雷公藤多苷通過PI3K/Akt通路對糖尿病腎病大鼠熱休克蛋白90及PGC-1α表達的影響*

于向慧，何艷玲，楊雨菲，張庚良，馮曉辭

（1.河北省中醫(yī)院內(nèi)分泌科，河北石家莊 050032；2.河北中醫(yī)學(xué)院，河北石家莊 050091）

糖尿病腎病（diabetic nephropathy, DN）是由高糖微環(huán)境引起的多種病理機制協(xié)同作用導(dǎo)致的腎組織細胞凋亡和纖維化，表現(xiàn)為腎功能逐漸下降[1]。目前關(guān)于DN 的發(fā)病機制仍不明確，有研究認為高糖微環(huán)境激活PI3K/Akt 通路，促進炎癥細胞因子等基因轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致細胞凋亡和纖維化[2]。熱休克蛋白（heat shock protein, HPS）是分子伴侶蛋白的一個家族，參與蛋白質(zhì)折疊和穩(wěn)定化，其中HSP90 是最豐富的一種，各種壓力條件（如高糖、高溫、缺氧等）均可誘導(dǎo)HSP90 的活化[3]。最新研究發(fā)現(xiàn)，DN 患者HPS90 明顯上調(diào)，但是其在DN 中的作用機制和調(diào)控方式仍不明確[4]。過氧化物酶體增殖物激活受體- γ 共激活因子-1α（peroxisome proliferatoractivated receptor-γ coactivator-1α, PGC-1α）可通過調(diào)控線粒體功能調(diào)節(jié)活性氧自由基，進而參與DN 的發(fā)生、發(fā)展[5]。雷公藤多甙（tripterygium glycosides, TG）是從傳統(tǒng)中藥雷公藤中提取的一種化合物，有緩解腎組織損傷的作用[6]。近年來研究顯示，TG 對DN 也具有治療作用[7]。也有研究顯示，TG 可通過抑制PI3K/Akt 通路，緩解甲狀腺氧化應(yīng)激狀態(tài)[8]，但是TG 是否通過PI3K/Akt緩解DN，以及是否對HSP90 和PGC-1α 產(chǎn)生影響仍不清楚。本文主要分析TG 通過PI3K/Akt 通路對DN 大鼠HSO90、PGC-1α 水平的影響。

1 材料與方法

1.1 動物模型復(fù)制及分組

65 只SD 大鼠SPF 級，雄性，12 周，體重220～250 g，購自華北制藥股份有限公司。實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（冀）2019-004，實驗動物使用許可證號：SYXK（冀）2019-011。取50 只SD 大鼠腹腔注射鏈脲佐菌素（60 mg/kg，pH=4.5）復(fù)制DN模型[9]。注射后第3 天抽取大鼠檢測尾靜脈血檢測空腹血糖，空腹血糖＞16.67 mmol/L 證明糖尿病模型復(fù)制成功。繼續(xù)飼養(yǎng)4 周后，收集大鼠尿液檢測尿微量白蛋白，以尿微量白蛋白＞15 μg/ml 確定DN 模型復(fù)制成功。本研究模型復(fù)制成功率為92.00%（46/50）。隨機選擇45 只模型復(fù)制成功的大鼠分為DN 組、DN+TG組和DN+TG+SC79組，每組15只；選擇15只健康大鼠作為對照組。DN+TG 組和DN+TG+SC79 組大鼠TG 灌胃，根據(jù)人體和大鼠體質(zhì)量換算出劑量為20 mg/kg，1 次/d[10]。DN+TG+SC79 組大鼠腹膜內(nèi)注射SC79 以激活PI3K/Akt 通路[11]，劑量為0.04 mg/g，2 次/周。連續(xù)干預(yù)4 周后進行實驗。

