紅豆越橘酵素發(fā)酵工藝優(yōu)化及其抗氧化性能研究

綦 菲，孫 妍，王 靜，孫銀玲，王偉明

（黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150036）

紅豆越橘為杜鵑花科（Ericaceae）越橘屬（Vaccinium）常綠小灌木的漿果，又名紅果、紅豆[1]。主產(chǎn)自我國黑龍江省大興安嶺地區(qū)，具有很高的營養(yǎng)價(jià)值。紅豆越橘果實(shí)中富含有機(jī)酸、多種維生素、微量元素及黃酮、原花青素、超氧化物歧化酶（SOD）等活性成分[2]。紅豆越橘果實(shí)中已檢出24種氨基酸，28種酚類化合物[3]。研究發(fā)現(xiàn)，紅豆越橘具有抗氧化、抗菌消炎、抗糖尿病、改善心腦血管疾病等功效[4-5]。紅豆越橘的價(jià)值也逐漸受到人們廣泛關(guān)注，但由于深度開發(fā)力度不夠，僅停留在產(chǎn)品粗加工階段，大多是紅豆越橘原漿、濃縮汁等形式。

酵素是以蔬菜、水果、菌類等為原料，經(jīng)過微生物發(fā)酵而制成的，富含多種維生素、礦物質(zhì)、生物酶等生物活性物質(zhì)的食品[6-7]。酵素具有抗氧化、抗腫瘤、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力及維持菌群平衡等功能[8]。植物酵素在發(fā)酵過程中實(shí)現(xiàn)了物質(zhì)轉(zhuǎn)化，不僅保留了原有果實(shí)中的固有營養(yǎng)物質(zhì)，還產(chǎn)生了新的活性成分。本文對(duì)紅豆越橘酵素的發(fā)酵工藝進(jìn)行研究，并對(duì)其SOD酶活力及清除1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基活性進(jìn)行測(cè)定，為紅豆越橘酵素的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Lambda 365紫外可見分光光度計(jì)（美國PerkinElmer）；DHP-9272恒溫培養(yǎng)箱，電熱恒溫水浴鍋（上海一恒）；LDZM-80KCS立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安）；電子分析天平（賽多利斯）；LG10-2.4A高速離心機(jī)（北京京立）；超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）。

1.2 試藥

紅豆越橘采收自黑龍江省伊春市，經(jīng)黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院王偉明研究員鑒定為杜鵑花科越橘屬植物（Vaccinium vitis-idaeaL.）的果實(shí)；DPPH（上海阿拉?。?；SOD測(cè)試盒（南京建成生物工程研究所）；維生素C（VC），甲醇，冰醋酸（分析純，國藥集團(tuán)）；白砂糖為市售；蒸餾水為實(shí)驗(yàn)室自制。

2 方法

2.1 紅豆越橘酵素的制備

挑選成熟、無霉變的紅豆越橘果實(shí)，除去樹葉、雜質(zhì)，用無菌水洗去泥沙，勻漿，分別稱取50 g紅豆越橘置于無菌密封罐中，按比例加入無菌水及白砂糖，恒溫下發(fā)酵，每隔2 d放氣一次，發(fā)酵終止后過濾，于紫外燈下照射2 h終止發(fā)酵。

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 發(fā)酵溫度的確定 稱取紅豆越橘50 g，白砂糖10 g，料液比1:2，按紅豆越橘酵素的制備方法，分別在15，20，25，30，35 ℃恒溫發(fā)酵20 d，發(fā)酵終止后，測(cè)定其SOD酶活力，每個(gè)樣品重復(fù)3次。

2.2.2 料液比的確定 稱取紅豆越橘50 g，白砂糖10 g，25 ℃恒溫，分別按料液比2:1，1:1，1:2，1:3，1:4加入無菌水，按紅豆越橘酵素的制備方法，發(fā)酵20 d，發(fā)酵終止后，測(cè)定其SOD酶活力，每個(gè)樣品重復(fù)3次。

