膀胱癌患者血清CK-19、CYFRA21-1的表達(dá)及其臨床意義*

李緒鯤，劉星，唐義權(quán)

（西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院泌尿科，四川瀘州 646000）

膀胱癌（bladder cancer, BC）是泌尿系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤，全球每年新發(fā)約43 萬(wàn)例，其復(fù)發(fā)率及病死率較高[1]。目前BC 的治療包括膀胱腫瘤電切及根治性手術(shù)治療、放射治療、化學(xué)治療及卡介苗生物治療等，但該疾病復(fù)發(fā)率高，易出現(xiàn)局部浸潤(rùn)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[2]。深入研究BC 發(fā)病的機(jī)制，尋找有意義的診斷、治療及隨訪的腫瘤標(biāo)志物具有重要臨床意義。角蛋白-19（CK-19）基因位于17q21.2，該基因編碼的蛋白質(zhì)是角蛋白家族的一員。研究發(fā)現(xiàn)，卵巢癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌等腫瘤中均存在CK19 的表達(dá)，能激活β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞異常增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移[3-4]。 細(xì)胞角蛋白片段19 抗原21-1（CYFRA21-1）是由細(xì)胞角蛋白的可溶性片段與細(xì)胞角蛋白片段19 的單克隆抗體結(jié)合形成，主要位于上皮型腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞漿中。研究發(fā)現(xiàn)，食管鱗癌、支氣管肺癌等惡性腫瘤中均存在CYFRA21-1 異常升高，與較高的腫瘤分期密切相關(guān)，是腫瘤早期診斷的重要標(biāo)志物[5]。關(guān)于CK-19、CYFRA21-1 與BC的關(guān)系目前尚未探明，本研究擬通過(guò)檢測(cè)BC 患者血清CK-19 及CYFRA21-1 水平，探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 資料與方法

選取2020年1月—2021年6月西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院診治的83 例BC 患者作為BC 組。其中，男性50 例，女性33 例；年齡34～79 歲，平均（48.1±6.5）歲；病理分級(jí)：高分化23 例，中分化28 例，低分化32 例；腫瘤分期：Ⅰ、Ⅱ期49 例，Ⅲ、Ⅳ期34 例；肌層浸潤(rùn)38 例，非肌層浸潤(rùn)45 例；腫瘤直徑≤3 cm 41 例，直徑＞3 cm 42 例；伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移36 例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移47 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①病理學(xué)檢查明確診斷為BC；②初次診斷；③未合并其他腫瘤；④未接受手術(shù)、放射治療、化學(xué)治療及生物治療等。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并泌尿系統(tǒng)感染、結(jié)石等泌尿系統(tǒng)疾??；②伴嚴(yán)重心肺等臟器功能不全；③合并自身免疫系統(tǒng)疾病；④合并精神神經(jīng)功能障礙。選取同期本院診治的60 例泌尿系統(tǒng)良性疾病患者作為良性疾病組。其中，男性39 例，女性21 例；年齡32～80 歲，平均（46.5±6.7）歲；疾病類(lèi)型：尿路感染31 例，尿路結(jié)石17 例，腎血管平滑肌脂肪瘤12 例。選取同期在本院體檢的60 例健康群眾作為對(duì)照組。其中，男性36 例，女性24 例；年齡33～77 歲，平均（45.9±7.1）歲。各組性別、年齡比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，患者及家屬均簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法

采用ELISA 檢測(cè)血清CK-19 水平。取清晨空腹靜脈血約4 ml，EDTA 抗凝，靜置2 h 后，以2 500 r/min離心10 min，分離上層血清，置入-80℃冰箱冷凍保存。實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，CK-19 ELISA 試劑盒購(gòu)自上海江萊公司。設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，樣本孔加入樣本，空白孔不加，向標(biāo)準(zhǔn)品孔及樣本孔加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的CK-19 抗體，室溫下孵育1 h，洗滌液洗滌5 次，加入底物液后室溫避光孵育15 min，加入終止液后450 nm 波長(zhǎng)處測(cè)各孔的OD 值。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，根據(jù)樣本OD值計(jì)算對(duì)應(yīng)的濃度值。應(yīng)用化學(xué)免疫發(fā)光法檢測(cè)血清CYFRA21-1 水平。全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀及相應(yīng)試劑盒購(gòu)自美國(guó)雅培公司。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較用單因素方差分析，進(jìn)一步的兩兩比較用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較用χ2檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Pearson法；繪制受試者工作特征（ROC）曲線(xiàn)預(yù)測(cè)各指標(biāo)對(duì)BC 的診斷價(jià)值。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組CK-19、CYFRA21-1水平比較

各組CK-19、CYFRA21-1 水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），BC 組高于良性疾病組和對(duì)照組，良性疾病組高于對(duì)照組。見(jiàn)表1。

