微生物來源的PCSK9轉錄抑制劑的發(fā)現(xiàn)及活性研究

何維，楊雨欣，李怡宏，李曉茜，李星星，侍媛媛，孫紅敏，王麗，解云英，洪斌

·論著·

微生物來源的PCSK9轉錄抑制劑的發(fā)現(xiàn)及活性研究

何維*，楊雨欣*，李怡宏，李曉茜，李星星，侍媛媛，孫紅敏，王麗，解云英，洪斌

100050 北京，中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院醫(yī)藥生物技術研究所衛(wèi)健委抗生素生物工程重點實驗室（何維、楊雨欣、李怡宏、李星星、侍媛媛、孫紅敏、王麗、洪斌），醫(yī)科院藥物合成生物學重點實驗室（李怡宏、李曉茜、李星星、侍媛媛、孫紅敏、解云英、洪斌）

擬通過篩選尋找具有 PCSK9 表達抑制活性的菌株發(fā)酵液及其活性組分，通過對其活性進行初步研究，以期獲得能夠用于治療或預防動脈粥樣硬化的先導化合物或藥物候選物。利用前期工作構建的 PCSK9 轉錄抑制劑高通量篩選模型對國家新藥（微生物）篩選中心發(fā)酵液樣品庫進行篩選，對陽性發(fā)酵液進行分離提取以獲得具有 PCSK9 表達抑制活性的小分子化合物，利用蛋白免疫印跡方法檢測化合物對相關蛋白表達的影響，利用流式細胞術檢測肝細胞攝取 LDL-C 情況的變化。獲得陽性菌株 I03A-00300 及其活性組分殺粉蝶菌素 A1。殺粉蝶菌素 A1在低濃度時即可顯著抑制 HepG2 細胞中 PCSK9 的表達，進而增加LDLR 的表達。還可以促進 LDLR 介導的肝細胞對 LDL-C 的攝取功能增加約一倍。殺粉蝶菌素 A1 作為 PCSK9 抑制劑，在細胞水平證實可上調 PCSK9 調控的下游基因 LDLR 的表達及其介導的 LDL 膽固醇的攝取作用，證明該化合物有望發(fā)展為新型抗動脈粥樣硬化先導化合物。

動脈粥樣硬化； PCSK9； 高通量篩選； 低密度脂蛋白膽固醇； 殺粉蝶菌素 A1

心血管疾?。╟ardiovascular disease，CVD）是全世界人類健康的主要威脅之一，其中低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）是動脈粥樣硬化性心血管疾?。╝therosclerotic cardiovascular disease，ASCVD）發(fā)展的重要危險因素之一[1]。因此，降低 LDL-C 的水平對于治療心血管疾病具有重要意義。PCSK9 是 2003 年被發(fā)現(xiàn)并被證明為心血管疾病的第三個易感基因[2-3]，它可以通過調節(jié)肝臟 LDLR 的降解來調控 LDL-C 的水平，抑制 PCSK9 可以有效地降低 LDL-C 的水平[4-5]。目前已成功上市的 PCSK9 抑制劑是兩種單克隆抗體，分別是 alirocumab（Praluent?）和 evolocumab（Repatha?），臨床數(shù)據(jù)表明這兩個單克隆抗體均可以有效地降低心血管疾病的發(fā)生率[6]。除此之外，Alnylam/The Medicines Company 研發(fā)的干擾肝臟中 PCSK9 合成的 siRNA 藥物 inclisiran（Leqvio?）于 2020 年 12 月在歐盟獲得批準[7]。雖然 PCSK9 單克隆抗體或 siRNA 藥物具有良好的療效，但是也存在著價格昂貴、儲存運輸不便、給藥方式限制等問題。小分子藥物具有易合成、價格低、給藥方式便捷等優(yōu)勢，因此尋找 PCSK9 小分子抑制劑成為研究熱點。

