不同來源靈芝孢子粉多指標質量評價

常馨月，劉 陽，胡美賡，米 曉，俞 月，路 娟，陳 曦，趙 丹，丁自勉*

（1. 中國醫(yī)學科學院 藥用植物研究所，北京 100193；2. 安徽省衡濟堂健康科技有限公司，安徽 六安 242232）

靈芝（Ganoderma lucidum）是擔子菌綱、多孔菌科、靈芝屬（Ganoderma karst）真菌[1]，國內目前現(xiàn)有赤芝、黃芝、紫芝、黑芝、松杉靈芝和樹舌靈芝等20多種靈芝種類，2020版《中華人民共和國藥典》收入作為藥材靈芝來源的是赤芝[Ganoderma lucidum(Leyss. ex Fr.) Karst.]或紫芝（Ganoderma sinenseZhao, Xu et Zhang）的干燥子實體。

靈芝早在《神農(nóng)本草經(jīng)》中就被列為上品，現(xiàn)作為常用藥用真菌，其性溫、味甘，有補中益氣、滋外強壯、扶正固本之功效，主治虛勞、咳嗽、氣喘、失眠、消化不良。臨床用于治療慢性氣管炎、支氣管哮喘、白細胞減少癥、冠心病、心律失常、急性傳染性肝炎等疾病[2]。由于靈芝的種類繁多，其活性成分易受多種因素的影響，使其廣泛應用受到限制。此外，目前對靈芝的研究主要針對其活性成分[3]，但重金屬的殘存會對于藥材的藥效乃至安全性產(chǎn)生很大影響。靈芝成熟期后，菌蓋中形成的種子名為靈芝孢子（Ganoderma lucidumspore），具有靈芝的全部活性物質[4]。本文根據(jù)現(xiàn)有標準[5-6]，以靈芝孢子粉中多糖、三萜及甾醇、重金屬含量為指標對靈芝進行綜合質量評價，為靈芝孢子粉后續(xù)研發(fā)生產(chǎn)提供支持[7-8]。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent Cary 100型變溫紫外分光光度計（美國Agilent Technologies公司）；Agilent 7700X電感耦合等離子體質譜儀（美國Agilent Technologies公司）；2-16R臺式高速微量冷凍離心機（上海托莫斯）；HH-S6A電熱恒溫水浴鍋（北京科偉永興）；超聲波清洗機（寧波新芝）；AB265-S電子分析天平（梅特勒-托利多）。

1.2 試劑與試藥

桑樹樹種靈芝孢子粉，白楊樹樹種靈芝孢子粉，橡樹樹種靈芝孢子粉，黃栗樹樹種靈芝孢子粉，樺樹樹種靈芝孢子粉，赤芝一號靈芝孢子粉，分別于2019年7月20日～30日，7月31日～8月9日，8月10日～20日，8月21日～9月5日，9月6日～25日采收，均由霍山縣中土靈芝專業(yè)合作社提供；無水葡萄糖對照品，齊墩果酸對照品（上海融禾）；鉛、砷、鎘、鎳、鉻、鍺、銠單元素標準液（國家有色金屬及電子材料分析測試中心）；香草醛，硫酸（AR），蒽酮（AR），冰醋酸（AR），無水乙醇（AR），甲醇（AR），高氯酸（GR），硝酸（GR），過氧化氫（GR），乙酸乙酯（天津市福晨化學試劑廠）；高純度蒸餾水。

2 方法與結果

2.1 多糖含量（以無水葡萄糖計）測定

2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱定無水葡萄糖對照品3.00 mg，置于25 ml量瓶中，加水定容至刻度，即得0.12 mg/ml葡萄糖對照品溶液。

2.1.2 標準曲線的繪制[9]精密量取對照品溶液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 ml，分別置10 ml具塞試管中，各加水至2.0 ml，迅速精密加入硫酸蒽酮溶液（精密稱取蔥酮0.1 g，加硫酸100 ml溶解，搖勻）6 ml，立即搖勻，放置15 min后，立即置冰浴中冷卻15 min，取出，以相應試劑為空白，在625 nm波長處測定吸光度，以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線。得標準曲線為Y=4.1442X+0.1698，R2=0.9964，說明在0.024～0.144 mg/ml濃度范圍內，吸光度與濃度呈良好線性關系。