表1 各組CK-19、CYFRA21-1水平比較 （±s）

注：①與良性疾病組比較，P ＜0.05；②與對(duì)照組比較，P ＜0.05。

組別BC組良性疾病組對(duì)照組F 值P 值CYFRA21-1/（μg/L）29.46±2.71①②9.22±1.96②2.76±0.45 3365.030 0.000 n 83 60 60 CK-19/（ng/ml）16.43±3.32①②5.28±0.76②2.74±0.37 820.513 0.000

2.2 不同臨床特征BC 患者CK-19、CYFRA21-1水平比較

不同腫瘤分期BC 患者CK-19、CYFRA21-1 水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），腫瘤分期Ⅲ、Ⅳ期高于腫瘤分期I、Ⅱ期。不同性別、年齡、腫瘤直徑、浸潤(rùn)深度和有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移BC 患者CK-19、CYFRA21-1 水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表2。

表2 不同臨床特征BC患者CK-19、CYFRA21-1水平比較 （±s）

表2 不同臨床特征BC患者CK-19、CYFRA21-1水平比較 （±s）

臨床特征年齡＜60歲≥60歲性別n CK-19/（ng/ml）t 值P 值CYFRA21-1/（μg/L）t 值P 值39 44 15.78±3.91 17.06±3.52 1.570 0.120 28.93±2.98 29.93±3.01 1.518 0.133男女50 33 17.01±3.55 15.62±3.96 1.667 0.099 29.00±2.56 30.15±3.15 1.826 0.072腫瘤分期Ⅰ、Ⅱ期Ⅲ、Ⅳ期病理分級(jí)高、中分化低分化腫瘤直徑≤3 cm＞3 cm浸潤(rùn)深度肌層浸潤(rùn)非肌層浸潤(rùn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移49 34 13.02±3.18 21.42±4.29 10.246 0.000 25.44±2.23 35.25±3.46 16.624 0.000 51 32 15.97±3.60 17.24±3.88 1.518 0.133 29.22±2.50 29.84±2.86 1.040 0.301 41 42 15.76±3.41 17.14±3.62 1.187 0.078 29.11±2.54 29.80±2.81 1.173 0.244 38 45 17.08±3.66 15.93±3.81 1.395 0.167 30.05±2.99 28.96±2.62 1.770 0.080有無(wú)36 47 17.13±3.25 15.94±4.04 1.445 0.152 29.85±3.02 29.16±2.58 1.121 0.266

2.3 BC患者CK-19與CYFRA21-1水平的相關(guān)性

Pearson 相關(guān)性分析顯示，BC 患者CK-19 與CYFRA21-1 水平呈正相關(guān)（r=0.578，P=0.000）。見(jiàn)圖1。

圖1 BC患者CK-19與CYFRA21-1的相關(guān)性散點(diǎn)圖

2.4 血清CK-19、CYFRA21-1單獨(dú)及聯(lián)合檢測(cè)對(duì)BC的診斷價(jià)值

以約登指數(shù)最大值作為截?cái)嘀?。CK-19、CYFRA21-1 單獨(dú)及聯(lián)合檢測(cè)對(duì)BC 診斷的曲線(xiàn)下面積（AUC）分別為0.841、0.846 和0.923，聯(lián)合檢測(cè)的診斷價(jià)值大于CK-19 或CYFRA21-1 單獨(dú)檢測(cè)（Z=2.445 和2.168，P=0.001 和0.005）。此外，聯(lián)合檢測(cè)具有較高的敏感性和特異性，分別為0.817 和0.923。見(jiàn)圖2和表3。

圖2 ROC曲線(xiàn)

表3 CK-19、CYFRA21-1及聯(lián)合檢測(cè)對(duì)BC的診斷價(jià)值參數(shù)

3 討論

BC 是常見(jiàn)的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤，特別是肌層浸潤(rùn)性BC 易出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及盆腔轉(zhuǎn)移，患者預(yù)后不佳。近年來(lái)雖然BC 的手術(shù)、放療、化療及綜合治療一定程度上改善了患者的長(zhǎng)期生存時(shí)間，但部分患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已出現(xiàn)肌層浸潤(rùn)或轉(zhuǎn)移[6]。因此，BC 的早期診斷及治療對(duì)改善患者預(yù)后至關(guān)重要。目前BC 尚無(wú)理想的早期診斷指標(biāo)。膀胱鏡檢查加病理活檢是BC 診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但具有一定的侵入性。尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查具有良好的特異性，但敏感性較低[7]。因此，深入研究BC 的發(fā)生機(jī)制，尋找有價(jià)值的血清腫瘤標(biāo)志物，對(duì)診斷、治療及隨訪具有重要意義。