微生物是天然產物的重要來源。在這些天然產物中已經發(fā)現(xiàn)了許多具有藥物活性的小分子化合物。據(jù)統(tǒng)計，自從 1928 年青霉素發(fā)現(xiàn)以來，人們已經鑒定出了超過 2.3 萬個微生物來源的天然產物，其中大部分是由細菌特別是放線菌產生的[8]。同樣，治療心血管疾病的他汀類藥物也是發(fā)現(xiàn)于真菌[9]。近年來很多國家和研究機構開始建立微生物粗提品庫，并利用新型篩選模型對其進行大規(guī)模篩選，以期發(fā)現(xiàn)具有新活性、新結構的天然產物。與化合物庫及其他篩選文庫相比，微生物粗提品庫的生產成本較低，并且富含多種天然產物，為新結構、新活性天然產物藥物的發(fā)現(xiàn)提供了更大的可能性。本研究所國家新藥（微生物）篩選發(fā)酵液粗提品庫，目前已擁有 76 000 個菌株的發(fā)酵液粗提品樣品，且樣品來源廣泛，為大規(guī)模篩選提供了保障。

本研究利用本課題組前期成功構建的 PCSK9 轉錄抑制劑的高通量篩選模型對本所國家新藥（微生物）篩選中心發(fā)酵液粗提品庫進行高通量篩選，以期獲得可以抑制 PCSK9 表達的發(fā)酵液樣品，對相應菌株進行重新發(fā)酵及活性確證后找到活性較好且可穩(wěn)定培養(yǎng)與發(fā)酵的陽性菌株，對其發(fā)酵液以活性為導向，進行一系列的分離提取、結構鑒定，最終找到具有 PCSK9 表達抑制活性的小分子化合物殺粉蝶菌素 A1，其在細胞水平顯著影響 PCSK9 基因的表達及其介導的功能，有望發(fā)展為治療抗動脈粥樣硬化的先導化合物。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料 重組報告基因質粒 pGL4-PCSK9-D1/D2/D3/D4/D5/D6/D7 及人肝癌細胞 HepG2、pGL4-PCSK9-P HepG2 細胞株均為本室保存[10]；MEM培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25% 胰酶均購自美國 Gibco 公司；MTT 溶液購自北京索萊寶科技有限公司；螢火蟲熒光素酶試劑盒購自美國 Promega 公司；10 × 蛋白電泳轉移緩沖液、10 × 封閉-洗滌緩沖液（TBST）購自北京普利萊基因技術有限公司；增強型 HRP 底物（ECL 發(fā)光液）購自美國 Millipore 公司；人血漿低密度脂蛋白（DiI-LDL）DiI-labeled 購自 ADI Alpha Diagnostic International 公司。

1.1.2 儀器 EPS 301 電泳儀為美國 Amersham Biosciences 公司產品；Gel Doc XR 凝膠成像系統(tǒng)為美國 Bio-Rad 公司產品；VICTOR X5 多標記微孔板檢測儀為美國 PerkinElmer 公司產品；HERAcell 150 CO2培養(yǎng)箱為美國 Thermo Scientific 公司產品；CKX41 倒置顯微鏡為日本 Olympus 公司產品；NovoCyte 流式細胞儀為美國 ACEA Biosciences 公司產品；LC-20AD 高效液相色譜儀為日本 Shimadzu 公司產品。

1.2 方法

1.2.1 發(fā)酵液樣品的篩選 將國家新藥（微生物）篩選中心發(fā)酵液樣品用 100% DMSO 稀釋 5 倍作為待篩樣品。篩選使用 96 孔板，PCSK9 表達抑制劑篩選模型細胞（pGL4-PCSK9-P HepG2 細胞）密度為 6 × 106個/ml，每孔 100 μl 鋪板，培養(yǎng) 24 h 后替換為無血清培養(yǎng)基，每孔 200 μl，每孔加入待測樣品 1 μl，繼續(xù)培養(yǎng) 24 h 后進行細胞熒光素酶活性檢測。

