蛞蝓多糖的鑒定及其含量測定*

韋秀莎，黃金石，吳婭妮，高雨桐，陳 銘，黃仁彬

（廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，南寧 530021）

蛞蝓（Limax）屬腹足類腹足綱蛞蝓科，一種有肺的軟體動物，俗稱“鼻涕蟲”?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》卷四下品、《本草綱目》、《中藥大辭典》等中醫(yī)藥書籍對蛞蝓性味歸經(jīng)、功效主治均有記載，主治蜈蚣咬傷、痔熱腫痛、腳脛爛瘡、清熱祛風(fēng)、消腫解毒、破痰通經(jīng)、中風(fēng)歪僻、筋脈拘攣、驚癇、喘息、喉痹、咽腫、癰腫、丹毒、經(jīng)閉、癥瘕等。藥理研究發(fā)現(xiàn)，蛞蝓提取物具有抗腫瘤、平喘等多方面的作用，且其毒性較低[1-3]。現(xiàn)代研究表明，蛞蝓含蛋白、多糖等多種成分。陳亮等[4]研究發(fā)現(xiàn)，蛞蝓抗癌有效成分不是蛋白，有可能是多糖。但目前缺乏對水溶性蛞蝓多糖的結(jié)構(gòu)及其含量的研究，因此，本組對水提法獲得的蛞蝓多糖進行鑒定，初步確定其結(jié)構(gòu)，測定其含量，為研究蛞蝓多糖的藥理作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試藥和儀器

蛞蝓，采自廣西百色，經(jīng)廣西中醫(yī)藥研究院賴茂祥教授鑒定，確定為腹足類腹足綱蛞蝓科蛞蝓（Limax）。低溫高速冷凍離心機（德國Eppendorf 公司）；倒置顯微鏡（日本Olympus 公司）；萬分之一電子天平（梅特勒一托利多公司）；紫外可見分光光度計（上北京譜析TV-1901）；傅里葉紅外光譜儀（美國珀金埃爾莫Spectrum 100）。所用到的化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 蛞蝓的性狀鑒別與顯微鑒別[5]

根據(jù)《中國藥典》2020版的項目要求第15項，對本次實驗采集的蛞蝓全蟲大小、顏色、器官、氣味等特征進行性狀觀察。將蛞蝓全蟲置于4%甲醛溶液中固定，24 h后，進行標本修剪、漂洗、脫水、透明、透蠟、包埋、切片與展片、烘片，中性樹脂封片，蘇木精—伊紅（HE）染色后，通過顯微鏡對蛞蝓橫切面組織形態(tài)進行觀察。

1.3 蛞蝓多糖的提取

稱取蛞蝓全蟲1 kg，液料比2∶1加入蒸餾水進行破壁勻漿，4 000 r/min低溫離心15 min，棄上層漂浮物和下層沉淀，得粗提液，加80%乙醇醇沉24 h，離心，收集沉淀，低溫真空干燥，研磨均勻，過40 目篩，得蛞蝓粗多糖[6]。

1.4 蛞蝓多糖的鑒定試驗[7]

取200 mg的蛞蝓多糖溶解于10 mL蒸餾水中，超聲助溶30 min，得蛞蝓多糖溶液。采用Molish 反應(yīng)和斐林反應(yīng)鑒定蛞蝓多糖。Molish 反應(yīng)：分別取1 mL 的蒸餾水陰性對照溶液和蛞蝓多糖溶液于試管中，然后加4滴α-萘酚試劑，搖勻后沿管壁緩緩滴加濃硫酸1 mL，觀察液面交界處是否有紫環(huán)。斐林反應(yīng)：分別取1 mL的蒸餾水陰性對照溶液和蛞蝓多糖溶液于試管中，再分別往試管滴加事先配好的斐林試劑1 mL，沸水浴10 min，觀察試管底部是否有磚紅色沉淀。

1.5 蛞蝓多糖的組成分析[8-9]

