榅桲總黃酮對(duì)氧糖剝奪誘導(dǎo)的人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的影響及機(jī)制研究

劉禹岐，郗歐，劉怡彤

·論著·

榅桲總黃酮對(duì)氧糖剝奪誘導(dǎo)的人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的影響及機(jī)制研究

劉禹岐，郗歐，劉怡彤

110000 沈陽(yáng)，遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院腦病一科（劉禹岐、郗歐），康復(fù)科（劉怡彤）

探究榅桲總黃酮（TFCOM）對(duì)氧糖剝奪（OGD）誘導(dǎo)的人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞（HBMEC）損傷的影響及可能機(jī)制。體外培養(yǎng) HBMEC，建立 OGD 模型。用 10、20、40 μg/ml TFCOM 干預(yù) OGD 誘導(dǎo)的 HBMEC，CCK8 法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)細(xì)胞中 cleaved-caspase3 蛋白表達(dá)，酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞中 SOD 活性和 MDA 含量，RT-PCR 檢測(cè) circ_HECTD1 表達(dá)。分別轉(zhuǎn)染 circ_HECTD1 小干擾 RNA 或過(guò)表達(dá)載體至 HBMEC，上述相同方法觀(guān)察 circ_HECTD1 對(duì) OGD 誘導(dǎo)的 HBMEC 增殖活性、凋亡及細(xì)胞中 cleaved-caspase3 蛋白表達(dá)、SOD 活性和 MDA 含量的影響。TFCOM 增強(qiáng)了 OGD 誘導(dǎo)的 HBMEC 增殖活性和細(xì)胞中 SOD 活性，降低了 OGD 誘導(dǎo)的 HBMEC 凋亡率、細(xì)胞中 cleaved-caspase3 蛋白和 circ_HECTD1 表達(dá)及 MDA 含量，且呈劑量依賴(lài)性。沉默 circ_HECTD1 增強(qiáng)了 OGD 誘導(dǎo)的 HBMEC 增殖活性和細(xì)胞中 SOD 活性，降低了 OGD 誘導(dǎo)的 HBMEC 凋亡率、細(xì)胞中 cleaved-caspase3 蛋白和 MDA 含量。過(guò)表達(dá)circ_HECTD1 減弱了 TFCOM 對(duì) OGD 誘導(dǎo)的 HBMEC 增殖活性、凋亡及細(xì)胞中 SOD 活性和 MDA 含量的影響。TFCOM 可減少 OGD 誘導(dǎo)的 HBMEC 凋亡，并抑制 HBMEC 氧化應(yīng)激，其作用機(jī)制可能與下調(diào)細(xì)胞中 circ_HECTD1 表達(dá)有關(guān)。

榅桲總黃酮； circ_HECTD1； 氧糖剝奪； 人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞； 凋亡； 氧化應(yīng)激

缺血性腦卒中是由腦動(dòng)脈血栓或栓塞性閉塞引起的，具有較高的發(fā)病率和致死率[1]。人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞（HBMEC）是血腦屏障的重要結(jié)構(gòu)，其在腦缺血或缺氧時(shí)結(jié)構(gòu)和功能被破壞，從而引起腦細(xì)胞及腦組織損傷，造成腦功能紊亂[2]。研究顯示，缺血或缺氧引起的 HBMEC 損傷在缺血性腦卒中發(fā)生發(fā)展中起重要作用，抑制缺血或缺氧引起的 HBMEC 對(duì)缺血性腦卒中的治療尤為關(guān)鍵[3]。榅桲是薔薇科榅桲屬灌木植物，富含有機(jī)酸、黃酮和鞣質(zhì)等化學(xué)成分。研究顯示，榅桲總黃酮（total flavonoids of.，TFCOM）可通過(guò)阻礙 JNK 和 NF-κB 信號(hào)通路來(lái)下調(diào)心肌梗死引起的炎性損傷和細(xì)胞凋亡，減輕心肌梗死大鼠心肌損傷[4]；榅桲總黃酮可改善自發(fā)性高血壓大鼠心臟功能，抑制心肌肥厚，并減輕心肌纖維化[5]。然而，榅桲總黃酮對(duì) HBMEC 損傷的影響和機(jī)制還未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。circ_HECTD1 是一種環(huán)狀RNA（circRNA），其在缺血性腦組織中表達(dá)增加，敲低 circ_HECTD1 可顯著減少短暫性腦中動(dòng)脈閉塞小鼠腦梗死面積，減輕神經(jīng)元缺陷并改善星形膠質(zhì)細(xì)胞活化，circ_HECTD1 可作為腦卒中的治療靶標(biāo)[6]。本研究建立氧糖剝奪（OGD）誘導(dǎo)的人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型，主要觀(guān)察了榅桲總黃酮對(duì) OGD 誘導(dǎo)的 HBMEC 凋亡和氧化應(yīng)激的影響及其能否通過(guò)調(diào)控 circ_HECTD1 發(fā)揮作用，以期為其用于缺血性腦卒中的治療提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

