TLR4特異性抑制劑對大鼠心臟死亡器官捐獻供肝缺血再灌注損傷的作用*

馬偉，武建英，鐘浩，朱吉海，楊佳，王永宏

（青海大學附屬醫(yī)院心臟血管外科，青海西寧 810000）

肝移植仍存在急慢性排斥反應嚴重、肝臟功能恢復慢、并發(fā)癥多、生存率低等問題，其中供肝缺血再灌注（ischemia-reperfusion, IR）損傷是影響療效和預后的重要原因，進一步發(fā)展可引起多器官組織損傷。供肝IR 損傷的病理機制包括肝細胞功能直接損傷和免疫介導反應發(fā)生改變，可表現(xiàn)為HMGB1、ATP 等相關損傷分子和炎癥因子大量表達[1]。目前常采用缺血預處理和缺血后處理減輕IR 損傷，通過灌注減輕體內炎癥和氧化應激反應，減輕肝組織灌注缺血和損傷。但這類方法存在技術難點大、應用范圍小等缺點，近年來認為通過病理機制靶點干預可從根本上有效阻止IR 損傷信號通路，且該方法普及性較高[2-3]。Toll 樣受體（Toll like receptors, TLRs）是介導固有免疫最重要的特異性受體之一，其中Toll 樣受體4（Toll like receptors 4, TLR4）具有識別內外源性損傷分子模式的功能，可誘導趨化因子和炎癥因子的表達和炎癥介導反應，可能在心臟死亡器官捐獻供肝IR 損傷中發(fā)揮重要作用。有研究指出，TLR4 特異性抑制劑TAK242 可阻斷TLR4 胞內信號傳遞，從而改善組織損傷[4]。綜合考慮IR 損傷重要信號通路HMGB1/TLR4 可能受TLR4 抑制劑的影響而發(fā)揮保護或損傷作用，故可能為提高心臟死亡器官捐獻供肝成功率提供解決辦法。因此本研究復制大鼠模型明確TLR4 特異性抑制劑調控HMGB1/TLR4 信號通路對心臟死亡器官捐獻大鼠供肝IR 損傷的作用，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

40 只8 周齡Balb/c 雄性大鼠購自上海南方模式生物科技股份有限公司，體重292～341 g。實驗動物生產許可證號：SCXK（滬）2019-0002，實驗動物使用許可證號：SYXK（滬）2019-0003，動物實驗審批號：IACUC20190308。在室溫21～26℃、濕度45%～50%、12 h 明/12 h 暗條件下，適應性飼養(yǎng)4 周。

1.2 模型的復制與分組

常規(guī)全面檢查，將可進行實驗的合格大鼠分為4 組，每組10 只，分為4 組。①對照組：術前30 min 經腹腔注射二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide,DMSO）無菌生理鹽水；②對照抑制組：術前30 min經腹腔注射含TAK242 的DMSO 無菌生理鹽水；③模型組：術前30 min 經腹腔注射DMSO 無菌生理鹽水；④模型抑制組：術前30 min 經腹腔注射含TLR4 抑制劑的DMSO 無菌生理鹽水。過程中模型組和模型抑制組各死亡2 只大鼠，死亡大鼠用無差異的存活大鼠補充，保證每組各有6 只大鼠；復制腦死亡器官捐獻模型：嚴格禁食12 h，經腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉大鼠，劑量為30 mg/kg；模型組、模型抑制組剪開膈肌停跳心臟，對照組、對照抑制組不剪開膈肌，30 min 后將肝臟及周圍血管和組織等暴露，分離腹下腔靜脈和主動脈，剪斷胸腔段下腔靜脈，并且用一次性靜脈輸液針穿刺腹主動脈，4℃肝素林格液40 ml 緩慢灌注肝臟至肝臟呈淡黃色且不再變色，取下肝臟置于4℃保存液中并從門靜脈灌注4℃保存液5 ml。

1.3 標本收集

肝臟置于4℃保存液中24 h 后進行1 h 常溫攜氧灌注，通過計算機監(jiān)測壓力，灌注液為200 ml緩沖溶液，灌注壓力約8 mmHg，流量為1 ml/（g·min），溫度37℃，5%二氧化碳和95%氧氣混合氣體1 L/min，灌注液和氣體通過氧合膜氧合后灌入肝臟，將聚乙烯導管輕輕抬高到脫離液面，從中采集5 min、30 min、60 min 時的灌注液，一部分置于-80℃冰箱，一部分浸泡于4%多聚甲醛。