2.1.3 供試品溶液的制備 取分期采集的白楊樹樹種、橡樹樹種、黃栗樹樹種、樺樹樹種、及赤芝一號靈芝孢子粉各約2 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，加水60 ml，靜置1 h，加熱回流4 h，趁熱濾過后用少量熱水洗滌濾器和濾渣，將濾渣及濾紙置燒瓶中，加水60 ml，加熱回流3 h，趁熱濾過，合并濾液，置水浴上蒸干，殘渣用蒸餾水5 ml溶解，邊攪拌邊緩慢滴加乙醇75 ml，搖勻，4 ℃放置12 h，離心，棄去上清，沉淀物用熱水溶解并轉移至50 ml量瓶中，放冷，加水至刻度，搖勻，取溶液適量，離心，精密量取上清3 ml，置25 ml量瓶中，加水至刻度，搖勻，即得。

2.1.4 測定法 精密量取供試品溶液2 ml，置10 ml具塞試管中，照2.1.2項下方法自“迅速精密加入硫酸蔥酮溶液6 ml”起，同法操作，測定吸光度，從標準曲線上讀出供試品中葡萄糖的含量，計算，即得。

2.1.5 精密度、重復性及穩(wěn)定性試驗 精密吸取葡萄糖對照品溶液2 ml，按2.1.2項方法顯色后測定吸光度，連續(xù)測定5次，計算得吸光度的RSD為0.11 %（n=5），表明儀器精密度良好。精密稱取同一批次靈芝孢子粉6份，按2.1.3項方法制備供試品溶液，分別精密吸取6份供試品溶液、葡萄糖對照品溶液各2 ml，按2.1.2項方法顯色后測定吸光度，計算得供試品中靈芝中無水葡萄糖含量和對照品中無水葡萄糖含量的RSD分別為0.68 %，0.55 %（n=6），表明方法重復性良好。精密吸取靈芝孢子粉供試品溶液、葡萄糖對照品溶液各2 ml，按2.1.2項方法顯色后，分別于0，10，20，30，40，50，60 min測定吸光度，計算得靈芝中無水葡萄糖含量RSD為0.37 %，表明該方法顯色在60 min內穩(wěn)定。

2.1.6 加樣回收試驗 精密稱取已知多糖含量（10.50 mg/g）的靈芝孢子粉9份，每份約1 g，精密稱定，共分為3組，每組3份。分別加入0.12 mg/ml葡萄糖對照品溶液26.25，43.75，61.25 ml，使供試品溶液中多糖濃度水平為80 %，100 %，120 %，按2.1.3項方法制備供試品溶液，精密吸取2 ml供試品溶液，置具塞試管中，按2.1.2項方法顯色后測定吸光度，計算加樣回收率，平均加樣回收率為98.39 %，RSD為1.01 %，表明該方法準確度較高。

2.1.7 靈芝多糖含量測定 取不同采收期及不同樹種靈芝孢子粉，按2.1.3項方法制備供試品溶液，按2.1.2項方法顯色，在625 nm波長處測定吸光度，從標準曲線上讀出供試品溶液中葡萄糖含量，結果見表1。

表1 多糖、三萜及甾醇含量測定結果（n=10）

2.2 三萜及甾醇的測定

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱定齊墩果酸對照品2.00 mg，置于10 ml量瓶中，加甲醇定容至刻度，即得0.2 mg/ml齊墩果酸對照品溶液。

2.2.2 標準曲線的繪制[9]精密量取對照品溶液0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 ml，分別置15 ml具塞試管中，揮干，放冷，精密加入新配制的香草醛冰醋酸溶液（精密稱取香草醛0.5 g，加冰醋酸使溶解成10 ml，即得）0.2 ml、高氯酸0.8 ml，搖勻，70 ℃水浴加熱15 min，立即置冰浴中冷卻5 min，取出，精密加入乙酸乙酯4 ml，搖勻，以相應試劑為空白，在546 mm波長處測定吸光度，以吸光度為縱坐標、濃度為橫坐標繪制標準曲線。得標準曲線為Y=12.437X-0.0402，R2=0.9991，說明在0.02～0.10 mg/ml濃度范圍內，吸光度與濃度呈良好線性關系。