1.2 主要試劑及儀器

鏈脲佐菌素（上海如吉生物科技發(fā)展有限公司），PI3K/Akt通路激動劑SC79（S7863）（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）（南京森貝伽生物科技有限公司），蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin,HE）和Masson染色試劑盒、RNAspin Mini 和miRNeasy Mini 試劑盒、Bestar qRT-PCR 和Bestar qRT-PCR 試劑盒、TaqMan miRNA試劑盒、一抗和山羊抗免疫球蛋白G（IgG）二抗（1∶1 000 稀釋，#ab6721）、硝酸纖維素膜、電化學(xué)發(fā)光（electrochemiluminescence,ECL）顯色試劑盒購自廣州易錦生物技術(shù)有限公司。SMT100V小動物自動生化分析儀、顯微鏡購自上海易畢恩生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 腎功能指標和炎癥因子通過SMT100V 小動物自動生化分析儀檢測大鼠24 h 尿蛋白和肌酐，評估腎功能。收集大鼠尾靜脈血，2 000 r/min 離心20 min，收集上層血清，用ELISA 試劑盒檢測白細胞介素1β（Interleukin-1β, IL-1β）和IL-6，用酶標儀檢測450 nm 處的吸光度值，然后根據(jù)標準曲線計算IL-1β 和IL-6 水平。

1.3.2 HE 染色大鼠安樂死后取出腎組織并在室溫條件下用4%多聚甲醛固定6 h。乙醇脫水（從低濃度到高濃度）后，將組織包埋在石蠟中，制作5 μm 厚的切片，固定在載玻片上。載玻片在室溫條件下用蘇木精染色10 min，自來水洗滌1～2 min后將載玻片置于10%冰醋酸中10 s，然后置于1%氨水中，直到切片變藍。隨后用自來水清洗1～2 min后將載玻片放入曙紅中10 s。用乙醇（濃度分別為70%、90%、95%和100%）脫水后，將載玻片置于二甲苯中2 min；重復(fù)此步驟1 次。最后用中性膠密封玻片，在倒置顯微鏡下觀察大鼠腎組織損傷情況。

1.3.3 Masson 染色將腎組織固定在10%中性甲醛緩沖液，石蠟包埋、切片（厚約4 μm），用Masson三色染色劑染色，以檢測腎間質(zhì)纖維化的面積。2位研究人員使用IDA-2000 高分辨率數(shù)字顯微鏡和圖像分析系統(tǒng)，在400 倍放大鏡下評估每個視野的纖維化面積百分比。

1.3.4 Western blotting 檢測HPS90 和PGC-1α 蛋白表達將腎組織置于RIPA 裂解緩沖液中，冰上裂解。通過8% SDS-PAGE 分離每個樣品中等量（50 μg）蛋白，并將其轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。室溫條件下將膜浸入5%脫脂牛奶中2 h，封閉非特異性抗原。膜與一抗體在4℃條件下孵育過夜，然后將膜與相應(yīng)的辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗在室溫下孵育1 h。使用ECL 顯色試劑盒顯色，Quantum One 軟件分析灰度，計算蛋白相對表達量。

1.3.5 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR）檢測HPS90 和PGC-1α mRNA 表達采用RNeasy Mini試劑盒提取腎組織總RNA，Bestar qRT-PCR 試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，條件如下：37℃15 min，98℃5 min。采用Bestar?qRT-PCR 預(yù)混液進行qRT-PCR實驗，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性2 min，94℃變性20 s，58℃退火20 s，72℃延伸20 s，共計40 個循環(huán)，72℃繼續(xù)延伸4 min。使用Agilent Stratagene Mx3000P序列檢測系統(tǒng)進行qRT-PCR 分析。通過比較循環(huán)閾值并以GAPDH 作為內(nèi)參，計算mRNA 相對表達量。qRT-PCR引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，比較用方差分析或t檢驗，多組間進一步兩兩比較用SNK-q檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血糖水平比較

各組大鼠干預(yù)前的血糖水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；各模型組大鼠干預(yù)前血糖均高于對照組，且＞16.67 mmol/L。各組大鼠干預(yù)后的血糖水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義義（P＜0.05）；DN+TG 組、DN+TG+SC79 組低于DN 組（P＜0.05）。對照組、DN 組大鼠干預(yù)前后的血糖水平比較，經(jīng)t檢驗，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=0.842 和0.126，P=0.412 和0.106）。DN+TG 組、DN+TG+SC79 組大鼠干預(yù)前后的血糖水平比較，經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=35.058 和36.821，均P=0.000），干預(yù)后血糖降低。見表2。