1.2.2 化合物分離純化和鑒定 將菌株 I03A-00300 的斜面培養(yǎng)物接種于種子培養(yǎng)基 ISP2（酵母浸粉 0.4%，麥芽浸粉 1%，葡萄糖 0.4%，瓊脂 1.5%，去離子水 1000 ml）中得種子培養(yǎng)物，以 5% ～ 10% 接種量轉接于 A1 發(fā)酵培養(yǎng)基（葡萄糖 0.5%，麥芽膏 1%，棉籽餅粉 1%，可溶性淀粉 2%，酵母膏 0.5%，K2HPO40.05%，CaCO30.3%，NaCl 0.1%，自來水 1000 ml）28 ℃、220 r/min，培養(yǎng) 5 d，獲得菌株發(fā)酵液樣品。將發(fā)酵液離心后得到上清液和菌絲體部分，上清液上大孔樹脂柱，依次用去離子水、30% 丙酮、100% 丙酮洗脫得 P1 組分；菌體部分使用丙酮萃取，旋轉蒸發(fā)濃縮后，粗品復溶于 90% 甲醇水溶液中，用石油醚進行萃取，保留石油醚部分，真空濃縮后得菌絲體提取物 P2。合并 P1 和 P2 部分，復溶于 80% 甲醇水溶液中，采用半制備 HPLC 純化各組分，按峰收集制備，真空濃縮干燥得不同組分后溶于氘代 DMSO 制成為待檢測樣品。經高分辨質譜（HRESI-MS）及核磁共振（NMR）分析，確證化合物結構。

1.2.3 化合物毒性實驗 將處于對數(shù)生長期的 HepG2 細胞，經漂洗、消化吹打成單細胞懸液后按照 5 × 105個/ml 密度接種 96 孔板中，培養(yǎng)24 h 后加入無血清 MEM 培養(yǎng)基倍比稀釋后的待測樣品，并設置空白對照，繼續(xù)培養(yǎng) 24 h；每孔加入 10 μl 的 0.5% MTT 溶液，MTT 的終濃度為 0.5 mg/ml，繼續(xù)孵育 4 h，PBS 漂洗后每孔加入 100 μl 的 DMSO，確定結晶物都已溶解后，在570 nm 波長處檢測吸光值，計算細胞存活率。細胞存活率（%）=（加藥組光吸收值/對照組光吸收值）× 100%。

1.2.4 蛋白免疫印跡 將 HepG2 細胞接種于12 孔板中培養(yǎng) 24 h，加入含待測化合物的無血清 MEM 培養(yǎng)基，同時設立空白對照，繼續(xù)培養(yǎng) 24 h；用 RIPA 裂解液裂解細胞，裂解后的蛋白樣品用 10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠分離電泳（PAGE），然后電印跡在 0.45 μm PVDF 膜上，PVDF 膜與抗 PCSK9、LDLR 或 GAPDH 的一抗 4 ℃孵育過夜，TBST 沖洗后，與辣根過氧化物酶（HRP）結合的二抗在室溫下孵育 1 h，加入 HRP 底物發(fā)光液 ECL 進行檢測。

1.2.5 流式細胞術 將 HepG2 細胞以 8 ×105個/ml 的密度接種于 12 孔板中，放入細胞培養(yǎng)箱中過夜；移除舊培養(yǎng)基，加入含待測化合物的無血清 MEM 培養(yǎng)基，同時設立空白對照，繼續(xù)培養(yǎng)24 h；加入無血清培養(yǎng)基稀釋的 2 μg/ml DiI-LDL，避光孵育 4 h，移去培養(yǎng)基，用預冷的 PBS 漂洗后，加入胰酶消化并加入含血清的培養(yǎng)基吹打成單細胞懸液，1000 r/min 離心 3 min，用 PBS 重懸細胞并經 300 目網篩過濾，用流式細胞儀進行檢測。