HBMEC 購(gòu)自江蘇依萊薩生物技術(shù)有限公司；榅桲葉購(gòu)自張仲景大藥房，按照文獻(xiàn)[4]方法制備榅桲總黃酮，采用分光光度計(jì)法測(cè)定榅桲總黃酮純度為 64.29%；DMEM 培養(yǎng)液、Annexin V-FITC/PI 試劑盒和 BCA 蛋白檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；LipofectamineTM2000 試劑盒購(gòu)自美國(guó) Invitrogen 公司；胎牛血清（FBS）購(gòu)自浙江天杭生物科技股份有限公司；si-circ_HECTD1、si-NC、pcDNA-circ_HECTD1 和 PCR 引物購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；RNA 抽提試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和 PCR 試劑盒購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；兔抗人活化的半胱天冬酶 3（cleaved-caspase3）抗體購(gòu)自 Abcam 中國(guó)公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 復(fù)蘇 HBMEC，加含 10% FBS 的 DMEM 培養(yǎng)液，置于CO2培養(yǎng)箱（37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù) 5%、濕度 97%）中培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)期 HBMEC 接種至 6 孔板中（5.0 × 105個(gè)/孔），培養(yǎng) 12 h 后，棄培養(yǎng)液。用 LipofectamineTM2000 脂質(zhì)體法，分別將 si-circ_HECTD1、si-NC、pcDNA-circ_HECTD1 轉(zhuǎn)染至 HBMEC 細(xì)胞。轉(zhuǎn)染 12 h 后，換為含 10% FBS 的 DMEM 培養(yǎng)液。再培養(yǎng) 24 h 后，RT-qPCR 法檢測(cè)細(xì)胞中 circ_HECTD1 表達(dá)驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果，并收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 CCK8 法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性 將 HBMEC 及轉(zhuǎn)染 si-circ_HECTD1、si-NC、pcDNA-circ_ HECTD1 的 HBMEC 接種于 96 孔板中（2.5 × 104個(gè)/孔），培養(yǎng) 4 h 后，棄培養(yǎng)液，分組處理。HBMEC 分為對(duì)照組、模型組、模型+ TFCOM 低劑量組（模型+ TFCOM-L 組）、模型+ TFCOM 中劑量組（模型+ TFCOM-M 組）和模型+ TFCOM 高劑量組（模型+ TFCOM-H 組），其中模型組建立氧糖剝奪模型[7]，先加含 10% FBS 的 DMEM 培養(yǎng)液，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h，棄培養(yǎng)液，PBS 清洗 2 次，再加無(wú)糖 DMEM 培養(yǎng)液，置于缺氧培養(yǎng)箱（37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù) 5%、N2體積分?jǐn)?shù) 95%、濕度 97%）中培養(yǎng) 6 h；模型+ TFCOM-L 組、模型+ TFCOM-M 組和模型+ TFCOM-H 組細(xì)胞先分別加含 10、20、40 μg/ml[8]榅桲總黃酮與 10% FBS 的 DMEM 培養(yǎng)液，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h，棄培養(yǎng)液，PBS 清洗2 次，再加無(wú)糖 DMEM 培養(yǎng)液，置于缺氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 6 h；對(duì)照組細(xì)胞用含 10% FBS 的 DMEM 培養(yǎng)液，置于 CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 30 h。轉(zhuǎn)染si-circ_HECTD1、si-NC 的 HBMEC 處理同模型組，記為模型+ si-circ_HECTD1 組、模型+ si-NC 組。轉(zhuǎn)染pcDNA-circ_HECTD1 的 HBMEC 處理同模型+TFCOM-H 組，記為模型+ TFCOM + pcDNA-circ_HECTD1 組。每組設(shè) 3 個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加 10 μl CCK8，孵育 2 h，酶標(biāo)儀（λ = 450 nm）測(cè)光密度（）值。值越大，說(shuō)明細(xì)胞增殖活性越強(qiáng)。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 將 HBMEC 及轉(zhuǎn)染 si-circ_HECTD1、si-NC、pcDNA-circ_HECTD1 的 HBMEC 接種于 6 孔板中（1.0 × 105個(gè)/孔），培養(yǎng) 4 h后，棄培養(yǎng)液，用 PBS 清洗 2 次，分組處理，方法同 1.2.2。培養(yǎng)結(jié)束后，收集各組細(xì)胞，用PBS清洗 2 次，利用 Annexin V-FITC/PI 試劑盒，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。凋亡率（%）=（早期凋亡細(xì)胞數(shù)+ 晚期凋亡細(xì)胞數(shù)）/總細(xì)胞數(shù) × 100%。

