長鏈非編碼RNA同源盒基因 A11反義RNA在急性淋巴細胞白血病患兒骨髓中的表達及意義

白東琴，白玉，田富香

延安市人民醫(yī)院兒內(nèi)科，陜西 延安 716000

急性淋巴細胞白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）是血液系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，起源于造血干細胞和造血祖細胞，其特征為未成熟的白細胞大量聚集在血液、骨髓、淋巴結(jié)、脾臟及其他器官。人

ABL

基因位于9號染色體長臂，9號染色體長臂上

C-ABL

原癌基因易位至22號染色體長臂的斷裂點集中區(qū)（BCR），形成

BCR/ABL

融合基因。兒童ALL約占兒童急性白血病的80%，一般經(jīng)過規(guī)范化治療，患兒的長期生存率為70%～80%，但ALL的復發(fā)率高，且一旦復發(fā)疾病進展快，病死率高。目前普遍認為，遺傳因素、環(huán)境影響、基因改變可能是導致ALL發(fā)生的危險因素，但尚不清楚ALL的確切病因及發(fā)病機制。因此，尋找潛在的治療靶點成為當前ALL的研究熱點。長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）是一類不編碼蛋白質(zhì)RNA，其長度超過200個核苷酸。研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA的異常表達不僅可導致多種實體瘤，還也與白血病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。lncRNA同源盒基因A11反義RNA（lncRNA homeobox A11 antisense RNA，HOXA11-AS）是一種位于染色體7p15.2上的新型lncRNA。研究顯示，lncRNA HOXA11-AS與多種惡性腫瘤有關(guān)，但尚無與急性淋巴細胞白血病的研究報道。本研究探討HOXA11-AS在ALL患兒骨髓中的表達及意義，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年3月至2021年3月延安市人民醫(yī)院收治的初治ALL患兒。納入標準：均經(jīng)骨髓細胞學、免疫分型檢查、分子生物學及遺傳學檢查確診。排除標準：初診前接受過化療或ALL相關(guān)治療。依據(jù)納入和排除標準，本研究共納入108例初治ALL患兒，其中男66例，女42例；年齡3～12歲，平均（6.27±1.95）歲；病理類型：B淋巴細胞型（BALL）67例，T淋巴細胞型（T-ALL）41例。同期選取本院收治的57例非腫瘤性疾病（血友病、免疫性血小板減少癥等）患兒，其中男34例，女23例；年齡4～12歲，平均（7.01±1.62）歲。三組患兒性別、年齡比較，差異均無統(tǒng)計學意義（

P

＞0.05）。取108例初治ALL患兒的骨髓標本和57例非腫瘤性疾病患兒的骨髓標本。

1.2 治療方法

所有初治ALL患兒均依據(jù)《兒童急性淋巴細胞白血病診療建議（第四次修訂）》中的治療方案進行治療（以化療為主），均接受2個療程的治療，治療結(jié)束后評價患兒的治療效果。

1.3 實驗方法

1.3.1 主要試劑和儀器人淋巴細胞分離液購自北京索萊寶科技有限公司，Trizol試劑購自美國Invitrogen公司，HOXA11-AS引物購自上海生工生物工程股份有限公司，Prime Script逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）試劑盒和SYBR Premix Ex-Taq Ⅱ試劑盒購自日本Takara公司。NanoDrop 2000C超微量分光光度計購自美國Thermo公司，7300型實時聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增儀購自美國ABI公司。

1.3.2 實時RT-PCR法檢測骨髓標本HOXA11-AS的相對表達量 取108例初治ALL和57例非腫瘤性疾病患兒治療前的骨髓液2 ml，乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）抗凝處理，加入等量磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）充分混勻，再加入等量人淋巴細胞分離液，3000 r/min離心10 min，吸取中間層的單個核細胞，轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入PBS洗滌1次后，使用Trizol試劑提取總RNA，應用NanoDrop 2000C超微量分光光度計檢測RNA濃度和質(zhì)量。根據(jù)Prime ScriptRT-PCR試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄成互補DNA（complementary DNA，cDNA），反應過程：42℃15 min，85℃10 s，然后參照SYBR Premix Ex-Taq Ⅱ試劑盒說明書進行RT-PCR反應，反應總體積為20μl，其中包含3μl稀釋和預擴增的cDNA、上下游引物各0.25 μl，10 μl SYBR預混料ExTaq和1μl熒光探針、5.5μl無RNA酶水，反應條件：95℃預反應10 min，然后95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min，共40次循環(huán)。所有樣本均設3個復孔，并計算每個樣本的平均值，以3-磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）為內(nèi)參，使用生物系統(tǒng)軟件RQ Manager v1.2.1處理數(shù)據(jù)，采用2方法計算HOXA11-AS的相對表達量。HOXA11-AS上游引物：5'-GCCACAUGCACCCGCCUGCUGAA-3'，下游引物 ：5'-CAUCAGACACAGUCCACUAUGCG-3'；

GAPDH

上 游引物：5'-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3'；下游引物：5'-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3'。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 HOXA11-AS相對表達量的比較