樣品a溶液的制備：稱取蛞蝓全蟲1 kg，液料比2∶1 加入蒸餾水進行破壁勻漿，4 000 r/min 低溫離心15 min，棄上層漂浮物和下層沉淀，得粗提液，冷凍干燥得樣品a 溶液。樣品b 溶液的制備：同“1.3項”。樣品酸水解：于20 mL 具塞試管中，分別加入125 mg 樣品a 溶液和樣品b 溶液，后加入10 mL 2 mol/L的硫酸，混勻，置于105 ℃的烘箱水解4 h，冷卻至室溫，加入碳酸鋇中和水解液，然后離心20 min(10 000 r/min)，吸取上清液，過濾，分別得樣品a、b水解液，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩藴侍侨芤旱闹苽洌悍謩e稱取100 mg的L-阿拉伯糖、D-半乳糖、L-鼠李糖、D-核糖、D（+）-無水葡萄糖對照品，加10 mL水，配制成10 mg/mL 的標準單糖溶液。分別吸取0.5 μL 標準糖溶液，3 μL 樣品a、b 水解液點樣于同一硅膠G 薄層板上，以正丁醇—甲醇—氯仿—冰乙酸—蒸餾水（25∶9∶5∶3∶3）作為展開劑展開，取出后待薄層板晾干，噴以苯胺—二苯胺磷酸溶液，105 ℃加熱至斑點清晰，于日光下檢視。

1.6 蛞蝓多糖紅外光譜結(jié)構(gòu)鑒定[6,10]

稱取0.5 mg蛞蝓多糖樣品，與110 mg溴化鉀研磨成粉末，混勻，按照儀器條件進行測定。

1.7 含量測定[11-15]

1.7.1 對照品與供試品的制備 對照品溶液的制備：精密稱取葡萄糖對照品1.0 mg，加蒸餾水定容至10 mL，得濃度為0.1 mg/mL 的葡萄糖對照品溶液。供試品溶液的制備：稱量50 mg蛞蝓多糖，加蒸餾水定容至10 mL，超聲30 min，過濾，量取濾液1 mL，定容至10 mL，備用。

1.7.2 測定波長的選擇 以蒸餾水為空白，取葡萄糖對照品與樣品溶液按標準曲線“1.7.4項”操作，于400～600 nm波長范圍內(nèi)掃描。

1.7.3 顯色條件的考察 6%苯酚用量考察：分別在7個試管內(nèi)加入對照品1.0 mL，逐管加入6%苯酚溶液0.6 mL、0.8 mL、0.9 mL、1.0 mL、1.1 mL、1.3 mL，搖勻，迅速加入5 mL 濃硫酸，沸水浴15 min，冷卻，測定波長485 nm處的吸光度值。濃硫酸用量考察：分別在5 個試管內(nèi)加入對照品1.0 mL、6%苯酚溶液1.0 mL，搖勻，逐管迅速加入濃硫酸3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL、6.0 mL、7.0 mL，沸水浴15 min，冷卻，測定波長485 nm 處的吸光度值。水浴溫度考察：分別在5 個試管內(nèi)加入對照品溶液1.0 mL、6%苯酚溶液1.0 mL，搖勻，迅速加入濃硫酸5.0 mL，分別于水溫為25 ℃、40 ℃、60 ℃、80 ℃、100 ℃條件下反應(yīng)15 min，冷卻，測定最大波長485 nm 處的吸光度值。顯色時間的考察：分別在4 個試管內(nèi)加入對照品溶液1.0 mL、6%苯酚溶液1.0 mL，搖勻，迅速加入濃硫酸5.0 mL，分別于沸水反應(yīng)15 min、30 min、45 min、60 min，冷卻，測定485 nm處的吸光度值。

1.7.4 標準曲線的制備 精密吸取葡萄糖對照品0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL、0.7 mL、0.8 mL、0.9 mL、1.0 mL，用蒸餾水補足體積至1 mL，加入6%苯酚溶液1 mL，搖勻，迅速精密量取5 mL 濃硫酸滴加入試管，沸水浴15 min，冷卻。測定波長485 nm處的吸光度值。

