支氣管肺泡灌洗液液基細(xì)胞學(xué)聯(lián)合腫瘤標(biāo)志物鑒別良惡性孤立性肺結(jié)節(jié)的價值*

李 斌，白東明，楊曉輝

（山東省德州市人民醫(yī)院胸外科，德州 253000）

肺癌是常見的呼吸系統(tǒng)惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率均居惡性腫瘤的首位[1-2]。大多數(shù)肺癌的前身為孤立性肺結(jié)節(jié)（solitary pulmonary nodules，SPN），SPN是一種類圓形的肺內(nèi)病灶，邊界清晰，直徑一般小于3 cm，常呈現(xiàn)結(jié)節(jié)狀良性或惡性病變[3-4]。有研究發(fā)現(xiàn)，超過50%的SPN會發(fā)生惡性病變[5]。因此，臨床早期檢測肺部結(jié)節(jié)，準(zhǔn)確鑒別其組織學(xué)特征有重要意義。目前，鑒別SPN良惡性的方法主要有纖支鏡刷檢與活檢、CT引導(dǎo)下經(jīng)皮穿刺活檢、胸腔鏡取活檢病理診斷等[6-8]，但這些方法檢查費(fèi)用昂貴，且為有創(chuàng)檢查。支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）作為在支氣管鏡檢查基礎(chǔ)上形成的一種新的檢查方法，因其可克服痰液中病理細(xì)胞少、留取不規(guī)范等缺點(diǎn)[9]，其診斷肺癌的價值逐漸被學(xué)者重視?；贐ALF的液基細(xì)胞學(xué)檢測（liquid based cytology test，LCT）改善了傳統(tǒng)涂片的制作方法，提高了肺癌診斷的特異度與敏感度[10]。此外，有研究報道，肺癌患者BALF中的腫瘤標(biāo)志物細(xì)胞角蛋白片段21-1（cytokeratin 19 fragment，CYFRA21-1）、癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、神經(jīng)元特異性烯醇化酶（neuron specific enolase，NSE）的含量高于肺炎患者，且3 者聯(lián)合可有效診斷肺癌[11]。推測BALF LCT 聯(lián)合CEA、CYFRA21-1 和NSE 檢測可進(jìn)一步提高鑒別良惡性SPN 的準(zhǔn)確性。本研究采用電化學(xué)發(fā)光法檢測BALF 中CEA、CYFRA21-1 和NSE 的含量，探討B(tài)ALF LCH 聯(lián)合CEA、CYFRA21-1 和NSE 檢測鑒別良惡性SPN的價值，以期為SPN的診斷提供新的指標(biāo)。

1 對象與方法

1.1 研究對象

回顧性分析2017 年5 月1 日至2020 年5 月1 日在山東省德州市人民醫(yī)院胸外科收治的107例SPN患者為研究對象。病例納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）經(jīng)組織學(xué)或細(xì)胞學(xué)證實(shí)為良性或惡性SPN；（2）年齡≥18歲；（3）SPN直徑＜3 cm；（4）心腎功能正常。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）已行放化療者；（2）穿刺后結(jié)節(jié)者；（3）磨玻璃密度結(jié)節(jié)者；（4）結(jié)節(jié)內(nèi)伴有空洞形成者。根據(jù)SPN 是否為良惡性將患者分為良性SPN 組和惡性SPN組。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會審批通過，患者知情同意并簽署知情同意書。

1.2 支氣管肺泡灌洗液液基細(xì)胞學(xué)檢查

采用中華醫(yī)學(xué)會呼吸病學(xué)分會BALF細(xì)胞學(xué)檢測技術(shù)規(guī)范[12]，胸部CT 輔助定位，局部麻醉經(jīng)活檢孔注入2%利多卡因1 mL，然后將纖維或電子支氣管鏡頂端楔入段支氣管開口處，再從活檢孔快速注入37 ℃的滅菌生理鹽水，立即以8 kPa 負(fù)壓吸引回收液體，每次注入50 mL，總量200 mL。將回收液篩網(wǎng)過濾后均分成2 份，裝入硅塑瓶，行LCT 檢查。在盛有BALF 的離心管中加入保存液、消化液，充分搖勻、震蕩，靜置15～30 min，梯度離心收集細(xì)胞后，用美國TriPath Imaging 公司生產(chǎn)的AutoCyte PREP 型液基細(xì)胞全自動制片機(jī)制片，制成直徑為13 mm 的細(xì)胞薄片，蘇木精—伊紅（HE）染色，在無水酒精中脫水10 min，依次在二甲苯中透明1 min，樹脂膠封固涂片后顯微鏡下閱片。液基標(biāo)本采用2級分類診斷法，即將細(xì)胞檢查結(jié)果分為陰性、陽性。所有涂片均由2 位病理學(xué)專家同時閱片鏡檢證實(shí)。