1.4 主要實驗試劑及儀器

商陸皂苷甲（純度＞98%，編號65497-07-6）、IL-12 p35 抗體購自日本TaKaRa 公司，蘇木精-伊紅染色試劑盒、PBS 緩沖液、RIPA 蛋白裂解液購自成都中仕石化有限公司，蛋白濃度檢測試劑盒、化學發(fā)光試劑盒、購自蘇州吉瑪基因股份有限公司，HMGB1 一抗、TLR4 一抗、白細胞介素-1β（interleukin-1 β, IL-1β）一抗、IL-6 一抗、環(huán)氧合酶-2（cyclooxygenase 2, COX2）一抗、肌動蛋白（βactin）一抗、山羊抗兔/抗鼠二抗購自美國Clontech公司，TUNEL 試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司，人抗大鼠IgG 二抗購自美國Thermo 公司。熒光顯微鏡購自美國應用生物系統(tǒng)公司。

1.5 方法

1.5.1 蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin staining,HE）染色將置于4%多聚甲醛中的組織制成切片，依次脫蠟、水化、蘇木精染色、伊紅染色，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察HE 染色結果，參考Suzuki 評分標準[5]判斷肝組織損傷程度。

1.5.2 Western blotting檢測肝細胞中HMGB1/TLR4及下游炎癥因子相對表達量將置于-80℃冰箱中的組織加入85℃、200～300 μl RIPA蛋白裂解，依次煮沸、超聲、離心，取上清液50 μg 行SDS-PAGE 電泳后封閉1 h；孵育HMGB1一抗、TLR4一抗、IL-1β一抗、IL-6一抗、COX2一抗、β-actin一抗過夜；加入羊抗兔/抗鼠二抗，化學發(fā)光、顯影、定影，觀察雜交信號；重復10 次后采用Image J 軟件比較各組細胞和組織HMGB1、TLR4 及下游炎癥因子IL-1β、IL-6、COX2、β-actin的灰度值比值。

1.5.3 細胞凋亡率檢測將置于4%多聚甲醛中的組織制成切片，按照TUNEL 試劑盒說明書方法原位檢測凋亡細胞，陰性對照不加末端脫氧核苷酸轉移酶，以核陽性（細胞核呈黃褐色）為判定標準，熒光顯微鏡下觀察凋亡指數(shù)并按標準計算，細胞凋亡率=凋亡細胞數(shù)/（凋亡細胞數(shù)+正常細胞數(shù)）。

1.5.4 TLR4 與HMGB1 的共表達關系①Western blotting 檢測：取置于-80℃冰箱中的組織，按1.5.2中的操作方法比較各組細胞和組織HMGB1 與βactin灰度值比值。②免疫熒光：將置于4%多聚甲醛中的肝組織石蠟切片，常規(guī)脫蠟、梯度酒精水化、去除內源性過氧化物酶活性，磷酸緩沖液反復漂洗，加入牛血清封閉液封閉，2 h 后依次滴加一抗（1∶500）、二抗（1∶100），孵育2 h，用0.01 mmol/L 磷酸緩沖液漂洗5 min/次，共3 次，干片，甘油封片，共聚焦顯微鏡下觀察圖像特點。

1.6 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，比較用方差分析，進一步兩兩比較用SNK-q檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠肝組織損傷程度比較

HE 染色結果顯示，對照組肝組織結構、形態(tài)基本正常，無明顯空泡和壞死；對照抑制組肝組織結構、形態(tài)基本正常；模型組肝細胞核溶解、無正常肝結構且部分出現(xiàn)腫脹，可見明顯空泡和壞死，肝竇有大量淤血；模型抑制組大部分肝組織、形態(tài)正常，無明顯壞死區(qū)域，散在一定數(shù)量的壞死肝細胞、小空泡和少量淤血（見圖1）。