表2 各組大鼠空腹血糖水平比較（n=15，mmol/L，±s）

表2 各組大鼠空腹血糖水平比較（n=15，mmol/L，±s）

組別對照組DN組DN+TG組DN+TG+SC79組F 值P 值干預(yù)前4.96±0.55 29.05±2.44 29.67±2.21 30.21±2.38 28.763 0.001干預(yù)后4.52±0.51 30.11±2.84 22.05±2.15 23.97±2.34 30.237 0.001

2.2 TG對大鼠腎組織損傷的影響

對照組腎小球和腎小管正常；DN組腎小球出現(xiàn)水腫和炎癥浸潤，結(jié)構(gòu)出現(xiàn)異常，腎小球膨大；DN+TG組腎小球結(jié)構(gòu)基本完整，水腫和炎癥浸潤有所緩解；DN+TG+SC79組腎小球損傷情況與DN組類似。見圖1。

圖1 各組大鼠腎組織損傷情況 （HE染色×400）

2.3 TG對大鼠腎功能的影響

各組大鼠腎功能指標比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較結(jié)果：DN 組24 h 尿蛋白和肌酐高于對照組和DN+TG 組（P＜0.05）；DN+TG+SC79 組的24 h 尿蛋白和肌酐高于DN+TG 組（P＜0.05）。見表3。

表3 各組大鼠腎功能指標比較 （n=15，±s）

表3 各組大鼠腎功能指標比較 （n=15，±s）

組別對照組DN組DN+TG組DN+TG+SC79組F 值P 值24 h尿蛋白/mg 24.57±3.85 248.16±30.28 126.92±19.74 238.24±31.06 25.179 0.001肌酐/（μmol/L）28.35±3.96 55.42±7.47 39.38±5.58 52.51±7.43 23.731 0.001

2.4 TG對大鼠腎纖維化的影響

對照組、DN 組、DN+TG 組、DN+TG+SC79 組的腎組織纖維化面積百分比分別為（3.74±0.45）%、（21.77±2.06）%、（7.94±0.91）%和（19.32±1.89）%，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F= 27.356，P=0.001）。進一步兩兩比較結(jié)果：DN 組高于對照組和DN+TG 組（P＜0.05）；DN+TG+SC79 組高于DN+TG 組（P＜0.05）。見圖2。

圖2 各組大鼠腎纖維化情況 （Masson染色×400）

2.5 各組大鼠PI3K/Akt通路激活情況

各組大鼠腎組織中PI3K/Akt 通路激活情況比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較結(jié)果：DN 組p-PI3K/PI3K 和p-Akt/Akt 高于對照組和DN+TG 組（P＜0.05）；DN+TG+SC79 組p-PI3K/PI3K 和p-Akt/Akt 高于DN+TG 組（P＜0.05）。見表4和圖3。

圖3 各組大鼠腎組織中PI3K/Akt通路的表達

表4 各組大鼠PI3K和Akt磷酸化水平比較（n=15，±s）

表4 各組大鼠PI3K和Akt磷酸化水平比較（n=15，±s）

組別對照組DN組DN+TG組DN+TG+SC79組F 值P 值p-PI3K/PI3K 0.56±0.05 2.97±0.25 1.17±0.10 2.06±0.17 19.765 0.001 p-Akt/Akt 0.41±0.04 2.18±0.19 1.05±0.09 1.84±0.16 22.124 0.001

2.6 TG對大鼠腎組織HSP90、PGC-1α轉(zhuǎn)錄水平的影響

各組大鼠腎組織HSP90、PGC-1α mRNA 相對表達量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較結(jié)果：DN 組HSP90 mRNA相對表達量高于對照組和DN+TG 組（P＜0.05），而PGC-1α mRNA 相對表達量低于對照組和DN+TG 組（P＜0.05）；DN+TG+SC79 組HSP90 mRNA 相對表達量高于DN+TG 組（P＜0.05），而PGC-1α mRNA 相對表達量低于DN+TG 組（P＜0.05）。見表5。

表5 各組大鼠HSP90和PGC-1α mRNA相對表達量比較 （n=15，±s）

表5 各組大鼠HSP90和PGC-1α mRNA相對表達量比較 （n=15，±s）

組別對照組DN組DN+TG組DN+TG+SC79組F 值P 值HSP90 mRNA 0.94±0.09 4.89±0.45 3.01±0.28 4.74±0.45 15.764 0.001 PGC-1α mRNA 4.72±0.43 0.91±0.09 3.54±0.41 1.45±0.22 14.987 0.001