1.2.4 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)細(xì)胞中 cleaved-caspase3蛋白表達(dá) 細(xì)胞接種和分組情況同1.2.3。培養(yǎng)結(jié)束后，收集各組細(xì)胞，PBS 清洗 2 次。用 RIPA 試劑提取細(xì)胞中總蛋白，并使用 BCA 法測(cè)定蛋白濃度。行 10% SDS-PAGE 電泳，然后將分離蛋白轉(zhuǎn)至 PVDF 膜，用 5% 脫脂奶粉室溫封閉 2 h 后，分別用 cleaved-caspase3（1:1000）和 GAPDH（1:1500）一抗 4℃孵育過(guò)夜。洗膜后，再用山羊抗兔二抗（1:3000）室溫孵育 1 h。加顯影液避光顯影，曝光拍照，Image J 軟件分析 cleaved-caspase3 相對(duì) GAPDH 的表達(dá)量。

1.2.5 酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)細(xì)胞中 SOD 活性和 MDA 含量 細(xì)胞接種和分組情況同 1.2.3。培養(yǎng)結(jié)束后，收集各組細(xì)胞，PBS 清洗 2 次。加細(xì)胞裂解液充分裂解細(xì)胞，3500 r/min 離心 5 min，取上清，利用 SOD、MDA 試劑盒，檢測(cè)上清中 SOD 活性及 MDA 含量。

1.2.6 RT-PCR 檢測(cè)細(xì)胞中 circ_HECTD1 表達(dá) 細(xì)胞接種和分組情況同 1.2.3。培養(yǎng)結(jié)束后，收集各組細(xì)胞，PBS 清洗 2 次。同 RNA 抽提試劑盒提取細(xì)胞中總 RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄生成 cDNA 后，行 PCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增程序：95 ℃ 5 min；95 ℃10 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共 35 個(gè)循環(huán)。引物序列：circ_HECTD1 上游 5' ACTCCGTCACCTCGAT TAGC 3'，下游 5' ATCATCCCATGTTCTCCGGC 3'；GAPDH 上游 5' AATCCCATCACCATCTTCC 3'，下游 5' CATCACGCCACAGTTTCC 3'。2-△△Ct法計(jì)算 circ_HECTD1 相對(duì)于 GAPDH 的表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 榅桲總黃酮對(duì) OGD 誘導(dǎo)的 HBMEC 凋亡的影響

與對(duì)照組比較，模型組 HBMEC 增殖活性降低，凋亡率升高，凋亡相關(guān)蛋白cleaved-caspase3 的表達(dá)升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（< 0.05）。與模型組比較，各給藥組 HBMEC 增殖活性升高，凋亡率降低，凋亡相關(guān)蛋白 cleaved-caspase3 的表達(dá)降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（< 0.05），且各檢測(cè)指標(biāo)組間兩兩比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（< 0.05）（圖 1）。

Figure 1 Effects of TFCOM on proliferation and apoptosis of HBMEC cells induced by OGD (A: Effect of cell apoptosis; B: Effect of cells activity; C: Effect of cleaved-caspase3 protein; Compared with the control group,*<0.05; Compared with the model group,#< 0.05; Compared with the model + TFCOM-L group,△< 0.05; Compared with the model + TFCOM-M group,▲< 0.05)