1.7.5 方法學(xué)考察 穩(wěn)定性試驗：取一份蛞蝓多糖，同“1.7.1 項”法制備供試品，分別于0 min、30 min、60 min、90 min、120 min 同“1.7.4 項”法測定波長485 nm 處吸光度值，并計算RSD 值。重復(fù)性試驗：取6份同一批次蛞蝓多糖，同“1.7.1項”法制備供試品，同“1.7.4 項”法測定485 nm 波長處的吸光度，并計算RSD 值。精密度試驗：精密稱定50 mg蛞蝓多糖，同“1.7.1 項”法制備供試品，同“1.7.4 項”法在485 nm波長處連續(xù)重復(fù)測定6次吸光度值，并計算RSD 值。加樣回收率：按表2 精密稱取6 份已知多糖含量的蛞蝓多糖，同“1.7.1項”法制備成供試品溶液，分別按表2加入不同含量的葡萄糖標準品，同“1.7.4項”法測定485 nm波長處的吸光度，根據(jù)吸光度值，計算得平均回收率。

1.7.6 蛞蝓多糖含量測定 取1 mL 供試品溶液，同“1.7.4項”法在485 nm波長處測定吸光度，根據(jù)吸光度值計算以葡萄糖計的多糖百分含量。

2 結(jié)果

2.1 蛞蝓性狀鑒別與顯微鑒別

蛞蝓呈長梭狀，兩頭小，中間大，體長30～55 mm，體寬6～12 mm；體表呈灰褐色，同時伴有零星又細小的褐色斑點，體表光滑有黏液；頭部有兩對觸角，前端一對各有眼一個，后端一對較長，觸角可以自由伸縮；其右側(cè)附近有橢圓形生殖孔，氣腥味咸，見圖1。通過顯微鏡對蛞蝓橫切面組織形態(tài)進行觀察，可以看到蛞蝓最外層為表皮組織，緊貼著是大量的粘液腔，還有大而散列的消化腔，泄殖腔器官明顯，見圖2。

圖1 蛞蝓外觀圖

圖2 蛞蝓HE染色圖（×200）

2.2 蛞蝓多糖的鑒定試驗

蒸餾水的Molish 反應(yīng)雖然有分層，但無紫環(huán)，而蛞蝓多糖液面交界處有清晰可見的紫環(huán)；蛞蝓多糖的斐林反應(yīng)有明顯有磚紅色沉淀，而蒸餾水的斐林反應(yīng)呈現(xiàn)與斐林試劑相同的顏色，無沉淀，提示提取物是含有還原糖的多糖，見圖3。

圖3 蛞蝓多糖的鑒定試驗

2.3 蛞蝓多糖的組成分析

通過薄層色譜分析蛞蝓多糖的單糖成分，觀察到蛞蝓多糖主要由葡萄糖和半乳糖組成，見圖4、表1。

表1 蛞蝓多糖水解物和標準單糖的Rf值

圖4 蛞蝓多糖薄層色譜圖

2.4 蛞蝓多糖紅外光譜結(jié)構(gòu)鑒定

該樣品在4 000.00～600.00 cm-1區(qū)域內(nèi)具有多糖類物質(zhì)的一般特征。3 420.17 cm-1附近的強吸收峰是糖分子中—OH 的伸縮振動吸收峰；2 961.37 cm-1和2 930.63 cm-1分別為C—H 的2 個伸縮振動吸收峰；1 648.05 cm-1處的強吸收峰說明蛞蝓多糖含有糖醛酸；1 545.63 cm-1處出現(xiàn)振動吸收是N—H鍵的彎曲振動；1 401.23 cm-1處吸收峰為=CH2的變形吸收峰；1 385.24 cm-1處的吸收峰是C—H 變角振動峰；1 240.15 cm-1處吸收峰是C—O 伸縮振動峰；在1 077.69 cm-1處的吸收峰是吡喃糖環(huán)羥基的變角振動吸收峰；929.12 cm-1處吸收峰說明含有α和β-吡喃環(huán)型糖苷鍵，見圖5。以上結(jié)果表明，蛞蝓多糖是含有吡喃環(huán)型糖苷鍵和酰胺鍵的酸性多糖。