108例初治ALL患兒骨髓HOXA11-AS的相對表達量為（4.79±1.08），明顯高于非腫瘤性疾病患兒的（1.13±0.38），差異有統(tǒng)計學意義（

t

=24.759，

P

=0.000），其中B-ALL型初治ALL患兒骨髓HOXA11-AS的相對表達量為（4.26±0.93），明顯低于T-ALL型患兒的（5.66±1.33），差異有統(tǒng)計學意義（

t

=6.429，

P

=0.000）。108例初治ALL患兒經(jīng)2個周期的化療后完全緩解46例，未完全緩解62例，完全緩解患兒HOXA11-AS的相對表達量為（1.46±0.35），明顯低于未完全緩解患兒的（3.28±0.94），差異有統(tǒng)計學意義（

t

=3.262，

P

=0.000），且完全緩解和未完全緩解患兒骨髓HOXA11-AS的相對表達量均明顯低于初治ALL患兒的（4.79±1.08），差異有統(tǒng)計學意義（

F

=7.203，

P

=0.000）。

2.2 不同臨床特征初治ALL患兒骨髓HOXA11-AS相對表達量的比較

不同性別、年齡、染色體核型、原始細胞比例、白細胞計數(shù)、血紅蛋白水平、血小板計數(shù)、

WT1

基因表達情況初治ALL患兒骨髓HOXA11-AS相對表達量的比較，差異均無統(tǒng)計學意義（

P

＞0.05）；

BCR/ABL

融合基因陽性表達初治ALL患兒骨髓HOXA11-AS的相對表達量，明顯高于

BCR/ABL

融合基因陰性表達患兒，差異有統(tǒng)計學意義（

P

＜0.01）。（表1）

表1 不同臨床特征初治ALL患兒骨髓HOXA11-AS相對表達量的比較（ n=108）

3 討論

ALL是由于造血干細胞惡性增殖、凋亡受阻導致的原始與幼稚淋巴細胞分化受阻，抑制正常的造血功能，侵犯髓外器官的血液系統(tǒng)常見惡性疾病之一。雖然經(jīng)過規(guī)范化治療，ALL的緩解率較高，但復發(fā)率也較高，且疾病一旦復發(fā)，進展快、病死率極高。因此，探討ALL的發(fā)病機制和耐藥機制對改善ALL的治療效果具有重要意義。

lncRNA曾被認為是“暗物質(zhì)”，但隨著研究的不斷深入，越來越多的證據(jù)表明這些“暗物質(zhì)”具有極為重要的生物學功能。研究顯示，lncRNA的異常表達可導致多種實體瘤，如肺癌、肝癌、乳腺癌、胃癌、胰腺癌等，且lncRNA的異常表達也與白血病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。有研究報道，ALL患者骨髓細胞中存在lncRNA的異常表達，甚至可能導致腫瘤細胞耐藥。有研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA鋅指E-盒結(jié)合同源異形盒1-反義鏈1（zinc finger E-box binding homeobox 1 antisense 1，ZEB1-AS1）在B-ALL型患者骨髓中的表達明顯高于對照組，可與白細胞介素-11結(jié)合，并促進其表達，且高表達ZEB1-AS1的B-ALL型患者的預后更差。另有研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA RP11-137H2.4在ALL患兒中明顯高表達，主要通過促分裂原活化的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）級聯(lián)與細胞周期通路導致糖皮質(zhì)激素耐藥的發(fā)生。

HOXA11-AS是一種位于染色體7p15.2上的新型lncRNA。研究顯示，HOXA11-AS與多種惡性腫瘤有關(guān)，但目前與ALL相關(guān)的研究報道較少。本研究結(jié)果顯示，初治ALL患兒骨髓HOXA11-AS的相對表達量明顯高于非腫瘤性疾病患兒，提示HOXA11-AS過表達可能與ALL的發(fā)生有關(guān)。本研究結(jié)果還顯示，B-ALL型初治ALL患兒骨髓HOXA11-AS的相對表達量明顯低于T-ALL型患兒，提示HOXA11-AS在不同類型的ALL中的表達存在差異。進一步結(jié)合初治ALL患兒的臨床資料分析發(fā)現(xiàn)，不同性別、年齡、染色體核型、原始細胞比例、白細胞計數(shù)、血紅蛋白水平、血小板計數(shù)、

WT1

基因表達情況的初治ALL患兒骨髓HOXA11-AS的相對表達量均無明顯差異（

P

＞0.05），但

BCR/ABL

融合基因陽性表達初治ALL患兒骨髓HOXA11-AS的相對表達量，明顯高于

BCR/ABL

融合基因陰性表達患兒（

P

＜0.01）。本研究結(jié)果還顯示，完全緩解患兒HOXA11-AS的相對表達量，明顯低于未完全緩解組和初治ALL患兒，提示HOXA11-AS的高表達可能與ALL患兒的不良預后有關(guān)，但仍有待進一步擴大樣本量再次證實。綜上所述，HOXA11-AS在初治ALL患兒骨髓中高表達，且在T-ALL型患兒中高表達，化療后完全緩解和

BCR/ABL

融合基因陰性表達的ALL患兒骨髓中HOXA11-AS的相對表達量更低，提示HOXA11-AS可能參與ALL的發(fā)生發(fā)展過程，并與ALL患兒的預后有一定關(guān)系。