超高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定障眼明膠囊中7個(gè)成分的含量

王月清

（東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院江北院區(qū)藥劑科，江蘇 南京 210048）

障眼明膠囊由石菖蒲、決明子、車前子、菟絲子、葛根、白芍、山茱萸、菊花、關(guān)黃柏、青葙子、甘草、黃芪、枸杞子、黨參、肉蓯蓉、升麻、蕤仁（去內(nèi)果皮）、川芎、蔓荊子、黃精、熟地黃、密蒙花22位藥材組成，具有退翳明目，補(bǔ)益肝腎的功效，臨床主要用于初期及中期老年性白內(nèi)障[1]。該藥收載于《新藥轉(zhuǎn)正標(biāo)準(zhǔn)》第82冊(cè)，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)含量測(cè)定項(xiàng)下采用高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定芍藥苷含量，鑒別項(xiàng)下僅對(duì)關(guān)黃柏、甘草及黃芪做了定性檢查，目前文獻(xiàn)僅有障眼明膠囊中葛根素和芍藥苷的成分分析[2]，未見(jiàn)其他藥材成分分析的相關(guān)報(bào)道。藥食同源的決明子自古有清熱明目作用，主要成分蒽醌類占1 %，典型化合物為橙黃決明素和大黃酚[3-4]；車前子主要治療目赤腫痛、目視昏暗，其藥理活性成分主要為苯乙醇苷類毛蕊花糖苷及環(huán)烯醚萜類京尼平苷酸，《中國(guó)藥典》2020年版也將這兩種成分作為含量測(cè)定的指標(biāo)[5-7]；被《神農(nóng)本草經(jīng)》列為上品的菟絲子具有明目養(yǎng)肝，抑制白內(nèi)障形成的功效，金絲桃苷是其主要活性成分之一[8-9]；葛根能改善眼功能，白芍養(yǎng)陰平肝[10-11]。由于該中成藥由20味中藥組成，多指標(biāo)的定量測(cè)定方法雖然成本較高，但更有利于對(duì)藥品質(zhì)量的全面客觀的評(píng)價(jià)。本研究采用梯度洗脫法結(jié)合分段變波長(zhǎng)檢測(cè)法，首次建立了同時(shí)測(cè)定橙黃決明素、大黃酚、毛蕊花糖苷、京尼平苷酸、金絲桃苷、葛根素、芍藥苷的超高效液相色譜（UPLC）法，結(jié)果表明，該方法簡(jiǎn)便快速、靈敏度高，為該藥的質(zhì)量控制提供了依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

安捷倫1290 infinity超高效液相色譜儀（包含二元梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱和PDA檢測(cè)器，安捷倫科技公司）；ABS-135S型電子天平（d=0.01 mg，瑞士梅特勒公司）；TGL-16G離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）。

1.2 材料

障眼明膠囊（批號(hào)：20190922，20191027，20191125，20191219，規(guī)格：0.25 g/粒，湖南德康制藥股份有限公司）；橙黃決明素對(duì)照品（批號(hào)：111900-201605，純度：98.3 %），大黃酚對(duì)照品（批號(hào)：110796-201922，純度：99.4 %），毛蕊花糖苷對(duì)照品（批號(hào)：111530-201914，純度：95.2 %），京尼平苷酸對(duì)照品（批號(hào)：111828-201805，純度：98.1 %），金絲桃苷對(duì)照品（批號(hào)：111521-201809，純度：94.9 %），葛根素對(duì)照品（批號(hào)：110752-201816，純度：95.4 %），芍藥苷對(duì)照品（批號(hào)：110736-201943，純度：95.1 %，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；甲醇，乙腈均為色譜純（美國(guó)默克公司），其他試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件[12-14]

色譜柱：Waters Acquity UPLC BEH C18柱（2.1 mm×150 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.5 %醋酸水溶液（B），梯度洗脫（0～20 min，8 %→25 %A；20～25 min，25 %→38 %A；25～31 min，38 %→65 %A；31～35 min，65 %→8 %A；流速：0.2 ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)：230 nm（0～12 min），250 nm（12～17 min），330 nm（17～20 min），360 nm（20～23 min），284 nm（23～35 min）；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：2 μl；色譜記錄時(shí)間：35 min。

