRH-250F生化培養(yǎng)箱， QYC-200恒溫培養(yǎng)搖床， IX51 奧林巴斯倒置顯微鏡，微孔板分光光度計。

1.2 實驗方法

1.2.1 發(fā)酵麥麩FOs粗提液的制備

將發(fā)酵麥麩濕樣置于45 ℃鼓風干燥箱中烘干48 h后進行粉碎，稱取粉碎干燥發(fā)酵麥麩以料水比1∶10(g/mL)加入蒸餾水中，80 ℃熱水浸提30 min，5 000 r/min離心10 min，取上清液，采用sevage法對上清液進行去蛋白，用80%乙醇進行沉淀，4 ℃靜置12 h，離心取沉淀進行減壓濃縮，濃縮液冷凍干燥，備用[22]。

1.2.2 發(fā)酵麥麩FOs的測定

利用雙波長法[23]測定FOs濃度，準確稱取發(fā)酵麥麩FOs 1 000 mg溶于100 mL蒸餾水中，將發(fā)酵麥麩FOs溶液與硼砂-甘氨酸緩沖溶液(0.1 mol/L，pH=10)按1∶9比例混合，分別于345 nm和375 nm處測定吸光度值。根據(jù)FA的摩爾吸光系數(shù)(M-1cm-1)：ε′345=19 662，ε′375=7 630和FOs的摩爾吸光系數(shù)(M-1cm-1)：ε345=23 064，ε375=31 430，計算FOs濃度。

C=[(ε′345×A375-ε′375×A345)b/(ε′345×ε375-ε345×ε′375 )]/C0

式中：C為發(fā)酵麥麩中FOs濃度/nmol/g；b為比色皿厚度/cm；A345為波長345 nm處OD值；A375為波長375 nm處OD值；C0為發(fā)酵麥麩FOs粗溶液質(zhì)量濃度/mg/mL。

1.2.3 大孔吸附樹脂Amberlite XAD-2的預(yù)處理

大孔吸附樹脂預(yù)處理參照周俊良等[24]的方法并稍作修改，利用蒸餾水洗去大孔吸附樹脂的破碎樹脂和雜質(zhì)，置于60 ℃鼓風干燥箱中烘干水分后用95%乙醇中浸泡24 h，使其充分溶脹，然后反復(fù)用蒸餾水將樹脂洗至無白色渾濁且無乙醇味，置于60 ℃鼓風干燥箱中烘干4 h至質(zhì)量恒定，取出大孔吸附樹脂待用。

1.2.4 大孔吸附樹脂Amberlite XAD-2吸附率和解吸率的測定

準確稱量2.0 g預(yù)處理好的大孔吸附樹脂Amberlite XAD-2置于錐形瓶中，加入30 mL發(fā)酵麥麩FOs粗提液，用封口膜將瓶口封緊，室溫下置于120 r/min旋轉(zhuǎn)氣浴恒溫振蕩器中振蕩12 h，待充分吸附后，將大孔吸附樹脂過濾移除，取上清液，按照1.2.2測定吸附后溶液中FOs的濃度，按照式(1)計算大孔吸附樹脂的吸附率。吸附實驗結(jié)束后，將過濾后得到的大孔吸附樹脂Amberlite XAD-2放入錐形瓶中，加入30 mL 50%乙醇解吸液，用封口膜將瓶口封緊，室溫下置于120 r/min旋轉(zhuǎn)氣浴恒溫振蕩器中振蕩12 h，振蕩結(jié)束后將大孔吸附樹脂過濾除去，取上清液，按照1.2.2測定解吸后溶液中FOs的濃度，按照公式(2)計算大孔吸附樹脂的解吸率[25]。

A=(C0-C1)/C0×100%

(1)

D=(C2×V2)/(C0-C1)×V1×100%

(2)

