前列腺纖維性增生的差異表達(dá)基因篩選及富集研究*

萬(wàn)少平，蔡季，肖靚琨

（1.岳陽(yáng)市人民醫(yī)院泌尿外科，湖南岳陽(yáng) 414000；2.織金縣人民醫(yī)院泌尿外科，貴州織金 552100；3.岳陽(yáng)市人民醫(yī)院外科，湖南岳陽(yáng) 414000）

良性前列腺增生是引起中老年男性排尿障礙最常見(jiàn)的良性疾病之一[1]，隨著年齡增長(zhǎng)，少數(shù)患者會(huì)出現(xiàn)尿潴留[1-3]。臨床經(jīng)尿道前列腺電切治療男性下尿路癥狀和尿潴留時(shí)，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)患者良性前列腺增生是尿道周?chē)袤w的擴(kuò)大增生，導(dǎo)致排尿困難；顯微鏡下觀察電切前列腺組織，前列腺增生多呈結(jié)節(jié)性改變，以不同比例間質(zhì)和腺上皮構(gòu)成；少數(shù)排尿困難的患者，前列腺擴(kuò)大增生不明顯，術(shù)中發(fā)現(xiàn)前列腺稍增大，甚至變小，呈纖維性收縮，電切組織顯微鏡下觀察組織間質(zhì)以膠原纖維增生為主，僅見(jiàn)少量增生腺體[4-8]。本研究通過(guò)差異基因（differentially expressed genes, DEGs）比較的方法，認(rèn)識(shí)纖維性增生的致病基因，不僅可以深入認(rèn)識(shí)其病理發(fā)生的分子本質(zhì)，為良性前列腺纖維性增生提供基因診斷方法，而且可以指導(dǎo)該類型前列腺增生的治療。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年2月—2019年12月岳陽(yáng)市人民醫(yī)院和織金縣人民醫(yī)院收治的前列腺增生患者14 例，年齡60～91 歲。所有患者出現(xiàn)尿潴留，前列腺特異性抗原＜4 ng/L。入院后行前列腺等離子電切手術(shù)治療，病理診斷為良性前列腺增生，其中纖維性增生7 例（纖維組），結(jié)節(jié)性增生7 例（結(jié)節(jié)組）。

所有標(biāo)本在手術(shù)切除后，用生理鹽水沖洗3 次，去除血跡，30 min 內(nèi)放入液氮速凍，置入-80℃冰箱冷凍保存。

1.2 主要試劑及儀器

Trizol RNA 提取試劑盒（美國(guó)Invitrogen 公司），Agilent 2100 bioanalyzer（美國(guó)Agilent Technologies 公司），六堿基隨機(jī)引物（深圳華大基因公司），QiaQuick PCR 試劑盒（美國(guó)Qiagen 公司），qPCR TaqMan Probe（美國(guó)Yeasen 公司）。NanoDrop 分光光度計(jì)和Qubit 熒光計(jì)（美國(guó)賽默飛世爾科技公司）。

1.3 方法

1.3.1 提取總RNA標(biāo)本送深圳華大基因公司，按照Trizol RNA 提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，提取結(jié)節(jié)性前列腺增生組織及纖維性前列腺增生組織RNA。采用Nanodrop 檢測(cè)RNA 的純度（260～280 mm光波處的OD 值），瓊脂糖凝膠電泳分析RNA 程度以及是否被污染，Qubit 定量檢驗(yàn)RNA 濃度；Agilent 2100 檢測(cè)RNA 的完整性。

1.3.2 文庫(kù)制備檢測(cè)總RNA 樣本合格后，采用Oligo（dT）磁珠富集mRNA，將mRNA 打斷成短片段模板，用六堿基隨機(jī)引物合成cDNA 鏈。cDNA 鏈經(jīng)過(guò)QiaQuick PCR 試劑盒純化，洗脫，末端修復(fù)，連接測(cè)序接頭，瓊脂糖凝膠電泳，PCR 擴(kuò)增富集cDNA，完成文庫(kù)制備。