圖 2 TFCOM 對(duì)OGD 誘導(dǎo)的HBMEC 氧化應(yīng)激的影響（A：SOD 活性；B：MDA 含量；與 control 組相比，*P < 0.05；與 model 組相比，#P < 0.05；與model + TFCOM-L 組相比，△P < 0.05；與model + TFCOM-M 組相比，▲P < 0.05）

Figure 2 Effects of TFCOM on oxidative stress of HBMEC induced by OGD (A: SOD activity; B: MDA content; Compared with the control group,*< 0.05; Compared with the model group,#< 0.05; Compared with the model + TFCOM-L group,△< 0.05; Compared with the model + TFCOM-M group,▲< 0.05)

2.2 榅桲總黃酮對(duì) OGD 誘導(dǎo)的 HBMEC 中氧化應(yīng)激的影響

與對(duì)照組比較，模型組 SOD 活性降低，MDA 含量升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（< 0.05）。與模型組比較，各給藥組 SOD 活性升高，MDA 含量降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（< 0.05），且各檢測(cè)指標(biāo)組間兩兩比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（< 0.05）（圖 2）。

2.3 榅桲總黃酮對(duì) OGD 誘導(dǎo)的 HBMEC 中 circ_HECTD1 表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較，模型組 circ_HECTD1 表達(dá)升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（< 0.05）。與模型組比較，各給藥組circ_HECTD1 表達(dá)降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（< 0.05），且組間兩兩比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（< 0.05）（圖 3）。

2.4 沉默 circ_HECTD1 對(duì) OGD 誘導(dǎo)的 HBMEC 凋亡和氧化應(yīng)激的影響

轉(zhuǎn)染 si-circ_HECTD1 的 HBMEC 中 circ_HECTD1 表達(dá)明顯低于轉(zhuǎn)染 si-NC 的 HBMEC（0.21 ± 0.02 比 1.00 ± 0.00，= 68.416，< 0.05），表明沉默 circ_HECTD1 的 HBMEC 構(gòu)建成功。與模型組或模型+ si-NC 組比較，模型+ si-circ_HECTD1 組 HBMEC 增殖活性升高，凋亡率降低，cleaved-caspase3 蛋白表達(dá)降低，SOD 活性升高，MDA 含量降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（< 0.05）。模型組與模型+ si-NC 組各檢測(cè)指標(biāo)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（> 0.05）（圖 4）。

圖3 TFCOM 對(duì)OGD 誘導(dǎo)的HBMEC 中circ_HECTD1 表達(dá)的影響（與control 組相比，*P < 0.05；與model 組相比，#P < 0.05；與model + TFCOM-L 組相比，△P < 0.05；與model + TFCOM-M 組相比，▲P < 0.05）

Figure 3 Effects of TFCOM on the expression of circ_HECTD1 in HBMEC induced by OGD (Compared with the control group,*< 0.05; Compared with the model group,#< 0.05; Compared with the model + TFCOM-L group,△< 0.05; Compared with the model + TFCOM-M group,▲< 0.05)

2.5 過(guò)表達(dá) circ_HECTD1 減弱榅桲總黃酮對(duì) OGD 誘導(dǎo)的 HBMEC 凋亡的影響

轉(zhuǎn)染 pcDNA-circ_HECTD1 的HBMEC 中circ_HECTD1 表達(dá)明顯高于對(duì)照組 HBMEC（4.32 ± 0.09 比 1.00 ± 0.00，= 63.893，< 0.05），表明過(guò)表達(dá) circ_HECTD1 的 HBMEC 構(gòu)建成功。與模型+ TFCOM 組比較，模型+ TFCOM + pcDNA-circ_HECTD1 組 HBMEC 增殖活性降低，凋亡率升高，cleaved-caspase3 蛋白表達(dá)升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（< 0.05）（圖 5）。

Figure 4 Effects of silencing circ_HECTD1 on the proliferation, apoptosis and oxidative stress of HBMEC induced by OGD (A: Effect of cells apoptosis; B: Effect of cells activity; C: Effect of cleaved-caspase3 protein; D: Effect of SOD activity; E: Effect of MDA content; Compared with model group,*< 0.05; Compared with model + si-NC group,#< 0.05)

2.6 過(guò)表達(dá) circ_HECTD1 減弱榅桲總黃酮對(duì) OGD 誘導(dǎo)的 HBMEC 氧化應(yīng)激的影響

與模型+ TFCOM 組比較，模型+ TFCOM + pcDNA-circ_HECTD1 組 SOD 活性降低，MDA 含量升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（< 0.05）（圖 6）。