公式中：A為吸附率/%；D為解吸率/%；C0為吸附前發(fā)酵麥麩FOs粗提液質(zhì)量濃度/mg/mL；C1為吸附后發(fā)酵麥麩FOs質(zhì)量濃度/mg/mL；C2為解吸后溶液中發(fā)酵麥麩FOs質(zhì)量濃度/mg/mL；V2為解吸溶液體積/mL。

1.2.5 大孔吸附樹脂Amberlite XAD-2靜態(tài)吸附與洗脫條件優(yōu)化

1.2.5.1 大孔吸附樹脂Amberlite XAD-2靜態(tài)吸附條件的優(yōu)化

根據(jù)發(fā)酵麥麩FOs的純化工藝，分別考察上樣液濃度和上樣液 pH對大孔吸附樹脂Amberlite XAD-2靜態(tài)吸附率的影響，當上樣液 pH為5，上樣液體積為30 mL時，上樣液質(zhì)量濃度分別為：3、3.5、4、4.5、5、5.5、6 mg/mL；當上樣液質(zhì)量濃度為4 mg/mL，上樣液體積為30 mL 時，上樣液pH分別為：1、2、3、4、5、6、7、8。

1.2.5.2 大孔吸附樹脂Amberlite XAD-2靜態(tài)解吸條件的優(yōu)化

根據(jù)發(fā)酵麥麩FOs的純化工藝，分別考察解吸液體積分數(shù)和解吸液 pH對大孔吸附樹脂Amberlite XAD-2靜態(tài)解吸率的影響，當解吸液 pH為4，解吸液體積為30 mL時，解吸液體積分數(shù)分別為： 10%、30%、50%、70%、80%、90%；當解吸液體積分數(shù)為50%，解吸液體積為30 mL 時，解吸液pH分別為：1、2、3、4、5、6、7、8。

1.2.6 大孔吸附樹脂Amberlite XAD-2動態(tài)吸附與洗脫條件優(yōu)化

1.2.6.1 大孔吸附樹脂Amberlite XAD-2動態(tài)吸附條件的優(yōu)化

大孔吸附樹脂濕法裝柱，準確稱量處理后的樹脂20 g裝柱(2.25 cm×25 cm)，加入質(zhì)量濃度為4.0mg/mL、PH為4的發(fā)酵麥麩FOs上樣液進行吸附，以每10 mL收集一次流出液，按照1.2.2測定流出液中FOs的濃度，按照式(1)計算大孔吸附樹脂的吸附率。

1.2.6.2 大孔吸附樹脂Amberlite XAD-2動態(tài)解吸條件的優(yōu)化

大孔吸附樹脂濕法裝柱，準確稱量處理后的樹脂20 g裝柱(2.25 cm×25 cm)，用質(zhì)量濃度為4.0 mg/mL、PH為4的FOs發(fā)酵麥麩FOs上樣液40 mL上柱，流速為1.0 mL/min，用濃度為50%的乙醇水溶液進行解吸，每5 mL收集一次流出液，按照1.2.2測定流出液中FOs的濃度，按照式(2)計算大孔吸附樹脂的解吸率。

1.2.7 發(fā)酵麥麩FOs凝膠層析分離純化1.2.7.1 Sephadex LH-20凝膠預(yù)處理

參照曾彩鳳[21]的方法并稍作修改，將Sephadex LH-20凝膠填料用質(zhì)量分數(shù)25%乙醇溶液浸泡12 h，層析柱垂直裝柱，柱中預(yù)留 2～3 cm的蒸餾水，緩慢攪動填料，并立即沿玻棒勻速緩慢的倒入洗脫管內(nèi)約三分之一，使之在柱內(nèi)自然沉降，待從柱底到上端慢慢積實且上面澄清、洗脫床穩(wěn)定后，打開橫流泵，用質(zhì)量分數(shù)25%的乙醇溶液沖洗24 h，直至凝膠積實不再下降，最終離柱頂約5～6 cm。