2.2.3 白砂糖用量的確定 稱取紅豆越橘50 g， 25 ℃恒溫，料液比1:2，按紅豆越橘酵素的制備方法，分別加入6，8，10，12，14 g白砂糖，發(fā)酵20 d，發(fā)酵終止后，測(cè)定其SOD酶活力，每個(gè)樣品重復(fù)3次。

2.2.4 發(fā)酵時(shí)間的確定 稱取紅豆越橘50 g，白砂糖10 g，料液比1:2，25 ℃恒溫，按紅豆越橘酵素的制備方法，分別發(fā)酵10，15，20，25，30 d，發(fā)酵終止后，測(cè)定其SOD酶活力，每個(gè)樣品重復(fù)3次。

2.3 正交試驗(yàn)

通過單因素試驗(yàn)，確定以發(fā)酵溫度、料液比、白砂糖用量及發(fā)酵時(shí)間為考察因素（見表1），選用L9(34)正交表進(jìn)行試驗(yàn)，測(cè)定SOD酶活力。挑選20名對(duì)色澤、氣味、滋味及組織形態(tài)都比較敏感的人員，按表2感官評(píng)價(jià)指標(biāo)要求進(jìn)行評(píng)分（滿分100分），求取平均值。根據(jù)綜合評(píng)分篩選最佳發(fā)酵條件。綜合評(píng)分=感官評(píng)分×0.5+SOD酶活力×0.5。

表1 因素水平表

表2 感官評(píng)價(jià)指標(biāo)

2.4 紅豆越橘酵素清除DPPH自由基能力的測(cè)定[9-11]

2.4.1 DPPH工作液的配制 精密稱取39.4 mg DPPH于100 ml量瓶，甲醇溶解，定容，4 ℃下避光保存，即得DPPH儲(chǔ)備液。實(shí)驗(yàn)前移取DPPH儲(chǔ)備液15 ml，甲醇定容至100 ml，制成0.15 mmol/L DPPH工作液。

2.4.2 VC對(duì)照品溶液的配制 精密稱取VC10.0 mg，蒸餾水溶解，定容至10 ml量瓶，即得VC對(duì)照品溶液。測(cè)定前，分別移取20，40，60，80 μl VC對(duì)照品溶液，稀釋至10 ml，測(cè)定其吸光度。

2.4.3 紅豆越橘酵素樣品溶液的制備 精密吸取紅豆越橘酵素原液200 μl，用蒸餾水定容至10 ml，即得紅豆越橘酵素稀釋液。再分別吸取400，500，600，700，800 μl稀釋液，定容至10 ml，即得紅豆越橘酵素樣品溶液。

2.4.4 紅豆越橘酵素清除DPPH自由基能力的測(cè)定在試管中加入0.15 mmol/L的DPPH工作液3.2 ml，再加入紅豆越橘酵素樣品溶液0.8 ml，混勻后，25 ℃避光反應(yīng)30 min，517 nm波長處測(cè)定吸光度，以VC作為陽性對(duì)照[12-13]。按下式計(jì)算DPPH自由基的清除率（%）。

式中A0為DPPH溶液和蒸餾水混合液的吸光度；A1為DPPH溶液和紅豆越橘酵素樣品溶液混合液的吸光度。

2.5 紅豆越橘酵素SOD酶活力的測(cè)定

將紅豆越橘酵素液4000 r/min離心10 min，吸取上清，按SOD酶試劑盒說明書測(cè)定SOD酶活力。

2.6 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析處理相關(guān)數(shù)據(jù)。

3 結(jié)果

3.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

3.1.1 發(fā)酵溫度對(duì)紅豆越橘酵素SOD酶活力的影響

結(jié)果見圖1。由圖1可見，在15～30 ℃之間，紅豆越橘酵素的SOD酶活力隨溫度的升高顯著增長，溫度達(dá)35 ℃時(shí)，呈驟然下降趨勢(shì)，分析可能是溫度過高影響酶的活性。

圖1 發(fā)酵溫度對(duì)紅豆越橘酵素SOD酶活力的影響

3.1.2 料液比對(duì)紅豆越橘酵素SOD酶活力的影響

結(jié)果見圖2。由圖2可見，隨料液比增加，SOD酶活力值呈上升趨勢(shì)，當(dāng)料液比達(dá)1:2時(shí)，SOD酶活力達(dá)最高值，之后呈緩慢下降趨勢(shì)，分析可能是達(dá)最佳料液比后，隨料液比增加，酵素濃度下降。