1.3 電化學(xué)發(fā)光法檢測BALF 中CEA、CYFRA21-1 和NSE的含量

抽取適量的BALF，3 000 r/min 離心10 min，取上清液，采用電化學(xué)發(fā)光法檢查CEA、CYFRA21-1和NSE 的含量，其中檢測儀器為德國西門子XP 全自動化學(xué)發(fā)光分析儀和深圳新產(chǎn)業(yè)MAGLUMI-4000全自動電化學(xué)發(fā)光分析儀。校準(zhǔn)品、質(zhì)控品以及試劑均為原裝配套，檢查步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用R 3.5.1（https://www.r-project.org/）軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計數(shù)資料以n（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用受試者工作特征曲線（ROC）評估BALF LCH、CEA、CYFRA21-1 和NSE 診斷SPN 的價值，計算ROC 曲線下面積（AUC）、準(zhǔn)確性、敏感度、特異度，采用Clopper-Pearson法[13]計算對應(yīng)值的95%CI，同時，基于logistic回歸評估BALF LCH、聯(lián)合CEA、CYFRA21-1 及NSE鑒別良惡性SPN 的價值，各指標(biāo)AUC 的比較采用DeLong檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料

2017 年5 月1 日至2020 年5 月1 日收集到115例SPN 患者，共107 例患者符合標(biāo)準(zhǔn)納入最終分析。其中惡性SPN 患者63 例（58.9%），男36 例、女27 例，平均（56.9±5.6）歲；組織類型；鱗癌18 例，腺癌38 例，小細(xì)胞癌3例，大細(xì)胞癌2 例，其他類型腫瘤2 例；根據(jù)TNM 分期系統(tǒng)，Ⅰ期17 例，Ⅱ期32 例，Ⅲ期12 例，Ⅳ期2 例；平均結(jié)節(jié)大?。?.2±0.6）cm。在44例（41.1%）良性SPN患者中，男28 例、女16例，平均（55.3±7.9）歲；其中肺結(jié)核11 例，炎性假瘤9 例，肺炎9 例、結(jié)節(jié)病15 例；平均結(jié)節(jié)大?。?.1±0.7）cm。兩組患者年齡、性別、結(jié)節(jié)大小等比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。

2.2 BALF LCT 檢查結(jié)果及CEA、CYFRA21-1 和NSE的含量

BALF LCT檢查結(jié)果顯示，在63例惡性SPN中BALF LCT 陽性檢出35 例，在44 例良性SPN 中BALF LCT 陰性檢出23 例，與金標(biāo)準(zhǔn)的一致率為54.2%。電化學(xué)發(fā)光法檢測結(jié)果顯示，惡性SPN 組CEA、CYFRA21-1 和NSE 的含量均高于良性SPN組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義[CEA:(59.5±19.3) μg/Lvs(12.3±6.5) μg/L,t=1.735,P＜0.001；CYFRA21-1:(45.7±16.8) μg/Lvs(13.6±6.6) μg/L,t=3.637,P＜0.001；NSE:(55.3±22.0)μg/Lvs(20.1±10.3)μg/L,t=2.418,P＜0.001]，見圖1。

圖1 兩組CEA、CYFRA21-1及NSE的含量比較

2.3 BALF LCT 聯(lián)合CEA、CYFRA21-1 及NSE 對SPN的診斷效能

ROC 曲線結(jié)果顯示，BALF LCT、CEA、CYFRA21-1 及NSE 診斷SPN 的AUC 為0.546(95%CI:0.464～0.628)、0.722(95%CI:0.650～0.795)、0.523(95%CI:0.439～0.608)、0.735(95%CI:0.666～0.805)，經(jīng)多因素logistic回歸分析獲得聯(lián)合預(yù)測因子，聯(lián)合預(yù)測因子=0.964+0.965×BALF LCT+11.219×CEA-8.965×CYFRA21-1-1.235×NSE（其中BALF LCT陽性為1，陰性為0；CEA、CYFRA21-1 和NSE 表示對應(yīng)的含量）。聯(lián)合檢測的最佳截斷值為0.32，對應(yīng)的AUC 為0.801(95%CI:0.718～0.847)，明顯高于BALF LCT、CEA、CYFRA21-1 及NSE（均P＜0.001）單獨(dú)診斷SPN 的AUC。其余診斷效能評價指標(biāo)，見表1和圖2。