1.2.7.2 洗脫劑的確定

將配制成1% FOs樣液0.25 mL加入Sephadex LH-20 層析柱(2.25 cm×25 cm)，分別用水溶液、15%乙醇、25%乙醇、35%乙醇作為洗脫劑洗脫，流速為0.5 mL/min，各收集40管，每管收集2 mL，在375 nm下檢測吸光度。

1.2.7.3 上樣體積的確定

將配制成1%質(zhì)量濃度FOs樣液各0.125、0.25、0.375、0.5 mL分別上Sephadex LH-20層析柱(2.25 cm×25 cm)，采用25%乙醇溶液洗脫，流速為0.5 mL/min，各收集40管，每管收集2 mL，在375 nm下檢測吸光度。

1.2.7.4 流速的確定

將配制成1%質(zhì)量濃度FOs樣液0.125 mL，分別上Sephadex LH-20 層析柱(2.25 cm×25 cm)，采用25%乙醇溶液，分別在流速為0.3、0.4、0.5、0.6mL/min下進行洗脫，各收集40管，每管收集2 mL，在375 nm下檢測吸光度。

1.2.8 紫外光譜分析

將發(fā)酵麥麩FOs配制成0.5 mg/mL溶液，利用紫外分光光度計在波長為200～400 nm范圍內(nèi)進行紫外吸收光譜掃描分析。

1.2.9 斑馬魚心臟保護作用實驗1.2.9.1 斑馬魚胚胎培養(yǎng)

斑馬魚親魚飼養(yǎng)于玻璃水族缸中，水溫為(28.5±1) ℃，光周期為14 h/10 h(光照/黑暗)，每日以人工配合飼料和豐年蟲交替飼喂四次，實驗所用胚胎由健康雌雄魚自然交配獲得。實驗前將體質(zhì)健壯、產(chǎn)卵跡象明顯的親魚按雌雄比例1∶2 分別置于孵化箱中，采用隔板將雌雄親魚隔開，于次日光照前移除隔板使雌雄親魚自由交配受精產(chǎn)卵，收集受精卵進行消毒和清洗，置于斑馬魚胚胎培養(yǎng)水中，放置于(28.5±1) ℃下培養(yǎng)，備用。

1.2.9.2 斑馬魚心率的測定

挑選受精且發(fā)育至24 hpf(hours post fertilization，受精后時間)的胚胎轉(zhuǎn)移至24孔板中，實驗分為5個處理組，分別為正常對照組、特非那定組(1.25 μg/mL)和給藥治療組 (1.25 μg/mL 特非那定+發(fā)酵麥麩FOs溶液)，給藥治療組質(zhì)量濃度分別為50、100、200 μg/mL，每組4個重復(fù)，每個重復(fù)10枚胚胎。所有孔中加入新的胚胎培養(yǎng)液至2 mL，置于(28.5±1)℃中繼續(xù)孵育，每隔12 h更換1次新鮮藥液。待胚胎發(fā)育至48 hpf，于倒置顯微鏡下觀測斑馬魚心率。

1.2.9.3 斑馬魚靜脈竇-動脈球(SV-BA)間距的測量

參照李智平等[25]的方法并稍作修改，將不同處理組的斑馬魚置于玻片上，加入少量麻醉劑對斑馬魚進行麻醉，使之呈側(cè)臥狀態(tài)(兩側(cè)眼、體節(jié)重合，尾部與身體處于同一水平面)，用倒置顯微鏡將斑馬魚的心臟部位進行拍照，通過 Image pro-plus 軟件測定 SV-BA 之間的間距。同時計算斑馬魚心臟損傷修復(fù)率：心臟損傷修復(fù)率=(給藥治療組斑馬魚心臟SV-BA間距-特非那定組斑馬魚心臟SV-BA間距)/(正常對照組斑馬魚SV-BA間距-模型組斑馬魚SV-BA間距)×100%。