3 討論

腦卒中是造成人類(lèi)死亡的第三大疾病，嚴(yán)重威脅患者生命健康[9]。HBMEC 是內(nèi)覆于血管腔表面且具有合成、分泌和代謝等多種功能的連續(xù)單層扁平細(xì)胞，參與血液和腦組織間物質(zhì)交換，在維持大腦動(dòng)態(tài)平衡中發(fā)揮重要作用。近年來(lái)研究表明，HBMEC 損傷是腦卒中發(fā)生發(fā)展的始動(dòng)環(huán)節(jié)和關(guān)鍵，通過(guò)抑制 HBMEC 損傷可延緩腦卒中的發(fā)展進(jìn)程，起到治療腦卒中的作用[10]。

Figure 5 Overexpression of circ_HECTD1 attenuates the effect of TFCOM on the proliferation activity and apoptosis of HBMEC induced by OGD (A: Effect of cells apoptosis; B: Effect of proliferation activity; C: Effect of cleaved-caspase3 protein expression; Compared with model group,*< 0.05; Compared with model + TFCOM group,#< 0.05)

圖6 過(guò)表達(dá)circ_HECTD1 減弱TFCOM 對(duì)OGD 誘導(dǎo)的HBMEC 氧化應(yīng)激的影響（A：對(duì) SOD 活性的影響；B：對(duì) MDA 含量的影響；與model 組相比，*P < 0.05；與model + TFCOM 組相比，#P < 0.05）

Figure 6 Overexpression of circ_HECTD1 attenuates the effect of TFCOM on OGD-induced HBMEC oxidative stress (A: Effect of SOD activity; B: Effect of MDA content; Compared with model group,*< 0.05; Compared with model + TFCOM group,#< 0.05)

天然中草藥或其活性成分因毒副作用小，作用靶點(diǎn)多，效果顯著等優(yōu)點(diǎn)在疾病的治療中表現(xiàn)出較好的優(yōu)勢(shì)，是目前研究的熱點(diǎn)對(duì)象。榅桲總黃酮是榅桲的主要活性成分之一，具有抗炎、抗氧化等功效[11]。有報(bào)道稱(chēng)，榅桲總黃酮可減少 H2O2誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，減輕 H2O2引起的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷作用[8]。本研究結(jié)果顯示，氧糖剝奪可降低 HBMEC 的增殖活性，并促進(jìn)其凋亡，而榅桲總黃酮可有效促進(jìn)氧糖剝奪誘導(dǎo)的 HBMEC增殖，減少細(xì)胞凋亡，且呈劑量依賴(lài)性。細(xì)胞凋亡受多種基因分子和信號(hào)通路的調(diào)控，其中 caspase 級(jí)聯(lián)反應(yīng)在細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。caspase3 是 caspase 級(jí)聯(lián)反應(yīng)的核心分子，其在接收上游凋亡信號(hào)后活化，生成 cleaved-caspase3，進(jìn)一步裂解細(xì)胞內(nèi)底物，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[12]。本研究結(jié)果顯示，榅桲總黃酮對(duì)氧糖剝奪誘導(dǎo)的人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞中 cleaved-caspase3 蛋白表達(dá)起抑制作用，提示其可能通過(guò)抑制 caspase 級(jí)聯(lián)反應(yīng)來(lái)減少氧糖剝奪誘導(dǎo)的 HBMEC 凋亡。

缺血性腦卒中發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，其中氧化應(yīng)激是影響缺血性腦卒中發(fā)生發(fā)展的原因之一。腦缺血發(fā)生時(shí)腦組織中產(chǎn)生大量氧自由基，氧化抗氧化失衡，過(guò)度的氧化應(yīng)激可引起腦組織中細(xì)胞凋亡，加劇腦損傷[13]。MDA 是脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物之一，其水平高低可間接反映氧化應(yīng)激水平[14]。SOD 是重要的抗氧化酶，其可清除氧自由基，減輕自由基對(duì)機(jī)體組織的損傷[15]。本研究結(jié)果顯示，HBMEC 經(jīng)氧糖剝奪誘導(dǎo)后，細(xì)胞中 MDA 含量明顯升高，SOD 活性降低，說(shuō)明氧糖剝奪引起 HBMEC 產(chǎn)生了氧化應(yīng)激；而榅桲總黃酮可呈劑量依賴(lài)性降低氧糖剝奪誘導(dǎo)的 HBMEC 中 MDA 含量，并促進(jìn) SOD 活性，這表明榅桲總黃酮可有效抑制氧糖剝奪誘導(dǎo)的 HBMEC 氧化應(yīng)激水平，減輕細(xì)胞損傷。