圖1 各組大鼠肝組織損傷程度 （HE染色×200）

根據(jù)組織病理染色圖，采用Suzuki 評估大鼠肝組織損傷得分，對照組、對照抑制組、模型組、模型抑制組Suzuki 評分分別為（0.90±0.17） 分、（0.82±0.14）分、（2.79±0.40）分和（1.74±0.28）分，經方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=70.530，P=0.000）。進一步兩兩比較結果：對照組與對照抑制組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P=0.457）；模型組、模型抑制組高于對照組（P=0.000）；模型組高于模型抑制組（P=0.000）。

2.2 各組大鼠肝細胞中HMGB1/TLR4及下游炎癥因子相對表達量比較

與對照組比較，模型組HMGB1、TLR4、IL-1β、IL-6 蛋白條帶信號增強（見圖2）。對照組、對照抑制組、模型組、模型抑制組HMGB1、TLR4、IL-1β、IL-6 蛋白相對表達量比較，經方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較結果：對照組與對照抑制組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；模型組、模型抑制組高于對照組（P＜0.05）；模型組高于模型抑制組（P＜0.05）。見表1。

圖2 肝細胞中HMGB1/TLR4及下游炎癥因子的表達

表1 各組大鼠肝細胞中HMGB1/TLR4及下游炎癥因子相對表達量比較 （n=6，±s）

表1 各組大鼠肝細胞中HMGB1/TLR4及下游炎癥因子相對表達量比較 （n=6，±s）

組別對照組對照抑制組模型組模型抑制組F 值P值HMGB1 0.52±0.10 0.55±0.12 1.15±0.15 0.88±0.13 62.302 0.000 TLR4 0.98±0.18 1.06±0.20 3.54±0.21 2.47±0.25 79.524 0.000 IL-1β 0.13±0.03 0.12±0.03 0.35±0.04 0.20±0.05 80.115 0.000 IL-6 0.16±0.04 0.16±0.03 0.55±0.09 0.26±0.05 77.148 0.000

2.3 各組大鼠肝組織細胞凋亡率比較

對照組、對照抑制組凋亡細胞較少，分布較散亂，模型組、模型抑制組凋亡細胞較多，分布較密集（見圖3）。對照組、對照抑制組、模型組、模型抑制組細胞凋亡率分別為（2.30±0.33）%、（2.19±0.27）%、（20.22±1.39）%和（6.25±0.62）%，經方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=696.819，P=0.000）。進一步兩兩比較結果：對照組與對照抑制組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P=0.336）；模型組、模型抑制組高于對照組（P=0.000）；模型組高于模型抑制組（P=0.000）。

圖3 各組大鼠肝組織細胞凋亡情況 （×200）

2.4 TLR4與HMGB1的共表達關系

與對照組比較，對照抑制組蛋白條帶信號無變化；與模型組比較，模型抑制組蛋白條帶信號減弱（見圖4）。對照組、對照抑制組、模型組、模型抑制組HMGB1 蛋白相對表達量分別為（1.15±0.18）、（1.09±0.17）、（1.67±0.24）、（1.38±0.22），經方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=9.947，P=0.000）。進一步兩兩比較結果：對照組與對照抑制組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；模型組高于對照組（P＜0.05）；模型組高于模型抑制組（P＜0.05）。

圖4 各組大鼠肝組織中HMGB1蛋白的表達

免疫熒光結果顯示，在過表達的TLR4 大鼠肝細胞內（模型組），HMGB1 免疫活性顯著增加，且主要位于細胞漿內；但在過表達的TLR4 的正常大鼠肝細胞內（對照組），HMGB1 的免疫活性無顯著變化（見圖5）。