1.2.6 細胞瞬時轉染 將細胞按 3 × 104個/孔接種于 96 孔板中，放入培養(yǎng)箱中。過夜后按照每孔 100 ng 質粒加入 5 μl opti-MEM 培養(yǎng)基及 0.2 μl 的 P3000 試劑中，同時用 5 μl opti-MEM 培養(yǎng)基稀釋 0.3 μl 轉染試劑 lipo 3000，然后將兩種混合液混勻后室溫孵育 10 ～ 15 min。吸除板中的舊培養(yǎng)基，每孔加入 100 μl 轉染混合溶液。孵育 6 h 后，加入不同濃度的殺粉蝶菌素 A1 后放入培養(yǎng)箱中，24 h 后測定熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 PCSK9 基因表達抑制劑殺粉蝶菌素 A1 的發(fā)現(xiàn)及初步評價

本工作對國家新藥（微生物）篩選中心發(fā)酵液粗提品庫共計 12 560 樣次的發(fā)酵液粗提品進行初步篩選，使用螢火蟲熒光素酶檢測系統(tǒng)，以抑制率 > 50% 設置為初篩陽性。篩選結果如圖 1A 所示，初篩共獲得 350 個陽性發(fā)酵液樣品，陽性率為 2.8%，通過對陽性發(fā)酵液進行重新檢測、稀釋、相應菌株重新發(fā)酵再檢測后，最終獲得 6 株活性較好且可以重復的陽性菌株。我們對其中活性最好的 I03A-00300 在 PCSK9 表達抑制劑篩選模型上進行了進一步量效分析，結果如圖 1B 所示，其發(fā)酵液可顯著下調 PCSK9 的表達活性。以 PCSK9 基因表達抑制活性為導向，對菌株 I03A-00300 進行擴大發(fā)酵與分離提取及結構鑒定，最終確定活性菌株 I03A-00300 的發(fā)酵液中具有 PCSK9 表達抑制活性的小分子化合物殺粉蝶菌素 A1（圖 1C）。

Figure 1 Discovery of strains with PCSK9 inhibitory activity and the isolation, extraction and identification of active components [A: Screening results of crude extracts from fermentation broth by PCSK9 transcriptional inhibitor screening assay; B: The dose-effect of positive fermentation broth I03A-00300 on the PCSK9 transcriptional inhibitor screening assay; C: HPLC chromatogram of fermentation broth I03A-00300 and effects of each component on the protein levels of PCSK9 and LDLR in HepG2 cells (F4 was confirmed to be piericidin A1 by structural identification) ]

對活性組分殺粉蝶菌素 A1 的量效關系進行檢測，將殺粉蝶菌素 A1 以 10 倍比梯度稀釋后作用于 PCSK9 表達抑制劑篩選模型上，熒光素酶活性檢測結果顯示，殺粉蝶菌素 A1 可劑量依賴地抑制 PCSK9 轉錄活性，量效關系曲線如圖 2A 所示，經計算其 IC50為 2.98 nmol/L。為檢測化合物的細胞毒性，利用 MTT 法檢測殺粉蝶菌素 A1 在不同濃度下對 HepG2 細胞存活和生長的影響。結果顯示，在濃度 0 ～ 40 μg/ml（0 ～ 100 μmol/L）之間時，細胞存活率均為對照組的 90% 以上，即對細胞的生長存活幾乎沒有影響（圖2B）。

2.2 化合物殺粉蝶菌素 A1 對 HepG2 細胞中 PCSK9 及 LDLR 蛋白水平的影響

利用 PCSK9 轉錄抑制劑高通量篩選模型獲得的微生物來源的活性化合物殺粉蝶菌素 A1，前期結果表明可劑量依賴性地抑制 PCSK9 啟動子活性，因此為了進一步驗證其是否影響 PCSK9 基因的表達，我們檢測了 HepG2 細胞中 PCSK9 的蛋白的表達水平。首先將不同濃度的殺粉蝶菌素 A1 與 HepG2 細胞共同孵育 24 h，隨后提取細胞總蛋白進行 Western blot 實驗分析。結果顯示，殺粉蝶菌素 A1 可以顯著抑制 HepG2 細胞中 PCSK9 蛋白表達（圖 3A）。

