異源表達乙酰輔酶A羧化酶對大腸桿菌產(chǎn)脂肪酸的影響

楊青，孫子羽，滿都拉，王佳，劉瑾，金晶晶，陳忠軍

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018）

脂肪酸是細菌的細胞膜磷脂的重要組成部分之一，影響著細菌的生長、代謝等幾乎所有的生命活動。細胞膜需要有一定的流動性，才能夠正常地發(fā)揮作用，維持其結(jié)構(gòu)和功能[1]。在食品行業(yè)，不同的脂肪酸具有不同的功能。有些脂肪酸可以改善食品的口感、風味和質(zhì)構(gòu)，也有些脂肪酸使得食品更容易被消化吸收，甚至可以促進大腦發(fā)育、改善人體健康[2]。此外，脂肪酸還可以用作工業(yè)中的潤滑劑、乳化劑，合成柴油等[3]，還可應用于化妝品、醫(yī)藥等行業(yè)[4-5]。黃藝珠等[6]的研究表明中鏈脂肪酸及其甘油一酯對致病菌、病毒及寄生蟲的活性具有一定的抑制作用。目前脂肪酸合成主要分為化學合成法和微生物合成法，其中化學合成法具有不可持續(xù)性、脂肪酸產(chǎn)量低、生產(chǎn)成本較高等缺陷，限制了脂肪酸的大規(guī)模生產(chǎn)[7-9]。因此利用微生物合成脂肪酸成為一個熱點，目前用于脂肪酸合成的菌株主要為大腸桿菌。大腸桿菌由于其遺傳背景清晰、易于工程調(diào)控、可高密度發(fā)酵等優(yōu)點常被用作出發(fā)菌株進行代謝工程的研究。曲璟秋等[10]通過同時缺失大腸桿菌中β-氧化途徑中的脂酰輔酶A合成酶基因fadD與脂酰輔酶A脫氫酶基因fadE，使得大腸桿菌脂肪酸產(chǎn)量達到19.2 mg/L。LU等[11]對大腸桿菌進行基因改造后，脂肪酸產(chǎn)量可以達到2.5 g/L，其中游離脂肪酸占50%。LIU等[12]將?；d體蛋白（acyl carrier protein，ACP）進行表達，從而增加了大腸桿菌中短鏈脂肪酸的比例。

乙酰輔酶A羧化酶是微生物在脂肪酸合成過程中的一個限速酶，生物體能以乙酰輔酶A作為前體物質(zhì)，通過聚合轉(zhuǎn)?；饔谩⒖s合反應、還原反應、脫水反應和再還原反應5步循環(huán)反應合成脂肪酸[13]。乙酰輔酶A羧化酶催化乙酰輔酶A向丙二酰單酰輔酶A的轉(zhuǎn)化[14]，然后在脂肪酸合成酶的作用下合成一系列脂肪酸[15]，是脂肪酸生物合成的關(guān)鍵酶或限速酶[16]。谷氨酸棒桿菌的乙酰輔酶A羧化酶由生物素化的α-亞基accBC，β-亞基 accD1 和小分子等組成，Gande等[17]研究表明accBC與accD1也是霉菌酸合成所必需的。李玲玲等[18]通過過量表達硫酯酶基因以及結(jié)合表達乙酰輔酶A羧化酶，最終獲得了188.9 mg/L的中鏈脂肪酸（medium chain fatty acids，MCFAs）。Davis等[19]利用啟動子過表達大腸桿菌?；o酶羧化酶ACC的4個亞基，丙二酰輔酶A的含量提高了100倍，脂肪酸含量提高了6倍。

乙酰輔酶A羧化酶是在脂肪酸合成過程中的關(guān)鍵酶，但目前為止，對于調(diào)控乙酰輔酶A羧化酶提高脂肪酸產(chǎn)量的研究較少。本研究將谷氨酸棒桿菌的乙酰輔酶α-亞基以及β-亞基分別連接至表達載體pXMJ19，轉(zhuǎn)化至表達菌株大腸桿菌BL21，構(gòu)建異源表達菌株，通過誘導其過量表達，從而提高脂肪酸產(chǎn)量。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及質(zhì)粒