2.2 溶液配制

2.2.1 混合對(duì)照品溶液的制備 分別取橙黃決明素、大黃酚、毛蕊花糖苷、京尼平苷酸、金絲桃苷、葛根素、芍藥苷對(duì)照品各適量，精密稱定，加甲醇制成每1 ml含橙黃決明素100.2 μg，大黃酚77.53 μg，毛蕊花糖苷21.67 μg，京尼平苷酸62.99 μg，金絲桃苷55.97 μg，葛根素40.08 μg，芍藥苷22.16 μg的混合對(duì)照品溶液，室溫避光保存。

2.2.2 供試品溶液的制備 取障眼明膠囊10粒，研勻，取粉末約0.5 g，精密稱定，置棕色具塞錐形瓶中，加稀鹽酸10 ml及三氯甲烷40 ml，加熱回流1.5 h，冷卻，分取三氯甲烷液，蒸干，殘?jiān)蛹状既芙獠⑥D(zhuǎn)移至20 ml棕色量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，10 000 r/min離心10 min，取上清，0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得，室溫避光保存。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液的制備 按障眼明膠囊制備工藝，分別制備缺決明子、車前子、菟絲子、葛根、白芍的陰性樣品，按2.2.2項(xiàng)下方法操作，制備陰性對(duì)照溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 系統(tǒng)適用性和專屬性試驗(yàn) 分別取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液及2.2.3項(xiàng)下的陰性對(duì)照溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，見(jiàn)圖1。結(jié)果顯示，混合對(duì)照品溶液與供試品溶液中各指標(biāo)成分色譜峰的理論塔板數(shù)均大于8400，分離度均大于1.5，拖尾因子在0.95～1.04之間，表明系統(tǒng)適用性良好。在樣品色譜圖中，分別有與對(duì)照品保留時(shí)間一致的特征峰，表明各化合物之間分離度好，無(wú)干擾，專屬性良好。

圖1 UPLC圖譜

2.3.2 線性關(guān)系考察 分別精密吸取2.2.1項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液1，2，3，4，5，6 ml，置于同一25 ml棕色量瓶中，加甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，得系列濃度的混合對(duì)照品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖。以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），相應(yīng)對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)（X，μg/ml）進(jìn)行線性回歸，繪制各組分標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程和相關(guān)系數(shù)。結(jié)果表明：橙黃決明素、大黃酚、毛蕊花糖苷、京尼平苷酸、金絲桃苷、葛根素、芍藥苷在試驗(yàn)范圍內(nèi)成良好的線性關(guān)系。精密量取2.2.1項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，用甲醇倍比稀釋，按2.1項(xiàng)下液相色譜條件進(jìn)樣分析，峰面積信噪比10:1（S/N=10）時(shí)的混合對(duì)照品溶液濃度為定量下限（LOQ），峰面積信噪比3:1（S/N=3）時(shí)的混合對(duì)照品溶液濃度為檢測(cè)下限（LOD），結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 分析物的回歸方程、檢測(cè)下限及定量下限

2.3.3 儀器精密度試驗(yàn) 精密吸取2.2.1項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液2.0 ml，置于同一20 ml棕色量瓶中，加甲醇溶液稀釋至刻度，按2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果橙黃決明素、大黃酚、毛蕊花糖苷、京尼平苷酸、金絲桃苷、葛根素、芍藥苷峰面積RSD分別為0.55 %，0.67 %，0.46 %，1.01 %，0.71 %，0.61 %，0.82 %（n=6），表明儀器精密度良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液（批號(hào)：20191219），分別于制備后0，4，10，16，18，20，24 h，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果橙黃決明素、大黃酚、毛蕊花糖苷、京尼平苷酸、金絲桃苷、葛根素、芍藥苷峰面積RSD分別為0.48 %，0.52 %，0.63 %，0.56 %，0.71 %，0.78 %，0.85 %（n=7），表明供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批供試品細(xì)粉約0.5 g（批號(hào)：20191219），精密稱定，共6份，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，并計(jì)算7個(gè)成分的含量及其RSD值。結(jié)果橙黃決明素、大黃酚、毛蕊花糖苷、京尼平苷酸、金絲桃苷、葛根素、芍藥苷的平均含量分別0.6132，0.3866，0.0863，0.1333，0.0922，0.3074，0.1025 mg/g，RSD分別為0.71 %，0.59 %，0.92 %，0.63 %，0.83 %，1.08 %，0.76 %（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的障眼明膠囊（批號(hào)：20191219）細(xì)粉6份，每份約0.25 g，精密稱定，精密加入橙黃決明素、大黃酚、毛蕊花糖苷、京尼平苷酸、金絲桃苷、葛根素、芍藥苷混合對(duì)照品溶液（質(zhì)量濃度分別為77.25，48.75，10.92，16.86，11.75，38.85，12.95 μg/ml）2.00 ml，按2.2.2項(xiàng)下供試品溶液方法制備，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算各成分加樣回收率及其RSD值。結(jié)果橙黃決明素、大黃酚、毛蕊花糖苷、京尼平苷酸、金絲桃苷、葛根素、芍藥苷的平均加樣回收率分別為99.73 %，99.66 %，99.56 %，99.03 %，99.12 %，99.02 %，99.59 %，RSD分別為1.01 %，0.71 %，0.92 %，0.65 %，0.70 %，0.76 %，1.08 %（n=6），表明本方法回收率良好，見(jiàn)表2。