PCSK9 可以與肝細胞表面的 LDLR 中表皮生長因子 A（EGF-A）樣結構域特異性結合并形成 PCSK9/LDLR 復合物，介導其進入溶酶體降解，導致細胞表面的 LDLR 減少，進而減少 LDL-C 的攝取[4]。因此我們進而檢測了殺粉蝶菌素 A1 對 HepG2 細胞中 LDLR 蛋白水平的影響。結果顯示，殺粉蝶菌素 A1 可以顯著上調 LDLR 蛋白表達，且呈劑量依賴性（圖 3B）。

2.3 化合物殺粉蝶菌素 A1 對 HepG2 細胞攝取 LDL-C 的影響

LDL-C 是一種運載膽固醇進入外周組織細胞的脂蛋白顆粒，當 LDL-C 過量時，它攜帶的膽固醇便積存在動脈壁上，促使動脈粥樣硬化的產生和發(fā)展。LDLR 可以與 LDL-C結合，介導 LDL 被細胞內吞，循環(huán)中 70% 的 LDL 在肝臟被攝取并代謝掉。

DiI 全稱為1,1'-雙十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚羰基花青高氯酸鹽，是最常用的細胞膜熒光探針之一，進入細胞膜后可以側向擴散逐漸使整個細胞膜被染色，當與細胞膜結合后其熒光強度大大增強，被激發(fā)后可以發(fā)出橙紅色的熒光。熒光標記的人源低密度脂蛋白（human DiI-LDL）是標記熒光探針 DiI 的 LDL，可用來評估細胞 LDLR 攝取LDL-C 的能力。因此我們利用 DiI-LDL 檢測殺粉蝶菌素 A1對HepG2 細胞攝取 LDL-C 的影響，驗證其對 LDLR 介導的肝細胞攝取 LDL-C 功能的影響。將不同濃度的殺粉蝶菌素 A1 作用 HepG2 細胞 24 h 后，加入 DiI-LDL 孵育 4 h，流式細胞術檢測攝取情況。結果顯示，與對照組相比，不同濃度的殺粉蝶菌素 A1 可以不同程度地增加 HepG2 細胞攝取 LDL 的能力，當殺粉蝶菌素 A1 作用濃度為 1 μmol/L時，肝細胞 HepG2 對 DiI-LDL 攝取能力為對照的 2.1 倍（圖 4）。

圖 2 化合物殺粉蝶菌素 A1 的初步活性驗證（A：在 PCSK9 表達抑制劑篩選模型上的量效關系曲線；B：在 HepG2 細胞上的細胞毒性檢測）

Figure 2 Preliminary evaluation of piericidin A1 (A: The dose-effective curve of piericidin A1 on the PCSK9 transcriptional inhibitor screening assay; B: Effects of piericidin A1 on cell proliferation and cytotoxicity)

圖 3 化合物殺粉蝶菌素 A1 對 HepG2 細胞 PCSK9（A）及 LDLR（B）蛋白水平的影響

Figure 3 Effects of piericidin A1 on PCSK9 (A) and LDLR (B) protein levels in HepG2 cells