2.7 TG對大鼠腎組織HSP90、PGC-1α蛋白表達的影響

各組大鼠腎組織HSP90 和PGC-1α 蛋白相對表達量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較結(jié)果：DN 組HSP90 蛋白相對表達量高于對照組和DN+TG 組（P＜0.05），而PGC-1α 蛋白相對表達量低于對照組和DN+TG 組（P＜0.05）；DN+TG+SC79 組HSP90 蛋白相對表達量高于DN+TG 組，而PGC-1α 蛋白相對表達量低于DN+TG 組（P＜0.05）。見表6和圖4。

表6 各組大鼠HSP90和PGC-1α蛋白相對表達量比較（n=15，±s）

表6 各組大鼠HSP90和PGC-1α蛋白相對表達量比較（n=15，±s）

組別對照組DN組DN+TG組DN+TG+SC79組F 值P 值HSP90蛋白0.62±0.06 3.64±0.32 2.31±0.21 3.38±0.30 19.765 0.001 PGC-1α蛋白2.53±0.21 0.58±0.05 2.06±0.18 0.91±0.09 17.432 0.001

圖4 各組大鼠腎組織HSP90和PGC-1α蛋白的表達

2.8 TG對大鼠IL-1β、IL-6水平的影響

各組大鼠炎癥因子水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較結(jié)果：DN 組IL-1β、IL-6 水平高于對照組和DN+TG組（P＜0.05）；DN+TG+SC79 組IL-1β、IL-6 水平高于DN+TG 組（P＜0.05）。見表7。

表7 各組大鼠IL-1β、IL-6水平比較（n=15，pg/mL，±s）

表7 各組大鼠IL-1β、IL-6水平比較（n=15，pg/mL，±s）

組別對照組DN組DN+TG組DN+TG+SC79組F 值P 值IL-1β 14.67±2.01 86.32±9.65 38.76±4.63 80.77±9.44 23.087 0.001 IL-6 24.21±2.86 96.75±9.39 49.02±5.67 91.34±10.43c 22.456 0.001

3 討論

全世界超過4億人患有糖尿病，每年死亡370萬人[12]。長期高血糖會損害器官的小血管，主要包括眼睛、腎臟和神經(jīng)。在許多國家，DN 是導(dǎo)致終末腎臟疾病最常見的原因，表現(xiàn)為腎小球肥大、蛋白尿和腎小球膜細胞分泌的細胞外基質(zhì)（extracellular matrix, ECM）成分積累。在DN 中，促炎癥細胞因子（如IL-1β 和IL-6 等）水平升高，影響腎單位的轉(zhuǎn)運蛋白和離子通道的功能，并導(dǎo)致腎臟纖維化和腎小球硬化。腎小球功能性細胞喪失與ECM 蛋白（尤其是間質(zhì)膠原蛋白，包括Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ型膠原蛋白）過度積累密切相關(guān)，腎纖維化是DN進展的關(guān)鍵機制，也是導(dǎo)致腎功能喪失的主要原因[13]。但是目前尚無治療DN 的有效方法。