本研究所用的菌種與質(zhì)粒如表1所示。

表1 本研究所用的菌種與質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

1.1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨（10g/L），酵母提取物（10g/L），氯化鈉（10 g/L），固體LB培養(yǎng)基添加瓊脂粉（15 g/L）。添加終濃度為50 ng/μL的氯霉素。大腸桿菌在37℃條件下進行培養(yǎng)，谷氨酸棒桿菌在30℃條件下進行培養(yǎng)。

1.1.3 酶與試劑

溶菌酶（5 000 U/mg）：生工生物工程（上海）股份有限公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG）：北京庫來博科技有限公司；限制性內(nèi)切酶HindⅢ、XbaⅠ、GLX DNA聚合酶、T4 DNA連接酶：寶生物工程（大連）有限公司；細菌基因組提取試劑盒、聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）產(chǎn)物純化試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒、膠回收試劑盒：天根生化（北京）有限公司。

1.1.4 儀器與設備

TC-EA-48DA PCR基因擴增儀：杭州博日科技有限公司；DYY-6C電泳儀：北京市六一儀器廠；H3018DR高速冷凍離心機：上海知信實驗儀器技術(shù)有限公司；LGJ-18S冷凍干燥機：河南兄弟儀器設備有限公司；Clams680氣相色譜儀：珀金埃爾默儀器有限公司；NanoDrop 2000超微量分光光度計：美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.1.5 引物

使用引物設計軟件Primer 5.0設計引物。將谷氨酸棒桿菌ATCC 13032基因組序列作為參考，設計引物以獲得谷氨酸棒桿菌的乙酰輔酶A羧化酶α-亞基和β-亞基DNA片段。F1、R1分別為乙酰輔酶A羧化酶α-亞基的上下游引物，F(xiàn)2、R2分別為乙酰輔酶A羧化酶β-亞基的上下游引物。引物序列如下（下劃線部分為酶切位點）。

1.2 方法

1.2.1 谷氨酸棒桿菌基因組的提取

谷氨酸棒桿菌在30℃，180 r/min條件下進行培養(yǎng)。谷氨酸棒桿菌基因組利用柱式基因組DNA抽提試劑盒（細菌）來提取，提取步驟嚴格參照試劑盒說明書進行。由于谷氨酸棒桿菌屬于革蘭氏陽性菌，具有較厚的細胞壁，因此提取谷氨酸棒桿菌基因組時需要添加180 μL、終濃度為3 mg/mL溶菌酶并于37℃水浴1 h。

1.2.2 乙酰輔酶A羧化酶α-亞基accBC和β-亞基accD1的克隆

谷氨酸棒桿菌在30℃、180 r/min條件下進行培養(yǎng)。以谷氨酸棒桿菌ATCC 13032基因組DNA為模板，以F1、R1為上下游引物，使用聚合酶擴增基因accBC。同理以F2、R2分別為上下游引物擴增出基因accD1。50 μL PCR 體系：上下游引物各 1 μL；模板DNA 1 μL；5*GLX buffer 10 μL；dNTP 4 μL；GLX 1 μL；雙蒸水 32 μL。PCR擴增條件：預變性95℃，5 min；（95 ℃ 30 s、62℃ 15 s、72 ℃ 1 min），30 個循環(huán)；72 ℃10 min。冷卻至16℃，結(jié)束反應，PCR產(chǎn)物使用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.3 重組菌株的構(gòu)建