圖 4 化合物殺粉蝶菌素A1 對HepG2 細胞攝取DiI-LDL 的影響

Figure 4 Effects of the piericidin A1 on DiI-LDL uptake in HepG2 cells

2.4 殺粉蝶菌素 A1通過轉錄因子 HNF1α 和 HINFP 調節(jié) PCSK9 的表達

為了研究殺粉蝶菌素 A1 介導 PCSK9 轉錄抑制的機制，我們采用前期構建的含有人 PCSK9 基因不同缺失啟動子區(qū)（D1 ～ D7，圖 5A）的熒光素酶報告質粒分別轉染 HepG2 細胞，進而加入殺粉蝶菌素 A1 共孵育后檢測熒光素酶活性，以分析其對不同區(qū)段 PCSK9 啟動子轉錄活性的影響。結果顯示，D1 ～ D5 的熒光素酶活性在殺粉蝶菌素 A1 作用后顯著降低，在缺失–392 ～–351 bp 之間的序列后，該抑制作用被抵消，說明該段區(qū)域均對殺粉蝶菌素 A1 介導的 PCSK9 轉錄抑制活性發(fā)揮了重要調控作用（D5 vs. D6，圖 5B）。而以該段序列為結合位點的轉錄因子主要包括 HNF1α、HINFP。綜上結果表明殺粉蝶菌素 A1可能通過作用于HNF1α、HINFP 等轉錄因子，從而介導了 PCSK9 的表達下調以及隨后 LDLR 表達的上調、肝細胞對 LDL-C 攝取的增加。

3 討論

由于 PCSK9 蛋白表面沒有天然的結合口袋，PCSK9 和 LDLR 結合結構域（EGFA 結構域）均由平坦、無特征的表面組成，在大的表面積上表現(xiàn)出疏水相互作用，小分子很難與其結合[11]，因此開發(fā)抑制 PCSK9 與 LDLR 相互作用的小分子藥物非常困難[12]。近年來，有更多的研究轉向 PCSK9基因轉錄與表達途徑的小分子抑制劑的發(fā)現(xiàn)上。一些天然產物，如小檗堿（berberine，BBR）[13]、丹參酮 IIA[14]等已被發(fā)現(xiàn)可降低 PCSK9 的轉錄和表達，但由于它們廣泛的調節(jié)作用，尚未開發(fā)為 PCSK9 抑制劑。Pfizer 公司通過高通量篩選找到了 R-IMPP，其可以靶向人 80S 核糖體，進而抑制 PCSK9 蛋白合成[15]，但由于它的藥代動力學性質不盡人意，已停止開發(fā)。除此之外，近年有研究通過尋找對 PCSK9 有高度親和力的小分子，制備與其配合使用的異雙功能分子，作為 PCSK9 的高親和力配體，與多種泛素-蛋白酶體系統(tǒng)（UPS）募集元件連接，從而促進 PCSK9 的降解[16]。本工作利用實驗室前期構建的 PCSK9 轉錄抑制劑篩選細胞模型，以期篩選到作用于 PCSK9 轉錄水平的小分子抑制劑。

圖 5 殺粉蝶菌素A1 可能通過HNF1α 和HINFP 下調 PCSK9的轉錄活性（A：含有全長或不同缺失的人 PCSK9 啟動子重組熒光素酶報告基因的構建示意圖，ATG 起始密碼子前的核苷酸指定為 +1，-1 是 PCSK9 啟動子插入片段的3' 末端；B：殺粉蝶菌素A1 對轉染含有不同區(qū)段缺失啟動子 D1 ～ D7 的 PCSK9 熒光素酶報告質粒轉染的 HepG2 細胞熒光素酶活性的影響；與溶劑對照相比，*P < 0.05，與 D5 相比#P < 0.05，n = 3）

Figure 5 Piericidin A1 may downregulates PCSK9 transcriptional expression through HNF1α and HINFP (A: The schematic diagram of the recombinant luciferase reporter constructs containing full-length or different truncated human PCSK9 promoter region. Position +1 was designated as the nucleotide preceding the ATG start codon. Position -1 was the 3' end of PCSK9 promoter inserts; B: Effects of piericidin A1 on the luciferase activity of D1-D7 in HepG2 cells.*< 0.05 vs. vehicle in the corresponding group,#< 0.05 vs. D5, n = 3)

目前使用較廣泛的高通量篩選形式主要建立在分子水平或細胞水平的篩選模型，以微孔板形式為載體對樣品庫進行高效篩選。本工作中采用的 PCSK9 表達抑制劑篩選模型是以細胞為載體，在 96 孔板上對微生物發(fā)酵液粗提品庫進行高通量篩選。相較基于分子水平的篩選，細胞水平的篩選更接近體內的生理生化過程，獲得的陽性樣品活性更準確真實，且便于后續(xù)對樣品的生物活性進行綜合評價。