圖5 蛞蝓多糖紅外光譜圖

2.5 含量測定

樣品和對照液的最大吸收波長均為485 nm，因此本次試驗選擇485 nm為測定波長，見圖6。隨著6%苯酚的用量增加，吸光度值先升高后降低，當(dāng)6%苯酚用量為1.0 mL 時，吸光度達到峰值，因此，本次實驗6%苯酚的用量為1.0 mL；隨著濃硫酸的用量增加，吸光度值先升高后降低，當(dāng)濃硫酸用量為5.0 mL 時，吸光度達到峰值，因此，本次實驗濃硫酸選擇的用量5.0 mL；在40～80 ℃的吸光度值變化趨于平緩，在100 ℃時，吸光值達到峰值，故本次實驗選擇的水浴溫度為100 ℃；隨著反應(yīng)時間的延長，吸光度值呈下降趨勢，故本次實驗選擇的沸水浴反應(yīng)時間為15 min，見圖7。以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線，得線性回歸方程式A=0.0104C-0.0305（R2=0.9994）。在方法學(xué)考察中，穩(wěn)定性試驗RSD 值為0.10%（n=6），重復(fù)性試驗RSD值為1.75%（n=6），精密度試驗RSD 值為0.08%（n=6），加樣回收率為98.70%，RSD為1.13%（表2）。以葡萄糖計蛞蝓多糖的平均含量為18.47%。

表2 加樣回收試驗結(jié)果n=6

圖6 葡萄糖對照品與樣品的波長掃描圖

圖7 顯色條件的考察

3 討論

在進行多糖的鑒別實驗前，先對蛞蝓藥材進行性狀鑒別，顯微鑒別，保證藥材的可靠性。多糖的常用鑒別方法有Molish 和斐林反應(yīng)。Molish 反應(yīng)雖不具有專屬性，但可鑒別藥品中是否含有糖類，斐林反應(yīng)可以鑒別藥品中是否含有還原糖，根據(jù)實驗結(jié)果得知提取物含有還原糖的多糖。薄層色譜實驗過程中，為了尋找合適的鑒別條件，實驗前期對展開系統(tǒng)、展開距離、耐用性進行了考察，最終確定展開條件為：展開劑為正丁醇—甲醇—氯仿—冰乙酸—蒸餾水（25∶9∶5∶3∶3）；上行展開距離為8 cm，選擇硅膠G板為薄層板、苯胺—二苯胺磷酸為顯色劑，日光下檢視，25 ℃條件下跑板。在多糖的水解實驗前期探索了氫氧化鈉，強氧化鋇，碳酸鋇的中和效果，發(fā)現(xiàn)碳酸中和得到的斑點比較集中清晰。用碳酸鋇中和水解液，容易降低單糖的濃度，只有含量高的單糖斑點易顯現(xiàn)出來，為了避免這種情況發(fā)生，本次實驗選擇了2 種樣品水解液進行多糖組成成分分析，最終確定蛞蝓多糖主要由半乳糖和葡萄糖組成。紅外光譜技術(shù)在中藥的鑒別中非常重要，本研究通過傅里葉紅外光譜儀檢測，證實提取物質(zhì)含有吡喃環(huán)型糖苷鍵和酰胺鍵的酸性多糖。在測定多糖含量前期，已經(jīng)對6%苯酚的用量，硫酸的用量，反應(yīng)溫度，顯色時間進行考察，最終得出6%苯酚用量為1 mL，濃硫酸用量為5 mL，顯色時間為15 min，顯色溫度為100 ℃為最佳反應(yīng)條件。選擇苯酚—硫酸法測定蛞蝓多糖含量，因為該法簡便，且重復(fù)性、穩(wěn)定性良好。

本研究先用觀察法、HE 染色法對蛞蝓藥材進行鑒別，再用molish 反應(yīng)、斐林反應(yīng)、薄層色譜法，傅里葉變換紅外光譜法和苯酚—硫酸法對蛞蝓多糖進行鑒別、組成、結(jié)構(gòu)和含量測定，可為將來研究蛞蝓多糖的結(jié)構(gòu)以及藥理作用提供參考。