使用PCR產(chǎn)物純化試劑盒進行純化。純化后的accBC基因、accD1基因片段以及質(zhì)粒pXMJ19分別用HindⅢ和XbaⅠ進行雙酶切，將雙酶切后得到的產(chǎn)物在16℃下經(jīng)T4 DNA連接酶作用12 h以上，熱激法轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21中構(gòu)建重組菌株。經(jīng)50 ng/μL的氯霉素平板涂布后挑選抗性轉(zhuǎn)化子，然后提取質(zhì)粒并進行雙酶切鑒定。

1.2.4 乙酰輔酶A羧化酶α-亞基和β-亞基在大腸桿菌中的誘導表達

從斜面上取一環(huán)重組菌株接種于種子培養(yǎng)基中，在37℃、180 r/min的條件下在搖床上進行過夜培養(yǎng)。按5%接種量將種子液接入50 mL培養(yǎng)基中，在37℃、180 r/min的條件下?lián)u床培養(yǎng)。當菌液的OD600達到0.8時，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG進行誘導，然后在37℃、180 r/min的條件下繼續(xù)培養(yǎng)20 h。將菌液使用預冷的超純水低溫洗滌3次，洗滌后的菌體在冷凍干燥機中進行凍干[20]。

1.2.5 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）測定

取20 μL蛋白樣品與上樣緩沖液進行混合，混合后進行SDS-PAGE分離。開始電泳時電壓為100 V，用于蛋白樣品濃縮，待樣品進入分離膠后電壓調(diào)節(jié)到120 V直到電泳結(jié)束。利用考馬斯亮藍R-250對凝膠染色，超純水和脫色液進行脫色至無底色，獲得重組蛋白的蛋白電泳圖譜。

1.2.6 脂肪酸的測定

為了測定菌株的脂肪酸產(chǎn)量，使用異丙醇-正己烷溶液提取脂肪酸，并將其甲酯化進行氣相色譜分析[20]。稱取0.15g菌粉加入4mL正己烷-異丙醇混合物，加入Na2SO4溶液2 mL，室溫（24℃）離心（5 300 r/min，20 min）。取上清液于20 mL水解管中，混合后用氮氣吹干。加入2 mL氫氧化鈉-甲醇溶液在50℃水浴15min，冷卻后加入2 mL鹽酸-甲醇溶液，在80℃水浴1.5 h。冷卻至室溫（24℃），加入3 mL水和6 mL正己烷，振蕩、靜置分層。吸取上層液體（盡量吸凈），定容至10mL，加無水Na2SO4干燥后，可上機測定脂肪酸。

色譜條件：色譜柱DB-WAX（30 m×0.32 mm×0.25 μm）石英毛細管柱；柱箱程序升溫：起始120℃，保持5 min，升溫速率5℃/min，升到225℃，保持1 min，再以升溫速率8℃/min，升到240℃，保持5 min。氫火焰離子化檢測器260℃，進樣口汽化溫度260℃。載氣：N21.0mL/min，氫氣45mL/min，空氣450mL/min。進樣量1.0 μL。數(shù)據(jù)處理采用峰面積歸一化法。

2 結(jié)果與分析

2.1 accBC基因、accD1基因的擴增與測序

以谷氨酸棒桿菌ATCC 13032基因組為模板，使用高保真聚合酶GLX擴增accBC、accD1基因，結(jié)果見圖1和圖2。

圖1 accBC擴增片段Fig.1 Amplification of accBC gene

由圖1和圖2可知，PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果中分別出現(xiàn)約為1 815 bp和1 700 bp的條帶，結(jié)果與理論值相符，說明目的基因片段擴增成功。

圖2 accD1擴增片段Fig.2 Amplification of accD1 gene

2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

對重組質(zhì)粒分別進行雙酶切以及菌落PCR驗證，結(jié)果如圖3、圖4所示。

圖3 重組質(zhì)粒雙酶切Fig.3 Double digestion of recombinant plasmid

圖4 重組菌株菌落PCR驗證Fig.4 Colony PCR verification of recombinant strains

由圖3和圖4可知，雙酶切結(jié)果中出現(xiàn)約6 600 bp與1 815 bp、6 600 bp與1 700 bp的條帶，與理論值相符，說明表達載體構(gòu)建成功。重組菌株經(jīng)液體LB培養(yǎng)后，進行菌液PCR驗證（圖4），大小與理論值一致，再次驗證表達載體構(gòu)建成功。