1.3 數(shù)據(jù)分析

SAS 9.2 統(tǒng)計軟件ANOVA 模型進行單因素方差分析，用 Duncan’s 檢驗進行多重比較，統(tǒng)計結(jié)果用“平均值±標準差”來表示，測定重復(fù)次數(shù)n=3，P<0.05 為差異顯著，P<0.01 為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 大孔吸附樹脂靜態(tài)吸附和解吸結(jié)果

2.1.1 上樣液濃度的確定

上樣液濃度對大孔吸附樹脂Amberlite XAD-2吸附的影響見圖1。如圖1所示，上樣液質(zhì)量濃度在3.0～4.0 mg/mL之間時，大孔吸附樹脂AmberliteXAD-2對發(fā)酵麥麩FOs的吸附率呈現(xiàn)增加趨勢，當上樣液質(zhì)量濃度在4.0 mg/mL時，此時有最大吸附率67.69%，顯著高于上樣液質(zhì)量濃度3、3.5 mg/mL(P<0.05)；在上樣液質(zhì)量濃度未達到4.0 mg/mL時，大孔吸附樹脂上有足夠的空間來吸附溶液中的FOs，所以隨著上樣液濃度的增加有利于增大FOs與樹脂的接觸面積，對發(fā)酵麥麩FOs的吸附率也增加。大于4.0 mg/mL時，大孔吸附樹脂Amberlite XAD-2對發(fā)酵麥麩FOs的吸附率呈下降趨勢，但與4.0 mg/mL時的吸附率差異不顯著(P>0.05)，可能是上樣液濃度過高，樹脂的黏度會比較大，雜質(zhì)也會增加，易堵塞樹脂，使得大孔吸附樹脂吸附不充分[26]，造成吸附率下降，故最佳的發(fā)酵麥麩FOs上樣液質(zhì)量濃度為4 mg/mL。

注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，含有相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，下同。圖1 不同靜態(tài)吸附與解吸條件對Amberlite XAD-2 大孔吸附樹脂吸附與解吸的影響

2.1.2 上樣液pH的確定

上樣液pH對大孔吸附樹脂Amberlite XAD-2吸附率的影響見圖1。如圖1所示，上樣液pH為1～4時，大孔吸附樹脂Amberlite XAD-2對發(fā)酵麥麩FOs的吸附率差異不顯著(P>0.05)，發(fā)酵麥麩FOs上樣液pH為5時的吸附率為76.17%，低于pH為4時的87.93%，但差異不顯著(P>0.05)；繼續(xù)增大pH，大孔吸附樹脂Amberlite XAD-2對發(fā)酵麥麩FOs的吸附率呈下降趨勢，顯著低于pH為4的吸附率(P<0.05)；在酸性環(huán)境下，發(fā)酵麥麩FOs有利于保持分子形式，易于吸附；pH過小或過大都會影響大孔吸附樹脂的吸附，降低吸附率[27]，因此最佳的發(fā)酵麥麩FOs上樣液pH選擇4。

2.1.3 解吸液濃度的確定

解吸液濃度對Amberlite XAD-2大孔吸附樹脂解吸率的影響見圖1。如圖1所示，隨著乙醇溶液濃度的增加，發(fā)酵麥麩FOs的解吸率呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，乙醇溶液體積分數(shù)在50%時，解吸率最大，可達96.20%，與乙醇溶液體積分數(shù)為70%時差異不顯著(P>0.05)，但顯著高于其他組(P<0.05)。這可能是由于乙醇濃度較低難以破壞FOs與樹脂形成的氫鍵，而濃度過高則與FOs的作用力降低，濃度過大過小都不利于解吸[27]，考慮到成本節(jié)約和減少浪費，所以選擇50%乙醇作為最佳的解吸液濃度。