1.3.3 測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建完成后，Qubit 2.0 初步定量，Agilent 2100 檢測(cè)文庫(kù)的Insert size，qPCR TaqMan Probe 準(zhǔn)確定量文庫(kù)的有效濃度（＞2 nm）。合格后，通過(guò)MGIseq-2000測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行PE150測(cè)序。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

測(cè)序數(shù)據(jù)采用SOAPnuke（v1.5.2）過(guò)濾，過(guò)濾后的數(shù)據(jù)采用Bowtie2（v2.2.5）進(jìn)行比對(duì)，基因相對(duì)表達(dá)量用RSEM（v1.2.12）計(jì)算，用DESeq2（v1.4.5）進(jìn)行差異基因分析，將校正后的P＜0.05，且差異倍數(shù)≥2作為篩選標(biāo)準(zhǔn)。將差異表達(dá)基因進(jìn)行GO 富集分析，用DAVID 工具分析KEGG 信號(hào)通路富集情況。

2 結(jié)果

2.1 差異基因相對(duì)表達(dá)量分析

對(duì)比兩組后發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因1 598 個(gè)；相較于結(jié)節(jié)組，纖維組有1 063 個(gè)基因相對(duì)表達(dá)量上調(diào)，535 個(gè)基因相對(duì)表達(dá)量下調(diào)。見(jiàn)圖1。

圖1 差異基因相對(duì)表達(dá)量的火山圖

2.2 差異基因的GO富集分析

GO 富集分析將DEGs 分為3 類：生物學(xué)過(guò)程、分子功能、細(xì)胞組分。在生物學(xué)過(guò)程中，DGEs 主要富集在離子轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞黏附、細(xì)胞外基質(zhì)等生物學(xué)過(guò)程中（見(jiàn)圖2）。在分子功能中，DGEs 主要富集在近端啟動(dòng)子DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活劑、RNA 聚合酶Ⅱ、DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活劑、信號(hào)受體結(jié)合等活性分子功能上（見(jiàn)圖3）。在細(xì)胞組分中，DGEs主要富集在細(xì)胞膜、細(xì)胞外區(qū)域、質(zhì)膜等細(xì)胞部位（見(jiàn)圖4）。

圖2 GO富集分析中生物過(guò)程組氣泡圖

圖3 GO富集分析中細(xì)胞組分組氣泡圖

圖4 GO富集分析中分子功能組氣泡圖

2.3 差異基因的KEGG通路分析

通過(guò)DAVID 工具對(duì)DEGs 進(jìn)行KEGG 信號(hào)通路分析后發(fā)現(xiàn)，DEGs 主要富集在細(xì)胞外基質(zhì)—受體、細(xì)胞因子與細(xì)胞因子受體等信號(hào)通路上（見(jiàn)圖5）。

圖5 KEGG富集分析氣泡圖

2.4 差異基因PPI互作網(wǎng)絡(luò)分析

將兩組樣本DEGs 所編碼的蛋白質(zhì)利用String數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行PPI 網(wǎng)絡(luò)互作，預(yù)測(cè)DEGs 間相互作用，選取PPI 網(wǎng)絡(luò)中連通度排序前10 位為核心基因并排序。結(jié)果為FOS、GNG13、CXCR4、CCL2、OPRM1、PPBP、GAL、OPRK1、JUN、EGR1。對(duì)纖維性增生組而言，PPBP、OPRM1、GAL為上調(diào)，其余基因均為下調(diào)。這些關(guān)鍵基因的關(guān)系見(jiàn)圖6。