表2 7個(gè)成分的加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.3.7 樣品含量測(cè)定 按2.1項(xiàng)下色譜條件，分別精密吸取2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液和供試品溶液各2 μl，進(jìn)樣測(cè)定，記錄橙黃決明素、大黃酚、毛蕊花糖苷、京尼平苷酸、金絲桃苷、葛根素、芍藥苷的峰面積，對(duì)4批障眼明膠囊中7個(gè)成分含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表3。

3 討論

本研究對(duì)供試品溶液進(jìn)行190～400 nm全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)230，250，330，360 nm及284 nm波長(zhǎng)下色譜峰豐度、分離度較好，故選擇利用PDA檢測(cè)器，采用波長(zhǎng)切換法檢測(cè)橙黃決明素，大黃酚，毛蕊花糖苷，京尼平苷酸，金絲桃苷，葛根素，芍藥苷。依次考察了不同比例和梯度的流動(dòng)相系統(tǒng)（甲醇、乙腈、0.5 %醋酸、0.5 %磷酸）、柱溫（20，25，30，35 ℃）、體積流量（0.1，0.2，0.3，0.4 ml/min）、進(jìn)樣量（1，2，3μl）等對(duì)色譜峰的影響，以峰分離度、峰對(duì)稱因子等為依據(jù)進(jìn)行了篩選，并分別優(yōu)化了不同體積比的稀鹽酸和三氯甲烷提取溶劑（10:30，10:40，10:50）、提取方式（浸漬過(guò)夜、超聲處理、加熱回流）、定容溶劑（50 %甲醇、75 %甲醇、甲醇、乙醇、水）、提取時(shí)間（1，1.5，2 h），最終確定了2.1項(xiàng)下色譜條件及2.2.2項(xiàng)下供試品溶液的提取方法。

考察了Waters Acquity UPLC BEH C18（150 mm×2.1 mm，1.8 μm）色譜柱、Phenomenex Kinetex XB C18（150 mm×2.1 mm，1.8 μm）及YMC-Triart UPLC C18（150 mm×2.1 mm，1.8 μm）色譜柱的分離效能。結(jié)果顯示，各成分均能有效分離，但Waters色譜柱中各色譜峰峰形較好且對(duì)稱性滿足要求，因此選用Waters Acquity UPLC BEH C18（150 mm×2.1 mm，1.8 μm）色譜柱。

UPLC在分析效率、靈敏度和峰容量方面優(yōu)于常規(guī)HPLC，并可顯著減少分析時(shí)間，可在短時(shí)間內(nèi)達(dá)到平衡，同時(shí)相應(yīng)會(huì)減少溶劑消耗[15-16]，因此，已越來(lái)越多地應(yīng)用于中藥分析研究。

本試驗(yàn)采用1.8 μm小顆粒填料色譜柱，相比于HPLC使用的常規(guī)色譜柱，這一基于小粒徑的分析法具有更高的效率、更佳的數(shù)據(jù)質(zhì)量，能顯著縮短分析時(shí)間，在保證所測(cè)定有效成分含量結(jié)果一致的情況下，分析時(shí)間節(jié)省了近30 min。

綜上，本試驗(yàn)采用UPLC對(duì)障眼明膠囊中7個(gè)活性成分同時(shí)進(jìn)行測(cè)定，方法操作簡(jiǎn)便，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性好，對(duì)科學(xué)全面評(píng)價(jià)障眼明膠囊質(zhì)量具有參考價(jià)值。