響應面優(yōu)化油茶籽油游離型特征酚和總酚工藝

魏 征 楊剴舟 欒 霞 李秀娟 段章群 郭咪咪 楊 茜

(國家糧食和物資儲備局科學研究院糧油加工研究所，北京 100037)

油茶(CamelliaoleiferaAbel)，山茶科、山茶屬的常綠灌木或小喬木[1，2]，種植面積和產量位于我國木本油料之首[3]。油茶籽油源于油茶籽，富含油酸和亞油酸等不飽和脂肪酸[4]，還含有多酚、生育酚、角鯊烯、植物甾醇和類胡蘿卜素等功能營養(yǎng)伴隨物[5，6]，具有抗癌、抗炎、抑菌、防氧化等保健功效[7-10]。因此，油茶籽油又被稱為“東方橄欖油”，是提供優(yōu)質、健康植物油的重要來源。

國內外研究發(fā)現，茶油的保健功效與其含有的天然抗氧化成分多酚密不可分[11，12]。但這些多酚的種類、含量和性質，受原料來源、預處理、加工工藝，提取和測定方法等多種因素的共同影響[13-15]。油脂多酚提取常采用溶劑浸提法，使用甲醇、乙醇和正己烷等溶劑，但傳統(tǒng)萃取有較多缺點，需輔助超聲、微波和負壓空化法等，提高萃取效率并降低能耗[16，17]。植物多酚常以游離型和結合型存在，由于檢測條件的限制，目前油脂多酚評價主要針對總酚含量，多酚鑒定研究也多停留在游離酚層面，降低了其實際應用價值[18，19]，現有的“極性悖論”及“膠體締合”假說[20]亦未能有效闡明油脂中不同形態(tài)多酚的抗氧化機制。因此，茶油多酚形態(tài)研究尚處于起步階段，酚類化合物形態(tài)分布的意義亟待揭示。油茶籽油中不同形態(tài)多酚組成不同，有必要基于總酚含量結合特征酚(如羥基肉桂酸和羥基苯乙酸等)，對油茶籽油中不同形態(tài)多酚提取工藝進行系統(tǒng)研究和優(yōu)化。

本研究針對冷榨油茶籽油中以反-肉桂酸和4-羥基苯乙酸為主的游離型特征酚和總酚提取工藝進行優(yōu)化，旨在完善游離型多酚提取方法，為后期油茶籽油不同形態(tài)多酚提取、鑒定與評價，油茶籽油適度加工過程多酚保留及調控提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

普通油茶籽品種，2018年購于湖南衡陽。乙腈、甲醇、甲酸、反-肉桂酸和4-羥基苯乙酸等，均為色譜純；甲醇、乙醇、正己烷和Na2CO3等，均為分析純。

1.2 儀器與設備

Q-TOF 6545型超高效液相色譜-四級桿-飛行時間-質譜聯用儀(UPLC Q-TOF MS，搭配UPLC 1290 Infinity II液相系統(tǒng)、Dual AJS離子源和質譜自動校準系統(tǒng))，Syenrgy H1MFD型酶標儀，FW-135型中草藥粉碎機，ENG2-A型液壓榨油機，SI-T236型Vortex-Genie2旋渦混合儀，KQ-300V DV型三頻數控超聲波清洗器，SHP DC-1015型低溫恒溫槽，Sigma 3-18K型高速冷凍離心機，BUCHI R-215型旋轉蒸發(fā)儀。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

采購后的油茶籽原料，經低溫干燥至含水量5%～7%，4 ℃冷藏暫存。使用時經殼仁分離、粉碎過篩，混合制胚(含殼率15%)，冷榨以獲得初榨油，離心過濾，充氮避光4 ℃保存。

1.3.2 超聲波輔助溶劑法提取油茶籽油游離型多酚

參考實驗室已有方法[14,21]和Alu′Datt等[22]的方法，略作改動。準確稱取1.000 0 g油茶籽油于50 mL離心管中，按料液比1∶1和1∶20(g/mL)加入正己烷和甲醇，分別漩渦30 s，置于超聲波清洗器中(通過玻璃反應釜和低溫恒溫槽實現提取過程動態(tài)精準控溫)，在30 ℃、270 W、45 kHz下超聲提取30 min，7 600 g離心10 min，分離有機相，殘油重復提取2 次。合并3次有機相，40℃下真空旋蒸，2 mL色譜純甲醇復溶，-20 ℃保存。樣品先經0.22 μm有機膜過濾，再上UPLC Q-TOF MS檢測。

1.3.3 油茶籽油游離型多酚提取單因素實驗

對溶劑比例、料液比、超聲功率、提取時間、提取溫度和提取次數等進行單因素實驗，以確定各因素影響程度和適宜范圍。單因素實驗參照1.3.2，只變更單因素項，其余不變。其中，甲醇比例選用50%～100%，料液比選用1∶5～1∶30，超聲功率選用150～300 W，提取時間選用10～60 min，提取溫度選用20～70 ℃，提取次數選用1～6次。