2.2.3 供試品溶液的制備 取供試品粉末各約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加乙醇50 ml，超聲（功率140 W，頻率42 kHz）處理45 min，濾過，濾液置100 ml量瓶中，用適量乙醇分次洗滌濾器和濾渣，洗液并入同一量瓶中，加乙醇至刻度，搖勻，即得。

2.2.4 測定法 精密量取供試品溶液0.2 ml，置15 ml具塞試管中，照2.2.2項下方法，自“揮干”起，同法操作，測定吸光度，從標準曲線上讀出供試品溶液中齊墩果酸的含量，計算，即得。

2.2.5 精密度、重復性及穩(wěn)定性試驗 精密吸取齊墩果酸對照品溶液溶液0.2 ml，按2.2.2項方法顯色后測定吸光度，連續(xù)測定5次，計算得吸光度的RSD為0.13 %（n=5），表明儀器精密度良好。精密稱取同一批次來源6份靈芝孢子粉約2 g，按2.2.3項方法制備供試品溶液，分別精密吸取6份供試品溶液、齊墩果酸對照品溶液0.2 ml，按2.2.2項方法顯色后測定吸光度，計算得供試品中靈芝三萜及甾醇含量和對照品含量的RSD分別為0.44 %，0.83 %（n=6），表明方法重復性良好。精密吸取靈芝孢子粉供試品溶液、齊墩果酸對照品溶液0.2 ml，按2.2.2項方法顯色后，分別于0，10，20，30，40，50，60 min時測定吸光度，計算得靈芝三萜及甾醇含量的RSD分別為0.22 %，表明該方法顯色在60 min內穩(wěn)定。

2.2.6 加樣回收試驗 精密稱取已知三萜及甾醇含量（30.45 mg/g）的靈芝孢子粉供試品9份，每份約1 g，精密稱定，共分為3組，每組3份。分別加入0.2 mg/ml齊墩果酸對照品溶液45.675，76.125，106.575 ml，使供試品溶液中三萜及甾醇濃度水平為80 %，100 %，120 %。按2.2.3項方法制備供試品溶液，精密吸取0.1 ml供試品溶液，置具塞試管中，按2.2.2項方法顯色后測定吸光度，計算加樣回收率，平均加樣回收率為98.39 %，RSD為1.01 %，表明該方法準確度較高。

2.2.7 三萜及甾醇含量測定 取不同采收期及不同樹種靈芝孢子粉，按2.2.3項方法制備供試品溶液，按2.2.2項方法顯色，在546 nm波長處測定吸光度，從標準曲線上讀出供試品溶液中齊墩果酸的含量即得靈芝孢子粉供試品內三萜及甾醇含量，結果見表1。

2.3 重金屬含量測定

2.3.1 參考標準 重金屬總量按中華人民共和國藥典2020版（一部）附錄IXE重金屬檢測方法[10]檢測；各重金屬元素含量參考2015年國際標準《中醫(yī)藥-中藥材 重金屬限量》中電感耦合等離子體質譜法（ICP-MS）[11]檢測。

2.3.2 ICP-MS測定條件及數(shù)據(jù)采樣模式 等離子氣流量：15.0 L/min；蠕動泵轉速：0.20 r/s；霧化室溫度：2 ℃；輔助氣流量：0.8 L/min；He氣流量：5 ml/min；載氣流量：0.8 L/min；射頻功率：1550 W；跳峰采集；采樣深度：10 mm；重復次數(shù)：3次；掃描次數(shù)：100次。

2.3.3 對照品溶液的制備

2.3.3.1 鉻、鎳、鉛、砷、鎘標準儲備液的制備 分別精密量取鉛、砷、鎘、鎳、鉻單元素標準溶液適量，用10 %硝酸溶液稀釋，制成濃度分別為每1 ml含1，0.5，1，1，10 μg的標準儲備液。