2.3 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳

對菌株進行培養(yǎng)，前處理后進行SDS-PAGE，結(jié)果見圖5。

圖5 重組菌SDS-PAGE圖Fig.5 SDS-PAGE image of recombinant

由圖5可知，accBC基因與accD1基因編碼的蛋白大小分別63 kDa與58 kDa。蛋白條帶清晰且大小與理論值一致，表明重組質(zhì)?？梢栽诖竽c桿菌中正常表達，且與對照菌株相比，目的蛋白質(zhì)表達量更高。

2.4 乙酰輔酶A羧化酶α-亞基和β-亞基的過表達對脂肪酸合成的影響

使用氣相色譜測定菌株中脂肪酸含量，結(jié)果見圖6。

圖6 菌株BL-19、BL21-accBC和BL21-accD1的脂肪酸含量Fig.6 Fatty acid content of strains BL-19，BL21-accBC and BL-accD1

由圖6可知，與對照菌株BL-19相比，重組菌株脂肪酸含量有了明顯的提高，對照菌株BL-19中脂肪酸含量最高達到12.43 mg/g菌體干重，而重組菌株BL21-accD1可達到18.81 mg/g菌體干重，比對照菌株提高了51.32%；誘導菌株BL21-accBC中脂肪酸含量達到45.57 mg/g菌體干重，比對照菌株提高了266%。

重組菌株的脂肪酸組成變化如表2所示。

表2結(jié)果表明，重組菌株與對照菌株細胞內(nèi)積累脂肪酸的種類基本相同，主要為 C14∶0、C16∶0、C17∶0、C17∶1、C18∶0 及 C18∶1。對照菌株中未檢測到 C16∶1，但重組菌株 BL21-accBC、BL21-accD1 中出現(xiàn) C16∶1，占比分別可達2.07%、2.60%。同樣，重組菌株BL21-accBC中C17∶1的含量約為對照菌株的5倍，而在BL21-accD1中C17∶1也有所增加。過表達accBC與accD1基因增加了不飽和脂肪酸C16∶1與C17∶1的含量，重組菌株中的飽和脂肪酸（C18∶0）含量相對下降。此外，重組菌株的脂肪酸組成占比并沒有發(fā)生明顯變化，脂肪酸中主要種類仍為C16∶0。

表2 菌株BL-19及重組菌株的脂肪酸組成Table 2 Fatty acid composition of strain BL-19 and recombinant strain

3 結(jié)論

本研究首次使用質(zhì)粒pXMJ19構(gòu)建了異源表達菌株BL21-accBC、BL21-accD1，在發(fā)酵階段，通過添加終濃度為1mmol/L的IPTG進行誘導表達，從而影響了脂肪酸合成。重組菌BL21-accBC在誘導表達20 h后，脂肪酸積累達到45.57 mg/g菌體干重，較對照菌株提高了266%，BL21-accD1脂肪酸產(chǎn)量為18.81 mg/g菌體干重，比對照菌株提高了51.32%。此外，異源表達乙酰輔酶A羧化酶基因也會對脂肪酸的組成產(chǎn)生影響，大幅度增加了不飽和脂肪酸的產(chǎn)量。

本試驗通過代謝水平的改造來提高脂肪酸的產(chǎn)量，對微生物的資源開發(fā)與利用具有重大意義，是食品行業(yè)中脂肪酸合成一個新的方向。相比于大腸桿菌，谷氨酸棒桿菌是革蘭氏陽性菌，不含有內(nèi)毒素，是一種理想的基因調(diào)控宿主菌。因此，在后期可以通過在谷氨酸棒桿菌中同源表達accBC、accD1提高脂肪酸的產(chǎn)量。