圖5 對照組和模型組大鼠肝組織中HMGB1的表達 （免疫熒光×400）

3 討論

IR 損傷機制較復雜且存在爭議，臨床認為IR損傷的主要病理機制為再灌注誘導細胞凋亡及血管、內質網、線粒體等通透性改變。隨著心臟死亡器官捐獻移植患者增多，經歷長時間熱缺血損傷的肝臟對IR 損傷更為敏感。供肝IR 損傷可加重移植肝的損傷，且目前缺乏減輕心臟死亡器官捐獻供肝IR 損傷的方法。肝臟質量的提高已成為臨床亟待解決問題之一。有學者對肝IR 損傷進行研究，發(fā)現(xiàn)固有免疫在IR 損傷中的作用，指出TLR4可能作為IR 損傷治療的重要靶點[6]。李瑩瑩等[7]采用TLR4抑制劑治療IR損傷小鼠，病理結果顯示治療后小鼠肝細胞結構基本正常，僅見少量壞死和空泡水腫。IR 損傷過程可抑制細胞代謝水平，但肝竇內皮細胞仍持續(xù)受到損傷，可表現(xiàn)為肝竇內皮細胞腫脹[8]；另線粒體釋放凋亡誘導因子誘導細胞凋亡，進一步發(fā)展引起肝細胞壞死[9]。本研究中，模型組大鼠肝細胞組織發(fā)生明顯壞死，見大量淤血和空泡水腫，與對照組大鼠比較，肝臟損傷評分顯著升高，符合既往報道。而TLR4 抑制劑處理后，可減弱該損傷，明顯改善肝結構和功能，提示TLR4 抑制劑可能保護供肝IR損傷。

TLR4 是定位在細胞膜的跨膜蛋白，是固有免疫中重要信號介導分子，可活化機體內無菌炎癥進而引起固有免疫受損，直接加重肝IR 損傷。李樹志等[10]的研究結果表明，TLR4 參與的免疫反應機制為DAMPs 結合于PRR，刺激炎癥反應，同時炎癥反應加重引起肝細胞進一步損傷。嚴一核等[11]的研究指出，肝IR 損傷中HMGB1 是TLR4 的關鍵配體，細胞損傷后，HMGB1 主動釋放調控基因。本研究中模型組大鼠HMGB1、TLR4 及TLR4 下游炎癥因子IL-1β、IL-6、COX2 蛋白相對表達量均顯著高于對照組大鼠，說明TLR4 識別并激活了HMGB1 的表達，通過釋放大量炎癥因子來損害肝細胞。HMGB1 與TLR4 結合可激活多種信號分子IRAK1、IRAK1 磷酸化，促進NF-κB 的轉位[12-13]。IL-1β 是固有免疫中重要的早期反應細胞因子。紀曉方等[14]指出肝損傷小鼠模型肝臟中IL-1β 呈高表達，顯著高于健康小鼠，提示IL-1β 是肝IR 損傷的危險因子。IL-6 可與受體IL-6R 結合形成復合物，通過膜蛋白信號通路發(fā)揮炎癥介導作用。李紅霞等[15]的動物實驗結果顯示，過表達IL-6 的肝臟移植大鼠肝臟損傷減??；同時，臨床發(fā)現(xiàn)肝損傷患者IL-6 水平顯著升高。黎真真等[16]發(fā)現(xiàn)異丙酚可通過下調心肌組織中TLR4、HMGB1 表達來減輕大鼠MIRI 介導的心肌組織損傷及炎癥反應。本研究中模型抑制組大鼠較模型組大鼠HMGB1、TLR4 及TLR4 下游炎癥因子IL-1β、IL-6 蛋白相對表達量顯著下降，提示TLR4 抑制劑阻斷了TLR4 活化激活通路，抑制了炎癥因子的釋放。本研究結果基本符合既往報道，TLR4 抑制劑可通過抑制HMGB1 激活來下調炎癥因子的表達，進而減輕供肝IR 損傷。在熱缺血階段，肝細胞受到嚴重損害，可表現(xiàn)為大量肝細胞凋亡，本研究中模型組大鼠肝細胞凋亡率最高可達22%。而過表達TLR4 抑制劑后，TLR4 對肝IR 損傷受到影響，肝組織細胞凋亡率顯著降低，進一步說明特異性TLR4 抑制劑對肝IR 損傷的保護作用。免疫熒光和Western blotting 檢測結果證實了TLR4 與HMGB1 的共表達作用，在IR 損傷大鼠中，過表達TLR4 可顯著升高HMGB1，而TLR4 抑制物可逆轉TLR4 過表達對HMGB1 的促進作用。

綜上所述，TLR4 特異性抑制劑可顯著下調HMGB1/TLR4 信號通路及相關信號分子，減輕心臟死亡器官捐獻大鼠肝臟氧化應激和炎癥反應，對供肝IR 損傷具有保護作用。本研究不足之處在于采用體外灌注系統(tǒng)來評估肝臟情況，可能存在一定誤差，需要在臨床工作中加以關注并進一步分析。