2.3.3.2 內標溶液的制備 精密量取鍺、銠單元素標準溶液適量，用水稀釋，制成每1 ml各含1 μg的混合內標溶液。

2.3.4 標準曲線的繪制 精密量取鉻、鎳、鉛、砷、鎘標準儲備液適量，用10 %硝酸溶液稀釋制成每1 ml分別含鉛、砷0，1，5，10，20 ng，含鎘0，0.5，2.5，5，10 ng，含鉻0，2.00，4.00，8.00，12.00，16.00 ng，含鎳0，50，100，200，500 ng的混合標準溶液，即得。鉻、鎘、鉛測定以鍺為內標，鎳、砷測定以銠為內標，進樣測定。以濃度為橫坐標X，以待測元素與內標元素的信號值之比為縱坐標Y，繪制標準曲線，結果見表2。由表2可見，5種重金屬元素標準曲線線性相關系數(shù)均接近1，說明在重金屬檢測線性范圍內，待測元素與內標元素的信號值與濃度呈良好線性關系。

表2 重金屬標準曲線及檢出限、定量限

2.3.5 定量限及檢出限 對10 %硝酸溶液和樣品的消解試劑“5 ml硝酸溶液+3 ml過氧化氫溶液”空白連續(xù)測定11次，計算每種元素響應值的標準偏差（SD），取測定結果的3倍SD為相應元素的檢出限，10倍SD為方法定量限，結果見表2。各種元素的儀器檢出限范圍在0.0002～0.0185 ppb之間，方法檢出限在0.0024～0.0703 ppb之間，說明該方法的靈敏度能滿足測定要求。

2.3.6 供試品溶液的制備 精確稱取樣品0.2500 g，置聚四氟乙烯消解罐中，加入5 ml硝酸靜置一段時間，放入消煮爐內100 ℃（每分鐘上升5 ℃）消煮，直至樣品消煮完全，再加入3 ml過氧化氫，100 ℃趕酸，直至消煮液余量低于2 ml，然后轉移至50 ml量瓶內，定容。同法制備空白試劑溶液。

2.3.7 測定法 精密量取內標溶液與供試品溶液各10 μl，注入電感耦合等離子體質譜儀，按2.3.4項下方法測定響應值，按峰高讀數(shù)，按標準曲線計算供試品溶液中重金屬的含量。

2.3.8 精密度、重復性及穩(wěn)定性試驗 精密稱取一批次靈芝孢子粉，按2.3.6項方法制備供試品溶液，按2.3.4項方法連續(xù)測定6次，計算得供試品溶液中鉻、鎳、鉛、砷、鎘元素含量的RSD分別為0.17 %，0.41 %，0.63 %，0.05 %，0.13 %（n=6），表明儀器精密度良好。精密稱取同一批次來源靈芝孢子粉6份，按2.3.6項方法平行制備6份供試品溶液，按2.3.4項方法測定，計算得供試品溶液中鉻、鎳、鉛、砷、鎘元素含量的RSD分別為0.25 %、0.51 %，0.62 %，0.13 %，0.10 %（n=6），表明該方法重復性良好。精密稱取一批次靈芝孢子粉，按2.3.6項方法制備供試品溶液，按2.3.4項方法于0，10，20，30，40，50，60 min測定，計算得供試品溶液中鉻、鎳、鉛、砷、鎘元素含量的RSD分別為0.13 %，0.28 %，0.40 %，0.07 %，0.10 %，表明檢測在60 min內穩(wěn)定。

2.3.9 加樣回收試驗 精密稱取已知重金屬含量（鉛、砷、鎘、鎳、鉻元素含量分別為0.13，0.44，0.22，0.42，0.20 mg/kg）的靈芝孢子粉供試品9份，每份約1 g，共分為3組，每組3份，精密稱定。分別加入重金屬單標溶液（鉛、砷、鎘、鎳、鉻元素的質量濃度分別為1，0.5，1，1，10 μg/ml），具體加入量見表3，使供試品溶液中重金屬濃度水平為80 %，100 %，120 %，按2.3.6項方法制備供試品溶液9份，再按2.3.4項下條件檢測，計算各元素的含量、加樣回收率及RSD，鉛、砷、鎘、鎳、鉻平均回收率分別為93.86 %，96.38 %，95.38 %，96.08 %，92.27 %，RSD分別為1.65 %，1.23 %，0.82 %，1.16 %，2.35 %（n=9）。表明該方法準確度較高。