circRNA 呈閉合環(huán)狀，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，且高度保守。近年來(lái)，隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)人類(lèi)多種疾病中存在異常表達(dá)的 circRNA，這些 circRNA 在細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激等生理或病理過(guò)程中起調(diào)控作用，為疾病的治療提供了分子靶點(diǎn)[16-18]。研究已表明，多種 circRNA 參與調(diào)控腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，影響缺血性腦卒中的發(fā)生發(fā)展[19]。circ_HECTD1 參與腫瘤、肺纖維化、腦梗死等多種疾病的發(fā)展進(jìn)程[20-22]。本研究結(jié)果顯示，氧糖剝奪能夠明顯促進(jìn) HBMEC 中 circ_HECTD1 的表達(dá)，而沉默 circ_HECTD1 減少氧糖剝奪引起的 HBMEC 凋亡，并降低細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平，與 Dai 等[23]報(bào)道的敲低 circ_HECTD1 可減輕腦缺血引起的神經(jīng)元損傷的結(jié)果一致，這提示 circ_HECTD1 有可能成為治療缺血性腦卒中的靶點(diǎn)。此外，本研究將 40 μg/ml 的榅桲總黃酮作用于氧糖剝奪誘導(dǎo)的過(guò)表達(dá) circ_HECTD1 的 HBMEC，結(jié)果顯示，與未過(guò)表達(dá) circ_HECTD1 的細(xì)胞比較，40 μg/ml 的榅桲總黃酮作用于氧糖剝奪的過(guò)表達(dá) circ_HECTD1 的 HBMEC 凋亡加劇，且氧化應(yīng)激水平升高，這表明過(guò)表達(dá) circ_HECTD1 減弱了榅桲總黃酮對(duì)氧糖剝奪誘導(dǎo)的 HBMEC 凋亡及氧化應(yīng)激的影響，進(jìn)一步提示榅桲總黃酮可能通過(guò)下調(diào) circ_HECTD1 的表達(dá)來(lái)抑制氧糖剝奪誘導(dǎo)的 HBMEC 凋亡及氧化應(yīng)激。

綜上，榅桲總黃酮可減少氧糖剝奪誘導(dǎo)的 HBMEC 凋亡，抑制氧化應(yīng)激，減輕氧糖剝奪誘導(dǎo)的 HBMEC 損傷，其作用機(jī)制可能與下調(diào)細(xì)胞中 circ_HECTD1 表達(dá)有關(guān)。但本研究尚存在一定的不足之處，還需進(jìn)一步在體內(nèi)探究榅桲總黃酮對(duì)缺血性腦卒中發(fā)生發(fā)展的影響；同時(shí)需要分離鑒定榅桲總黃酮的主要成分，進(jìn)一步明確減輕氧糖剝奪誘導(dǎo)的 HBMEC 損傷的主要活性物質(zhì)。

[1] Mu J, Cheng X, Zhong S, et al. Neuroprotective effects of miR-532-5p against ischemic stroke. Metab Brain Dis, 2020, 35(5): 753-763.

[2] Zhou XY, Xu BC, Gu Y, et al. Long noncoding RNA SNHG1 protects brain microvascular endothelial cells against oxygen-glucose deprivation/reoxygenation-induced injury by sponging miR-298 and upregulating SIK1 expression. Biotechnol Lett, 2021, 43(6):1163- 1174.

[3] Zhang L, Yang H, Li WJ, et al. LncRNA MALAT1 promotes OGD-induced apoptosis of brain microvascular endothelial cells by sponging miR-126 to repress PI3K/Akt signaling pathway. Neurochem Res, 2020, 45(9):2091-2099.

[4] Sun ZX, Suo HL, Wang LH. Protective effects of total flavonoids of Cydonia Oblonga Mill on myocardial injury in myocardial infarction in rats and its effect on JNK and NF-κB pathway. Chongqing Med, 2019, 48(10):1646-1651, 1656. (in Chinese)

孫治霞, 索紅亮, 王麗輝. 榅桲總黃酮對(duì)心肌梗死大鼠心肌損傷的保護(hù)作用及對(duì)JNK和NF-κB通路的影響. 重慶醫(yī)學(xué), 2019, 48(10): 1646-1651, 1656.