1.3.4 響應面優(yōu)化油茶籽油游離型多酚提取工藝

根據單因素實驗結果，以游離型反-肉桂酸、4-羥基苯乙酸和總酚含量為響應值，應用Box-Behnken實驗設計，對料液比、超聲功率和提取時間3個因素進行響應面分析。各因素及水平編碼見表1。

表1 油茶籽油游離型多酚提取因素水平表

1.3.5 指標測定1.3.5.1 總酚含量測定

參考實驗室已有方法[14,23]，略作改動。取20 μL樣液或各梯度標準液至2 mL離心管，依次加入780 μL蒸餾水、50 mL福林酚試劑和150 μL質量分數20%的Na2CO3溶液。漩渦30 s，40 ℃水浴30 min，使用酶標儀在760 nm波長處測定吸光度。結果以沒食子酸當量表示(mg/kg)，標準曲線y=0.001 2x+0.000 7(R2=0.999 8)，線性范圍0～500 μg/mL。

1.3.5.2 游離型特征酚含量測定

UPLC Q-TOF MS分析參考實驗室已有方法[14,23-24]，有改動。

色譜條件：Agilent UPLC 1290液相系統(tǒng)，Poroshell 120 EC-C18柱(2.1 mm×100 mm×2.7 μm)；流動相A為0.1%甲酸-水，流動相B為0.1%甲酸-乙腈。洗脫梯度：0～2 min，5% B；2～20 min，5%～45% B；20～21 min，45%～95% B；21.1～32 min，柱子沖洗平衡。流速300 μL/min，柱溫35 ℃，進樣量5 μL。

質譜條件：Agilent Q TOF 6545質譜系統(tǒng)，ESI負離子全掃描模式。離子源干燥氣溫度350 ℃，干燥氣流速10 L/min，霧化氣壓力40 psi，鞘氣溫度400 ℃，鞘氣流速12 L/min，毛細管裂解電壓-3.5 kV，毛細管出口電壓135 V，碰撞能量(30±5) eV，掃描范圍100～1 000 u。反-肉桂酸標準曲線y=62 154.34x+12 712.82(R2=0.999 9)，線性范圍0～5.47 μg/mL；4-羥基苯乙酸標準曲線為y=51 854.60x+1 264.02(R2=0.999 6)，線性范圍為0～5.52 μg/mL。

1.4 數據處理

實驗平行3次，結果以平均值±標準偏差表示。采用Microsoft Excel 2016統(tǒng)計所有數據，Origin 2020作圖，SPSS 26.0進行差異顯著性分析(Duncan′s，P=0.05)，Design-Expert 12.0進行響應面分析。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 甲醇比例對油茶籽油游離型多酚含量的影響

圖1表明，油茶籽油中游離型總酚和特征酚在

注：不同小寫字母代表0.05水平上存在顯著性差異。下同。圖1 甲醇比例對油茶籽油游離型多酚含量的影響

甲醇比例較低時含量較低，相互間差異不顯著，80%以后快速升高，100%時達到最高，如100%甲醇時的總酚、反-肉桂酸和4-羥基苯乙酸含量分別是50%時的4.11、2.04和1.86倍。表明油茶籽油游離型多酚含量與甲醇濃度顯著正相關，與魏征等[21]及周晴芬[25]所發(fā)現的丙酮和乙醇等有機溶劑濃度越高，對多酚的提取效果越好相一致。因此，后續(xù)選擇100%甲醇進行實驗。

2.1.2 料液比對油茶籽油游離型多酚含量的影響

由圖2可知，料液比顯著影響油茶籽油中游離型多酚含量。在料液比1∶5～1∶20范圍內，多酚含量均隨著提取溶劑用量增大而增大，隨后顯著下降至最低，如在料液比1∶20時總酚和反-肉桂酸含量分別達到110.11 mg/kg和571.48 μg/kg，而在1∶30時其含量分別僅為前者的67.79%和75.55%。綜合認為，選擇料液比1∶20效果最好。

圖2 料液比對油茶籽油游離型多酚含量的影響

2.1.3 超聲功率對油茶籽油游離型多酚含量的影響

圖3反映了不同超聲功率下油茶籽油中游離型多酚含量變化。當超聲功率在150～210 W時，總酚和反-肉桂酸含量無顯著性差異，在240 W時有顯著最高值，后又快速下降。而4-羥基苯乙酸含量不受超聲功率的顯著影響，但變化趨勢與總酚相一致，從而選擇240 W進行后續(xù)研究。超聲功率對游離型總酚和特征酚含量影響趨勢不同，主要是超聲強度影響介質中的空化作用強度，在最合適的超聲功率下，空化作用與機械作用有最佳結合點，此時有效成分溶出最完全，提取率最大[26]，但對不同有效成分影響有一定差異。