表3 加樣回收試驗重金屬單標溶液加樣量（n=3）

2.3.10 重金屬元素含量測定 供試品溶液注入電感耦合等離子體質譜儀，照2.3.4項下方法測定響應值，按標準曲線計算供試品溶液中重金屬的含量，結果見表4。

表4 重金屬元素含量測定結果（n=10）

3 多指標質量評價

分別根據(jù)多糖含量、三萜及甾醇含量、重金屬含量對不同來源靈芝孢子粉進行質量評價。

3.1 根據(jù)多糖含量進行質量評價

不同樹種靈芝孢子粉中，樺樹樹種靈芝孢子粉內多糖含量較多，多糖含量可達12.22 mg/g。不同采收期的靈芝孢子粉樣品多糖含量測定結果顯示，自7月底到8月上旬靈芝孢子粉內多糖含量呈上升趨勢，8月上旬采集的靈芝孢子粉中多糖含量達到峰值，之后又開始下降，多糖含量最高可達10.60 mg/g。

3.2 根據(jù)三萜及甾醇含量進行質量評價

不同樹種靈芝孢子粉中，桑樹樹種靈芝粉末和白楊樹樹種靈芝孢子粉中三萜類成分含量較多，最高可達30.45 mg/g。不同采收期采集到的靈芝孢子粉樣品中，7月底～9月底采收的樣品中，三萜及甾醇類成分呈持續(xù)上升趨勢，并在9月下旬采集的靈芝孢子粉中達到峰值，三萜及甾醇含量最高可達31.79 mg/g。

3.3 根據(jù)重金屬含量進行質量評價

3.3.1 重金屬元素含量 食品安全國家標準食品中污染物限量標準對于食用菌制品中鉛、鎘、砷的要求，分別為：鉛（Pb）≤1.0 mg/kg，鎘（Cd）≤0.5 mg/kg、砷（As）≤0.5 mg/kg[12]。按此標準，所有樣品中3種重金屬含量均符合限量要求。

該標準中不包括對于食用菌制品中重金屬鎳及鉻限量的要求。照中華人民共和國藥典2020版四部中重金屬鎳、鉻測定法進行測定，根據(jù)浙江省中藥炮制規(guī)范（2015年版）：靈芝孢子粉中鎳元素不得超過百萬分之一；鉻元素不得超過百萬分之二，即鎳元素不得超過1 mg/kg，鉻元素不得超過2 mg/kg。根據(jù)此標準，所有樣品中鎳元素含量以及鉻元素含量均符合靈芝孢子粉中重金屬限量標準要求。

3.3.2 重金屬元素總量 食品安全國家標準食品中污染物限量標準對于重金屬總量的要求為：重金屬總量≤20.0 mg/kg[12]。根據(jù)此標準，不同樹種及不同采收期取樣靈芝孢子粉樣品中重金屬總量均符合要求。

3.4 綜合質量評價

以重金屬含量為限量標準作為首要篩選條件，以多糖、三萜及甾醇等活性成分含量作為優(yōu)選條件，根據(jù)兩項指標權重進行加權計算，對各樣本進行綜合分析。加權值=靈芝多糖含量×50 %+三萜及甾醇含量×50 %。根據(jù)表1含量測定結果進行計算，結果見表5。

表5 多糖、三萜及甾醇含量加權計算結果（n=10）

初步探索不同來源樣品中多糖與三萜及甾醇含量的變化規(guī)律，其中桑樹樹種和白楊樹種靈芝孢子粉樣品的多糖和三萜及甾醇加權結果最高，認為后續(xù)生產(chǎn)可考慮多采用桑樹樹種或白楊樹樹種進行靈芝的栽培，并在九月中下旬進行采收。

4 結論

以重金屬含量為限量標準，以多糖和三萜及甾醇等活性成分含量作為優(yōu)選條件，兩者各占50 %比例對各樣本進行加權計算，初步探索不同來源樣品中多糖與三萜及甾醇含量的變化規(guī)律，其中桑樹樹種和白楊樹種靈芝樣品的多糖和三萜及甾醇加權結果最高，認為可考慮多采用桑樹樹種或白楊樹樹種進行靈芝的栽培，并在九月中下旬進行采收。