[5] Zhou WT, Ma H, Abdurahman A, et al. Effects of total flavonoids from Cydonia oblonga on cardiac structure and function in spontaneously hypertensive rats. Chin Traditional Patent Med, 2016, 38(11):2313-2318. (in Chinese)

周文婷, 馬虎, 阿迪力?阿不都熱合曼, 等. 榅桲總黃酮對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠心臟結(jié)構(gòu)和功能的影響. 中成藥, 2016, 38(11):2313- 2318.

[6] Han B, Zhang Y, Zhang Y, et al. Novel insight into circular RNA HECTD1 in astrocyte activation via autophagy by targeting MIR142-TIPARP: implications for cerebral ischemic stroke. Autophagy, 2018, 14(17):1164-1184.

[7] Xiang YY, Wang X, Zhang QX. Influence of medicated serum of Houshi Hei San on expressions of PLCγ2/ERK and TGF-β/Smad2/3 in vascular endothelial cells after injury of oxygen-glucose deprivation. J Beijing Univ Traditional Chin Med, 2019, 42(11):934-939. (in Chinese)

相陽(yáng)陽(yáng), 王璇, 張秋霞. 侯氏黑散含藥血清對(duì)氧糖剝奪損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞PLCγ2/ERK及TGF-β/Smad2/3表達(dá)的影響. 北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào), 2019, 42(11):934-939.

[8] Maimaiti G, Tuerxun A, Abudureheman A, et al. Protective effect of total flavonoids in Cydonia oblanga Mill. on human umbilical vein endothelial cell oxidative damage induced by hydrogen peroxide.J Xinjiang Med Univ, 2016, 39(6):696-702. (in Chinese)

古再努爾?買(mǎi)買(mǎi)提, 阿爾孜古麗?吐?tīng)栠d, 阿迪力?阿不都熱合曼, 等. 榅桲總黃酮對(duì)過(guò)氧化氫誘導(dǎo)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用研究. 新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2016, 39(6):696-702.

[9] Zhang X, Zhou G. MiR-199a-5p inhibition protects cognitive function of ischemic stroke rats by AKT signaling pathway. Am J Transl Res, 2020, 12(10):6549-6558.

[10] Teng H, Li M, Qian L, et al. Long non coding RNA SNHG16 inhibits the oxygen glucose deprivation and reoxygenation induced apoptosis in human brain microvascular endothelial cells by regulating miR 15a 5p/bcl 2. Mol Med Rep, 2020, 22(4):2685-2694.

[11] Zhou WT, Yiming WLY, Ma H, et al. Anti-hypertensive effect of total flavonoids of Cydonia oblonga leaves and its mechanism based on anti-inflammatory function. J Chin Med Mater, 2015, 38(10):2134- 2138. (in Chinese)

周文婷, 鄔利婭?伊明, 馬虎, 等. 榅桲總黃酮降壓作用及抗炎機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究. 中藥材, 2015, 38(10):2134-2138.

[12] Shen X, Wang D, Chen X, et al. Propofol inhibits proliferation, migration, invasion and promotes apoptosis by regulating HOST2/JAK2/STAT3 signaling pathway in ovarian cancer cells. Cytotechnology, 2021, 73(2):243-252.

[13] Li W, Zhu Q, Xu X, et al. MiR-27a-3p suppresses cerebral ischemia-reperfusion injury by targeting FOXO1. Aging (Albany NY), 2021, 13(8):11727-11737.

[14] Yuceli S, Yazici GN, Mammadov R, et al. The effect of lutein on ischemia-reperfusion-induced vasculitic neuropathic pain and neuropathy in rats. In Vivo, 2021, 35(3):1537-1543.

[15] Cheng L, Wang X, Ma X, et al. Effect of dihydromyricetin on hepatic encephalopathy associated with acute hepatic failure in mice. Pharm Biol, 2021, 59(1):557-564.

[16] Lv YS, Wang C, Li LX, et al. Effects of circRNA_103993 on the proliferation and apoptosis of NSCLC cells through miR-1271/ERG signaling pathway. Eur Rev Med Pharmacol Sci, 2020, 24(16):8384- 8393.