CK-19 是一種存在于上皮細(xì)胞胞漿中的低分子蛋白，參與構(gòu)成細(xì)胞骨架的中間絲狀物，能夠維持上皮細(xì)胞之間的完整性及組織的穩(wěn)定性。有研究發(fā)現(xiàn)，CK-19 在卵巢癌、胰腺癌等均表達(dá)升高[8]。本研究中，BC 組患者血清中CK-19 水平明顯高于良性疾病組及對(duì)照組，表明BC 血清中CK-19 水平上調(diào)。其原因可能是：腫瘤發(fā)生時(shí)，細(xì)胞內(nèi)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子如Twist 相關(guān)蛋白1、Snail1 等能夠直接促進(jìn)CK-19 的表達(dá)，引起細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的重塑，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲及遷移能力[9]。本研究亦表明，腫瘤分期Ⅲ、Ⅳ期患者血清CK-19 表達(dá)較高，表明CK-19 作為一種干細(xì)胞標(biāo)志分子，其表達(dá)上調(diào)促進(jìn)BC 的惡性進(jìn)展。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，CK-19 陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞亞群具有腫瘤干細(xì)胞的特性，腫瘤細(xì)胞具有較強(qiáng)的組織可塑性，遷移和侵襲能力增加，腫瘤分期較高[10]。此外，腫瘤中CK-19 活性異常增加，能夠異常激活Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的過(guò)度增殖及轉(zhuǎn)移[4]。因此，BC 中CK-19 的表達(dá)升高可能參與腫瘤進(jìn)展。

CYFRA21-1 是一種酸性蛋白質(zhì)，分布于單層或復(fù)層上皮性腫瘤細(xì)胞胞漿中，由細(xì)胞角蛋白-19 的2個(gè)單克隆抗體構(gòu)成，參與構(gòu)成上皮細(xì)胞中間絲，作為支架能夠維持上皮細(xì)胞之間的完整性及組織的穩(wěn)定性。研究發(fā)現(xiàn)，CYFRA21-1 在支氣管肺癌、乳腺癌等腫瘤中均表達(dá)升高[11]。MATUSZCZAK 等[12]發(fā)現(xiàn)，BC 患者尿液中CYFRA21-1 表達(dá)水平升高，且其表達(dá)水平升高與患者的不良預(yù)后有關(guān)。因此，CYFRA21-1 可能是一種新的BC 標(biāo)志物。本研究中，BC 組患者血清中CYFRA21-1 水平高于良性疾病組及對(duì)照組，表明BC 血清中CYFRA21-1 水平上調(diào)。其原因?yàn)椋赫Ｇ闆r下組織中CYFRA21-1 處于低表達(dá)或無(wú)表達(dá)的狀態(tài)，當(dāng)腫瘤細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化時(shí)，細(xì)胞角蛋白含量增加，腫瘤細(xì)胞大量破壞，導(dǎo)致細(xì)胞角蛋白的可溶性片段CYFRA21-1 釋放入血，引起血清水平升高。本研究亦表明，腫瘤分期Ⅲ、Ⅳ期患者血清CYFRA21-1 表達(dá)明顯較高， 表明CYFRA21-1 作為一種干細(xì)胞標(biāo)志分子，其表達(dá)上調(diào)促進(jìn)BC 的惡性進(jìn)展。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，CYFRA21-1 能夠促進(jìn)粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子的表達(dá)[13]，并促進(jìn)單核巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)腫瘤組織中，抑制腫瘤微環(huán)境中腫瘤殺傷性T 淋巴細(xì)胞的正常功能，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞過(guò)度增殖，遷移和侵襲能力增加，腫瘤分期升高[14]。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)BC 患者血清中CK-19 與CYFRA21-1 水平呈正相關(guān)。提示兩者可能共同參與BC 的疾病進(jìn)展過(guò)程，可能是CK-19 和CYFRA21-1表達(dá)均參與抑制BC 腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞的腫瘤殺傷功能，促進(jìn)BC 的惡性進(jìn)展[11,14]。因此，兩者可能均是影響B(tài)C 發(fā)生、發(fā)展的分子標(biāo)志。本研究發(fā)現(xiàn)聯(lián)合檢測(cè)的診斷價(jià)值大于單獨(dú)檢測(cè)，并且聯(lián)合檢測(cè)具有較高的敏感性和特異性，提示聯(lián)合檢測(cè)可作為BC診斷的重要參考指標(biāo)。

綜上所述，血清CK-19、CYFRA21-1 表達(dá)上調(diào)，CK-19 與CYFRA21-1 呈明顯正相關(guān)，并且兩者均與腫瘤分期有關(guān)，參與了BC 的發(fā)生、發(fā)展。聯(lián)合檢測(cè)血清CK-19、CYFRA21-1 水平對(duì)BC 具有較高的診斷價(jià)值，有望成為新的BC 診斷標(biāo)志物。但兩者具體作用機(jī)制及相互作用有待深入研究。