圖6 前列腺纖維性與結(jié)節(jié)性增生關(guān)鍵差異基因的聯(lián)系

3 討論

臨床良性前列腺結(jié)節(jié)性增生非常常見(jiàn)，良性前列腺纖維性增生相對(duì)較少，本研究從兩類患者的基因水平發(fā)現(xiàn)其不同，為其發(fā)生、發(fā)展的作用機(jī)制及治療提供新思路。本研究共發(fā)現(xiàn)1 598 個(gè)差異表達(dá)基因，與結(jié)節(jié)性增生組織相比，纖維性增生組織中相對(duì)表達(dá)量上調(diào)基因1 063 個(gè)，相對(duì)表達(dá)量下調(diào)基因535 個(gè)。對(duì)這些基因進(jìn)行GO 富集分析后發(fā)現(xiàn)，DGEs 主要富集在離子轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞黏附、細(xì)胞外基質(zhì)組生物學(xué)過(guò)程，和富集在近端啟動(dòng)子DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活劑、RNA 聚合酶Ⅱ，信號(hào)受體結(jié)合等活性分子功能中。KEGG 富集通路分析發(fā)現(xiàn)，DEGs 主要富集在細(xì)胞外基質(zhì)—受體相互作用、細(xì)胞因子與細(xì)胞因子受體相互作用等信號(hào)通路上。細(xì)胞外基質(zhì)是由動(dòng)物細(xì)胞合成，并分泌到胞外，分布在細(xì)胞表面和細(xì)胞之間，是多糖、蛋白質(zhì)或蛋白聚糖等物質(zhì)。這些物質(zhì)不屬于任何細(xì)胞，但可為細(xì)胞生存提供重要的結(jié)構(gòu)支架和組織連接，并通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)影響細(xì)胞的形態(tài)、增殖、分化、遷移、代謝和功能等[9]。

從PPI 互作網(wǎng)絡(luò)分析可以發(fā)現(xiàn)，與纖維性前列腺增生相關(guān)的最主要3 個(gè)基因?yàn)镻PBP、OPRM1、GAL。PPBP基因編碼的蛋白質(zhì)是血小板衍生的生長(zhǎng)因子，屬于趨化因子家族，是中性粒細(xì)胞的有效化學(xué)吸引劑和活化劑，該蛋白具有殺菌和抗真菌作用，是抗微生物的蛋白質(zhì)[10-11]。GAL編碼的蛋白質(zhì)在泌尿生殖道廣泛表達(dá)神經(jīng)內(nèi)分泌肽——甘丙肽及其相關(guān)肽，其已被證明具有抗真菌活性，并被認(rèn)為是先天免疫系統(tǒng)的一部分[12-13]。本研究篩選出的PPBP和GAL基因，均可以表達(dá)抗菌活性物質(zhì)，提示前列腺纖維性增生的發(fā)生、發(fā)展可能與微生物感染有關(guān)，至于微生物是細(xì)菌或真菌，還未明確。

OPRM1基因位于人類第6 號(hào)染色體6q24～q25位置上，長(zhǎng)度96.31 kB，包括轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)、3 個(gè)內(nèi)含子和4 個(gè)外顯子。OPRM1通過(guò)神經(jīng)活性配體-受體相關(guān)作用，調(diào)節(jié)雌激素信號(hào)通路來(lái)調(diào)節(jié)前列腺的增生[14-16]，OPRM1和上述GAL基因?qū)?xì)胞的增殖為負(fù)調(diào)控，需要證實(shí)的是該負(fù)調(diào)控可能在前列腺纖維增生過(guò)程中的作用機(jī)制。

本研究篩選出了3 個(gè)與纖維性增生相關(guān)的核心差異表達(dá)基因，以及若干相關(guān)的富集生物位點(diǎn)和生物通路，為臨床監(jiān)測(cè)和治療前列腺纖維性增生提供潛在的生物標(biāo)志物及靶點(diǎn)。但是本研究病例數(shù)不夠，可能存在一些偏倚，此外需要進(jìn)一步完善分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)來(lái)確認(rèn)這些基因的具體功能。