[17] Guo X, Miao G, Liu J, et al. CircHivep2 contributes to microglia activation and inflammation via miR-181a-5p/SOCS2 signalling in mice with kainic acid-induced epileptic seizures. J Cell Mol Med, 2020, 24(22):12980-12993.

[18] Shi P, Ji H, Zhang H, et al. circANRIL reduces vascular endothelial injury, oxidative stress and inflammation in rats with coronary atherosclerosis. Exp Ther Med, 2020, 20(3):2245-2251.

[19] Xu X, Wu Z, Qiu H, et al. Circular RNA circPHC3 promotes cell death and apoptosis in Human BMECs after oxygen glucose deprivation via miR-455-5p/TRAF3 axis in vitro. Neuropsychiatr Dis Treat, 2021, 17:147-156.

[20] Jiang QL, Feng SJ, Yang ZY, et al. CircHECTD1 up-regulates mucin 1 expression to accelerate hepatocellular carcinoma development by targeting microRNA-485-5p via a competing endogenous RNA mechanism. Chin Med J (Engl), 2020, 133(15):1774-1785.

[21] Fang S, Guo H, Cheng Y, et al. circHECTD1 promotes the silica-induced pulmonary endothelial-mesenchymal transition via HECTD1. Cell Death Dis, 2018, 9(3):396.

[22] Zhang Z, He J, Wang B. Circular RNA circ_HECTD1 regulates cell injury after cerebral infarction by miR-27a-3p/FSTL1 axis. Cell Cycle, 2021, 20(9):914-926.

[23] Dai Q, Ma Y, Xu Z, et al. Downregulation of circular RNA HECTD1 induces neuroprotection against ischemic stroke through the microRNA-133b/TRAF3 pathway. Life Sci, 2021, 264:118626.

Effects of total flavonoids of. on human brain microvascular endothelial cells injury induced by oxygen and glucose deprivation and its mechanism

LIU Yu-qi, XI Ou, LIU Yi-tong

Department of Encephalopathy (LIU Yu-qi, XI Ou), Department of Rehabilitation (LIU Yi-tong), The Second Affiliated Hospital of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, Shenyang 110000, China

To explore the effect of total flavonoids of. (TFCOM) on the damage of human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) induced by oxygen glucose deprivation (OGD) and its possible mechanism.HBMEC was culturedand an OGD model was established. After 10, 20, 40 μg/ml TFCOM were used to interfere with OGD-induced HBMEC, CCK8 method was used to detect cell proliferation activity; flow cytometry was used to detect cell apoptosis; Western blot was used to detect the expression of cleaved-caspase3 protein in cells; Enzyme-linked immunosorbent assay was used to detect SOD activity and MDA content in cells, and RT-PCR was used to detect the expression of circ_HECTD1. The small interfering RNA or overexpression vector of circ_HECTD1 was transfected into HBMEC respectively. The same methods as above were used to observe the effects of circ_HECTD1 on the proliferation and apoptosis of HBMEC induced by OGD and the expression of cleaved-caspase3 protein, SOD activity and MDA content in cells.TFCOM dose-dependently enhanced OGD-induced HBMEC proliferation activity and SOD activity, and reduced OGD-induced HBMEC apoptosis rate, the expression of cleaved-caspase3 protein and circ_HECTD1, as well as MDA content in cells. Silencing circ_HECTD1 enhanced the proliferation activity of HBMEC induced by OGD and SOD activity in cells, but reduced the apoptosis rate of HBMEC induced by OGD, and the content of cleaved-caspase3 protein and MDA in cells. Overexpression of circ_HECTD1 weakened the effects of TFCOM on the proliferation and apoptosis of HBMEC induced by OGD, and SOD activity and MDA content in the cells.TFCOM could reduce OGD-induced HBMEC apoptosis and inhibit oxidative stress. Its mechanism may be related to the down-regulation of circ_HECTD1 expression in the cells.

total flavonoids of.; circ_HECTD1; oxygen glucose deprivation; human brain microvascular endothelial cells; apoptosis; oxidative stress

LIU Yu-qi, Email: lyq13654076169@163.com

10.3969/j.issn.1673-713X.2021.06.007

遼寧省中醫(yī)藥管理局遼寧省中醫(yī)藥臨床學(xué)（專(zhuān)）科能力建設(shè)項(xiàng)目（LNZYXZK201906）

劉禹岐，Email：lyq13654076169@163.com

2021-05-28