圖3 超聲功率對油茶籽油游離型多酚含量的影響

2.1.4 提取溫度對油茶籽油游離型多酚含量的影響

提取溫度對油茶籽油游離型多酚含量有較大影響(圖4)，其總酚和特征酚均在20 ℃提取時較低，30℃提取時最高，隨后在30～70 ℃提取時又顯著下降，只有少量例外。其中，反-肉桂酸的下降趨勢最為明顯，從20 ℃提取時的600.51 μg/kg下降到70 ℃提取時的339.20 μg/kg，減少了43.51%，表明30 ℃后，油茶籽油游離型多酚與提取溫度顯著負相關，且反-肉桂酸更具有溫度敏感性。

圖4 提取溫度對油茶籽油游離型多酚含量的影響

2.1.5 提取時間對油茶籽油游離型多酚含量的影響

圖5表明，油茶籽油中游離型總酚和特征酚含量均在10～30 min內隨提取時間延長逐漸增大，30 min后總酚和4-羥基苯乙酸略有上升，但相互之間無顯著性差異，而反-肉桂酸則顯著下降。一般提取時間越長多酚含量越高，但大于30 min后特征酚含量反而降低，可能是某些脂溶性成分隨提取時間延長而溶出[21]，因此后續(xù)選擇30 min繼續(xù)研究。

圖5 提取時間對油茶籽油游離型多酚含量的影響

2.1.6 提取次數對油茶籽油游離型多酚含量的影響

圖6表明，油茶籽油中游離型4-羥基苯乙酸和反-肉桂酸分別在提取2和3次時含量最高，隨后略有下降；而總酚則隨提取次數增加逐漸增加，但在提取3次后無顯著性差異。同時發(fā)現，提取次數與料液比存在交互作用，通常料液比越大，提取效果越好，所需提取次數越少，與前人研究結果相似[27，28]。但提取次數過多會造成溶劑和能源浪費，也給蒸發(fā)、濃縮等后續(xù)處理帶來麻煩，因此選擇3次開展實驗。

圖6 提取次數對油茶籽油游離型多酚含量的影響

2.2 響應面優(yōu)化結果

2.2.1 回歸方程的建立與方差分析

根據表2實驗結果，進行回歸分析(表3)，擬合后得到超聲波輔助溶劑提取油茶籽油中游離型多酚的二次多項回歸方程：Y總酚= 98.84-4.50A-3.35B+2.45C+2.32AB-4.71AC+3.19BC-14.40A2-17.13B2-14.85C2；Y反-肉桂酸=516.62-14.80A-26.02B+9.54C-31.22AB-27.00AC-25.04BC-23.58A2-58.94B2-46.83C2；Y4-羥基苯乙酸=346.81+14.39A-2.10B+14.53C+9.24AB-6.54AC-8.43BC-28.64A2-21.12B2-21.05C2。

表2 響應面實驗設計及結果

表3 回歸方程各項方差分析

2.2.2 響應面分析

考慮到響應面模型中反-肉桂酸含量的擬合度不好，此處僅分析各因素交互作用對總酚和4-羥基苯乙酸含量的影響。其中，料液比和提取時間交互作用對游離型總酚含量影響顯著，但各因素交互作用對游離型4-羥基苯乙酸含量影響不顯著，與方差分析相一致。

2.2.3 驗證實驗

根據建立的模型進行參數最優(yōu)化分析，得到的最佳工藝條件為：料液比1∶19.73(g/mL)、超聲功率265.77 W、提取時間31.86 min，此時游離型總酚、反-肉桂酸和4-羥基苯乙酸的含量分別為99.10mg/kg、520.70 μg/kg和348.14 μg/kg。為了便于實際操作，確定油茶籽油游離型多酚提取條件為：料液比1∶20、超聲功率270 W、提取時間32 min，進行3 組平行驗證實驗，得到游離型總酚、反-肉桂酸和4-羥基苯乙酸含量分別為(104.86±8.47) mg/kg、(506.21±25.62) μg/kg和(340.18±18.33) μg/kg，變化幅度在-2.28%～+5.81%之間，實際結果與理論預測吻合度較高，得到的最佳提取條件可靠且有應用價值。

3 結論

本研究采用超聲波輔助溶劑提取法，針對冷榨油茶籽油中以反-肉桂酸和4-羥基苯乙酸為主的游離型特征酚和總酚提取工藝進行優(yōu)化。根據單因素實驗結果，選擇料液比、超聲功率和提取時間3個因素進行響應面分析，得到的最佳工藝條件為：料液比1∶19.73(g/mL)、超聲功率265.77 W、提取時間31.86 min。在優(yōu)化條件下進行驗證實驗，其游離型總酚、反-肉桂酸和4-羥基苯乙酸含量分別為(104.86±8.47) mg/kg、(506.21±25.62) μg/kg和(340.18±18.33) μg/kg。所評價的實驗因素和所優(yōu)化的實驗參數準確可靠，所確定的各因素較優(yōu)水平范圍真實有效，可用于實際提取操作。本研究旨在完善油茶籽油游離型多酚提取方法，可為后期油茶籽油結合型多酚提取與鑒定，油茶籽油適度加工過程多酚保留與調控提供理論依據。