2.1.4 解吸液pH的確定

解吸液pH對Amberlite XAD-2大孔吸附樹脂解吸率的影響見圖1。如圖1所示，解吸液pH對發(fā)酵麥麩FOs解吸率的影響差異不顯著(P>0.05)，解吸率均在96%以上。因此選擇不調(diào)節(jié)解吸液的pH。

2.2 動態(tài)吸附與解吸

2.2.1 上樣液體積的確定

上樣液體積對大孔吸附樹脂Amberlite XAD-2吸附率的影響見圖2。如圖2所示，大孔吸附樹脂Amberlite XAD-2對發(fā)酵麥麩FOs的吸附率隨上樣液體積的升高而降低，上樣液體積為40 mL時，吸附率可達83.76%，當發(fā)酵麥麩FOs上樣液體積為50 mL時，大孔吸附樹脂Amberlite XAD-2吸附率顯著下降(P<0.05)，吸附率為80%，繼續(xù)增加發(fā)酵麥麩皮FOs上樣液體積，大孔吸附樹脂Amberlite XAD-2吸附率低于80%；上樣液體積為40 mL時，發(fā)酵麥麩FOs與樹脂接觸比較充分，使得FOs吸附率較高，因此，選擇最佳的發(fā)酵麥麩FOs上樣液體積為40 mL。

圖2 動態(tài)吸附與解吸條件對Amberlite XAD-2 大孔吸附樹脂吸附與解吸的影響

2.2.2 解吸液體積的確定

解吸液體積對Amberlite XAD-2大孔吸附樹脂解吸率的影響見圖2。如圖2所示，解吸率隨著解吸液體積的增加呈先增加后減少的趨勢，解吸液體積在15 mL時解吸率最高，此時解吸率為94.80%，顯著高于其他解吸液體積(P<0.05)，因此，選擇解吸液體積為15 mL。

2.3 FOS葡聚糖凝膠Sephadex LH-20分離純化結(jié)果

2.3.1 洗脫劑的篩選

由圖3可以看出，與蒸餾水洗脫相比，乙醇溶液洗脫出來的峰較多，即分離出來的組分較多；25%乙醇溶液在7-15管之間分離出兩個峰，峰型具有更好的對稱性和分離度，而其他兩個乙醇溶液只分離

圖3 洗脫劑洗脫曲線

出一個峰，分離效果不及25%乙醇溶液；所以，最終選擇25%乙醇溶液作為洗脫劑。

2.3.2 上樣液體積的確定

由圖4可以看出，與其他三個上樣液體積相比，0.125 mL上樣量分離效果比較好，在7～15管之間分離出兩個峰，分出的兩個峰對稱性和分離度較好；上樣量過多，分離效果不好，所以，最終選擇0.125 mL作為上樣量。

圖4 上樣液FOs體積的洗脫曲線

2.3.3 洗脫流速的確定

由圖5可以看出，0.4、0.5、0.6 mL/min因流速太快，分離出來的組分較少，分離效果不好，峰形不太對稱。在流速為0.3 mL/min分出的組分較多，且峰型的對稱性好一些，分離效果比較好，因此，洗脫流速選擇0.3 mL/min進行洗脫。

實驗結(jié)果表明，Sephadex LH-20 葡聚糖凝膠純化的最佳條件為：洗脫劑25%乙醇，上樣量1.25 mL，洗脫流速 0.3 mL/min，在此條件下，分離出來的效果最好，分離出的組分最多，純化后發(fā)酵麥麩 FOs含量由(1 107.796±52.18) nmol/g提高到(2 217.38±25.36) nmol/g，提高了2倍，純化效果較佳。