殺粉蝶菌素 A 是 1963 年被 Takahashi 及其同事首次從土壤來源鏈霉菌 Streptomyces mobaraensis 中分離得到的具有殺蟲活性的新化合物[17]。其整體結構類似輔酶 Q，可作為輔酶 Q 拮抗劑，是線粒體傳遞鏈中特異和強效的 NADH-泛醌氧化還原酶（complex I）抑制劑[18]。除了最初發(fā)現(xiàn)的殺蟲活性，研究還發(fā)現(xiàn)殺粉蝶菌素 A1 具有抗菌活性及抗腫瘤活性[19-22]，而殺粉蝶菌素 A1 在膽固醇代謝中的作用尚未見報道。

本工作利用實驗室前期構建的 PCSK9 轉錄抑制劑篩選模型對發(fā)酵液粗提品庫進行篩選，獲得了具有 PCSK9 表達抑制活性的陽性發(fā)酵液樣品及其活性組分殺粉蝶菌素 A1；經實驗證實粉蝶菌素 A1 在納摩爾濃度時即可顯著抑制 HepG2 細胞中 PCSK9 的表達，增加 LDLR 的表達，還可以促進 LDLR 介導的肝細胞對 LDL-C 的攝取功能；初步機制研究發(fā)現(xiàn)該化合物可能通過作用于 HNF1α、HINFP 等轉錄因子從而調控 PCSK9 轉錄活性。綜上結果證明粉蝶菌素 A1 有望發(fā)展為新型抗動脈粥樣硬化先導化合物。

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Discovery and activity of transcriptional inhibitors of PCSK9 derived from microorganism

HE Wei, YANG Yu-xin, LI Yi-hong, LI Xiao-qian, LI Xing-xing, SHI Yuan-yuan, SUN Hong-min, WANG Li, XIE Yun-ying,HONG Bin

NHC Key Laboratory of Biotechnology of Antibiotics (HE Wei, YANG Yu-xin, LI Yi-hong, LI Xing-xing, SHI Yuan-yuan, SUN Hong-min, WANG Li, HONG Bin), CAMS Key Laboratory of Synthetic Biology for Drug Innovation (LI Yi-hong, LI Xiao-qian, LI Xing-xing, SHI Yuan-yuan, SUN Hong-min, XIE Yun-ying, HONG Bin), Institute of Medicinal Biotechnology, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100050, China

We aimed to obtain active fermentation broth of strains and its active components targeting PCSK9 transcriptional activity through screening. The active compounds are potential to be developed to leading compounds or drug candidates that can be used for the treatment or prevention of atherosclerosis.The constructed high-throughput drug screening assay targeting PCSK9 transcriptional expression was applied to screen fermentation broth samples from the national new drug (microorganism) screening laboratory. The positive fermentation broth was isolated and extracted to obtain small molecular compounds with PCSK9 transcriptional inhibitory activity. Western blot was used to detect the effects of the active compounds on PCSK9 and LDLR expression, and flow cytometry was used to evaluate the changes on LDL-C uptake by HepG2 cells.The positive strain I03A-00300 and its active component, piericidin A1 were obtained. Piericidin A1 significantly inhibited the expression of PCSK9, followed by increased LDLR protein level and enhanced LDLR-mediated uptake of LDL-C in HepG2 cells at a relatively lower concentration.As PCSK9 inhibitor, piericidin A1 up-regulates the expression of downstream gene LDLR and LDLR-mediated LDL cholesterol uptake by targeting PCSK9 transcription at the cellular level. This proves that piericidin A1 is expected to be developed as a new lead compound for anti-atherosclerosis.

atherosclerosis; PCSK9; high-throughput screening; LDL-C; piericidin A1

WANG Li, Email: wangli_imb@163.com; HONG Bin, Email: binhong69@hotmail.com

10.3969/j.issn.1673-713X.2021.06.002

國家自然科學基金（81473214）

王麗，Email：wangli_imb@163.com；洪斌，Email：binhong69@hotmail.com

2021-04-15

*同為第一作者