有研究顯示，PI3K/Akt 在DN 中發(fā)揮重要作用，PI3K 和Akt 被磷酸化激活后，進入細胞核調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄，從而促進炎癥因子和ECM 等的表達，損傷腎功能[14-15]。中藥在治療DN 中取得了長足的發(fā)展，有研究表明中藥可通過抑制PI3K/Akt 通路，緩解DN，保護腎功能[16]。TG 是從雷公藤根木質(zhì)部提取和純化的活性物質(zhì)，已被廣泛用于治療自身免疫和炎癥疾病，包括類風濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡及腎病綜合征等[17]。并且近年來也有生物信息學(xué)研究結(jié)果顯示，TG 具有緩解糖尿病引起的器官纖維化的作用，從而緩解包括DN 在內(nèi)的糖尿病并發(fā)癥[18]，但是TG 是否通過PI3K/Akt 通路對DN 腎功能和纖維化具有緩解作用仍未明確。本研究通過TG 灌胃干預(yù)DN 小鼠，并通過SC79 激活PI3K/Akt通路，SC79 可作為促進動物模型中PI3K 和Akt 磷酸化的試劑[19]。結(jié)果顯示TG 能夠明顯緩解DN 大鼠的腎組織損傷和纖維化，保護腎功能。通過Western blotting 結(jié)果檢測證實DN 大鼠模型腎組織中PI3K 和Akt 蛋白磷酸化水平明顯升高，而TG 可顯著抑制PI3K/Akt 通路的激活，SC79 可使PI3K 和Akt磷酸化水平恢復(fù)。并且本研究結(jié)果還表明，使用SC79 激活PI3K/Akt 通路后，TG 對腎組織的保護作用被阻斷。有研究發(fā)現(xiàn)，TG 可通過抑制PI3K/Akt通路，提高卵巢癌細胞對順鉑的敏感性[20]。陳婷等[21]研究發(fā)現(xiàn)TG 可通過減少PI3K 和Akt 磷酸化水平，抑制青光眼手術(shù)后的纖維化。有研究顯示TG也具有降低血糖的作用，但是其對血糖的影響有限，干預(yù)后血糖濃度依舊＞16.67 mmol/L，這對保護腎臟組織作用輕微。這提示在DN 中，TG 可能通過抑制PI3K/Akt 通路的激活，保護腎組織并減少ECM的累積，從而保護腎功能。但是關(guān)于TG 抑制PI3K/Akt 后，通過何種分子機制緩解DN 仍不清楚。

PI3K-Akt 信號通路的活性可以被類脂磷酸酶PTEN 和SHIP 負調(diào)節(jié)，但迄今為止尚未發(fā)現(xiàn)下調(diào)Akt 活性的特異磷酸酶，而用磷酸酶抑制劑處理細胞后，Akt 的磷酸化和活性均有所增加。最近發(fā)現(xiàn)HSP90 能結(jié)合Akt，阻止Akt 被PP2A 磷酸酶的去磷酸化而失活，因此具有保護Akt 的作用。另外激活PI3K/Akt 可磷酸化Sirt1，隨后Sirt1 乙酰化激活PGC-1α 從而發(fā)揮其作用。為進一步分析TG 通過PI3K/Akt 緩解DN 的作用機制，本文檢測了HSP90和PGC-1α 表達。HSP90 的表達可被PI3K/Akt 通路上調(diào)[22]，體外研究也顯示高糖環(huán)境下腎小管細胞中HSP90 升高，其過表達加速細胞損傷[23]。而抑制HSP90 可使DN 大鼠IL-6 等炎癥因子水平降低，保護腎臟功能[24]。PGC-1α 具有保護線粒體、緩解氧化應(yīng)激和抗纖維化作用[25]，并且與PI3K/Akt 之間存在串擾，兩者互相調(diào)控[26]。有研究結(jié)果顯示，中藥在緩解DN 的同時還會促進PGC-1α 的表達[27]。本研究結(jié)果顯示，DN 組大鼠腎組織中HSP90 表達及炎癥細胞因子水平均顯著升高，而PGC-1α 表達降低，TG 能夠抑制HSP90 表達和降低炎癥因子，并促進PGC-1α 的表達，而使用SC79 激活PI3K/Akt后，TG 抑制HSP90 表達和降低炎癥因子水平，以及促進PGC-1α 表達的作用被阻斷。有研究發(fā)現(xiàn)，TG 可通過抑制HSP90 的表達改善腎病綜合征患者腎功能[9]。最新研究表明，雷公藤的活性提取物可通過促進PGC-1α 的轉(zhuǎn)錄和翻譯緩解炎癥反應(yīng)，進而調(diào)控細胞代謝，保護細胞[28]。提示DN 的發(fā)生可能與PI3K/Akt 促進HSP90 表達，抑制PGC-1α 表達有關(guān)，而TG 可能通過激活PI3K/Akt 通路，調(diào)節(jié)p-Akt 的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能，進而抑制HSP90 的轉(zhuǎn)錄和翻譯，促進PGC-1α 的表達，起到緩解DN 的作用。

綜上所述，TG 可以通過抑制PI3K/Akt 通路，抑制HSP90 的轉(zhuǎn)錄和翻譯，促進PGC-1α 的表達，并發(fā)揮抗炎和抗纖維化作用，從而緩解DN。