圖5 洗脫流速的洗脫曲線

2.4 發(fā)酵麥麩FOs的紫外吸收光譜圖

由圖6可以看出，發(fā)酵麥麩FOs的紫外光譜在286 nm和325 nm處具有吸收峰，表明發(fā)酵麥麩FOs中有阿魏酸的存在[19]。

圖6 發(fā)酵麥麩FOs紫外吸收光譜圖

2.5 發(fā)酵麥麩FOs對斑馬魚心臟保護作用的影響

靜脈竇是血液進入心室的部位，動脈球是血液流出心房的部位。SV-BA間距反映斑馬魚心臟的形態(tài)和功能[25]，心率是體現(xiàn)心臟功能的重要指標之一。如圖7和圖8結(jié)果顯示，特非那定誘導(dǎo)后斑馬魚出現(xiàn)了明顯的心臟損傷，主要表現(xiàn)為心包水腫、血流速度減慢、心率不齊等癥狀。如圖8所示，與正常對照

注：A：正常對照組；B：特非那定組；C：50 μg/mL發(fā)酵麥麩FOs；D：100 μg/mL發(fā)酵麥麩FOs；E：200 μg/mL發(fā)酵麥麩FOs圖7 發(fā)酵麥麩FOs對特非那定誘導(dǎo)的 斑馬魚心臟心臟損傷的影響

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與特非那定組比較，#P<0.05。圖8 分離純化后發(fā)酵麥麩FOs對特非那定誘導(dǎo)的斑馬魚心率 和心臟SV-BA間距的影響

組相比，特非那定組斑馬魚心率顯著降低(P<0.05)，心臟SV-BA間距顯著增大(P<0.05)，表明特非那定誘導(dǎo)造成了斑馬魚心臟損傷；與特非那定組相比，100、200 μg/mL 分離純化后發(fā)酵麥麩FOs組斑馬魚心率顯著高于特非那定組(P<0.05)，濃度為50 μg/mL時心率比特非那定組有所上升，但差異不顯著(P>0.05)；與特非那定組相比，添加50、100、200 μg/mL分離純化后發(fā)酵麥麩FOs組的斑馬魚心臟SV-BA間距顯著縮小(P<0.05)，且在質(zhì)量濃度為200 μg/mL時分離純化后發(fā)酵麥麩FOs心臟保護作用最好，斑馬魚的心臟損傷修復(fù)率可達82.19%，與正常對照組差異不顯著(P>0.05)，表明經(jīng)分離純化后發(fā)酵麥麩FOs對特非那定誘導(dǎo)的斑馬魚心臟損傷起到緩解的作用，具有一定的心臟功能損傷保護作用。

3 結(jié)論

大孔吸附樹脂被廣泛應(yīng)用于植物活性物質(zhì)的分離純化，本實驗采用Amberlite XAD-2大孔吸附樹脂純化發(fā)酵麥麩FOs，考察各因素對吸附率與解吸率的影響，獲得最佳工藝條件為上樣液質(zhì)量濃度4.0mg /mL，上樣液pH 4.0，上樣液體積40 mL，最佳的解吸條件為：乙醇體積分數(shù)50%、洗脫體積15 mL，在此條件下發(fā)酵麥麩FOs吸附率可達83.76%、解吸率可達94.80%。利用Sephadex LH-20 葡聚糖凝膠再進一步純化發(fā)酵麥麩FOs的最佳條件為洗脫劑25%乙醇，上樣量1.25 mL，洗脫流速 0.3 mL/min，在此條件下，分離出的組分最多，紫外光譜分析表明純化發(fā)酵麥麩FOs中有阿魏酸的存在，發(fā)酵麥麩 FOs含量由(1 107.796±52.18) nmol/g提高到(2 217.38±25.36)nmol/g，提高了2倍，純化效果較佳。添加50、100、200 μg/mL 分離純化后發(fā)酵麥麩FOs對特非那定誘導(dǎo)的斑馬魚心臟損傷情況均不同程度地改善，其卵黃囊下淤血減輕、血流速度恢復(fù)正常、心臟SV-BA間距顯著縮短和心率顯著升高。該純化工藝操作簡單、純化效果好，純化后發(fā)酵麥麩FOs具有較強的心臟保護作用。