圖2 料液比對(duì)紅豆越橘酵素SOD酶活力的影響

3.1.3 白砂糖用量對(duì)紅豆越橘酵素SOD酶活力的影響

結(jié)果見圖3。由圖3可見，隨白砂糖用量的增加，紅豆越橘酵素的SOD酶活力呈顯著上升趨勢(shì)，當(dāng)白砂糖用量達(dá)10 g時(shí)，SOD酶活力值最高，隨后呈緩慢下降趨勢(shì)。

圖3 白砂糖用量對(duì)紅豆越橘酵素SOD酶活力的影響

3.1.4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)紅豆越橘酵素SOD酶活力的影響

結(jié)果見圖4。由圖4可見，隨發(fā)酵時(shí)間的增加，紅豆越橘酵素SOD酶活力值顯著增加，發(fā)酵時(shí)間在25～30 d時(shí)，SOD酶活力基本趨于平穩(wěn)。

圖4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)紅豆越橘酵素的影響

3.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

正交試驗(yàn)及方差分析結(jié)果見表3、表4。由表3、表4可見，4個(gè)因素對(duì)紅豆越橘酵素影響次序?yàn)镃（白砂糖用量）＞A（發(fā)酵溫度）＞D（發(fā)酵時(shí)間）＞B（料液比），其中白砂糖用量對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有顯著影響（P＜0.05），發(fā)酵溫度、料液比、發(fā)酵時(shí)間對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果無顯著影響。根據(jù)直觀分析結(jié)果，確定最佳工藝條件為A2B1C1D2，即紅豆越橘50 g，發(fā)酵溫度30 ℃，料液比1:1（g/ml），白砂糖用量8 g，發(fā)酵時(shí)間20 d。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

表4 方差分析

3.3 紅豆越橘酵素清除DPPH自由基能力測(cè)定結(jié)果

紅豆越橘酵素與VC對(duì)照品溶液對(duì)DPPH自由基的清除能力測(cè)定結(jié)果見圖5、圖6。以DPPH自由基清除率為縱坐標(biāo)，以紅豆越橘酵素稀釋液及VC對(duì)照品溶液體積為橫坐標(biāo)做圖，得紅豆越橘酵素清除DPPH自由基線性方程：Y=0.0828X-0.18，R2=0.9971；VC清除DPPH自由基線性方程：Y=1.1695X+14.5，酵素清除DPPH自由基線性方程：Y=0.0828X-0.18，R2=0.9976。由方程可知，當(dāng)清除率為50 %時(shí)，606 μl紅豆越橘酵素稀釋液與30 μl 1 mg/ml VC溶液的抗氧化能力相當(dāng)。

圖5 VC對(duì)DPPH自由基的清除能力

圖6 紅豆越橘酵素對(duì)DPPH自由基的清除能力

3.4 紅豆越橘酵素SOD酶活力測(cè)定結(jié)果

紅豆越橘發(fā)酵前SOD酶活力為1488 U/ml，按最佳工藝條件發(fā)酵后，SOD酶活力為3624 U/ml。

4 結(jié)論

本研究以紅豆越橘果實(shí)為原料，在不添加菌種的條件下，對(duì)紅豆越橘進(jìn)行了自然發(fā)酵，通過單因素考察及正交試驗(yàn)分析，以感官評(píng)價(jià)及SOD酶活力綜合評(píng)分為考察指標(biāo)，得出最佳發(fā)酵條件：紅豆越橘50 g，發(fā)酵溫度30 ℃，料液比1:1，白砂糖用量8 g，發(fā)酵時(shí)間20 d。通過DPPH自由基清除能力及SOD酶活力測(cè)定，對(duì)紅豆越橘酵素的抗氧化活性進(jìn)行了初步研究，發(fā)酵后紅豆越橘酵素SOD酶活力顯著提高，說明發(fā)酵過程能更好地促進(jìn)SOD的形成。結(jié)果表明，紅豆越橘酵素具有較好的抗氧化性能。