表1 BALF LCT聯(lián)合CEA、CYFRA21-1及NSE診斷SPN的效能

圖2 BALF LCT、CEA、CYFRA21-1 及NSE 診斷SPN 的ROC曲線

3 討論

目前，鑒別良惡性SPN的方法主要有纖支鏡刷檢與活檢、CT引導(dǎo)下經(jīng)皮穿刺活檢、胸腔鏡取活檢病理診斷等，但均有一定的局限性。近年來研究發(fā)現(xiàn)BALF LCT 對胃癌的早期診斷有一定的價值。朱建勇等[14]研究發(fā)現(xiàn)，與傳統(tǒng)的涂片方法相比，LCT診斷周圍型胃癌的敏感度和特異度均較高，其原因可能與LCT 具有涂片背景清晰、厚薄均勻，細(xì)胞細(xì)微結(jié)構(gòu)清楚；三維立體突出，可基本保持組織學(xué)結(jié)構(gòu)，并可重復(fù)制片等優(yōu)點(diǎn)有關(guān)。SPN為大多數(shù)肺癌的前身，因此鑒別SPN 的良惡性，可在一定程度上早期發(fā)現(xiàn)肺癌。為此，本研究探討B(tài)ALF LCT診斷SPN 的價值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在63 例惡性SPN 中BALF LCT 陽性檢出35 例，在44 例良性SPN 中BALF LCT 陰性檢出23 例，與金標(biāo)準(zhǔn)的一致率為54.2%，提示BALF 對良惡性SPN 的鑒別有一定的價值。但是ROC 曲線分析結(jié)果顯示，其AUC 僅為0.546，表明LCT 雖然有診斷價值，但其診斷效能并不理想。

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，大量有價值的腫瘤標(biāo)志物不斷被發(fā)現(xiàn)，如CEA、CYFRA21-1 和NSE 等，這3種腫瘤標(biāo)志物亦可以通過BALF獲得。CEA是一種相對分子量約為200 000的細(xì)胞膜表面的糖蛋白，亦是最為常見的腫瘤標(biāo)志物，在肺癌及其他腫瘤中含量升高[15]。CYFRA21-1 是細(xì)胞角蛋白19 的一個可溶性片段，主要存在于肺腫瘤上皮的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，它能在激活的蛋白酶作用下降解，以溶解片段的形式釋放入血，是非小細(xì)胞肺癌（NSCLC），尤其是鱗癌的重要標(biāo)志物[16]。NSE是由兩個γ亞單位組成的糖酵解酶，它存在于神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞和神經(jīng)源性腫瘤中，小細(xì)胞肺癌（SCLC）是一種神經(jīng)內(nèi)分泌起源的腫瘤，故NSE 對SCLC 具有一定的診斷價值[17]。本研究檢測CEA、CYFRA21-1 和NSE 在BALF 中的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)惡性SPN 組CEA、CYFRA21-1和NSE的含量均高于良性SPN組，與上述結(jié)果基本一致。但是在診斷方面，CEA、CYFRA21-1 和NSE診斷SPN 的AUC分別為0.722（0.650～0.795）、0.523（0.439～0.608）、0.735（0.666～0.805），提示3 者單獨(dú)診斷SPN 亦有一定的臨床意義，但其效能并不理想。

單一的腫瘤標(biāo)志物無法獲得理想的敏感度和特異度，因此歐洲腫瘤標(biāo)志物專家組亦推薦CEA、CYFRA21-1 和NSE 聯(lián)合檢測用于肺癌的診斷。張紹武等[11]探討肺癌患者BALF 中CEA、CYFRA21-1、NSE 聯(lián)合檢測對肺癌診斷的價值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3 者聯(lián)合的診斷效能均高于單一腫瘤標(biāo)志物。方高潔等[18]研究亦發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合檢測腫瘤標(biāo)記物CEA、鱗狀上皮細(xì)胞癌抗原（SCCA）、CYFRA21-1、NSE可有效診斷肺癌。以上結(jié)果表明，聯(lián)合檢測可能是提高診斷效能的一種有效的診斷方法。為提高診斷效能，本研究將BALF LCT 檢測聯(lián)合腫瘤標(biāo)志物CEA、CYFRA21-1 和NSE 用于診斷SPN。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BALF LCT 檢測聯(lián)合腫瘤標(biāo)志物CEA、CYFRA21-1和NSE的AUC、準(zhǔn)確度、敏感度和特異度分別0.801（95%CI:0.718～0.847）、0.720（95%CI:0.718～0.722）、0.803（95%CI:0.731～0.875）、0.743（95%CI:0.705～0.822），均高于單一診斷指標(biāo)。提示4 項(xiàng)指標(biāo)聯(lián)合檢測可明顯提高診斷效能，在良惡性SPN鑒別中發(fā)揮作用。值得注意的是，CEA、CYFRA21-1 和NSE亦可通過BALF 獲得，因此一次抽樣可以同時獲得4項(xiàng)指標(biāo)，表明該方法具有一定的簡便性和易用性。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)BALF LCT、CEA、CYFRA21-1及NSE在良惡性SPN存在差異，但是單獨(dú)診斷SPN 的效能并不理想，BALF LCT 聯(lián)合CEA、CYFRA21-1 及NSE 可以提高診斷效能，有效輔助SPN的鑒別，值得臨床推廣應(yīng)用。但本研究為回顧性研究且樣本量較小，有關(guān)結(jié)論仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。